SHP-2 (IC50 = 0.07 μM)
Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 11 (SHP2/PTPN11) (binds to the allosteric pocket at the interface of N-terminal SH2, C-terminal SH2, and PTP domains, stabilizing the autoinhibited conformation) [1]
Protein Tyrosine Phosphatase, Non-Receptor Type 11 (SHP2/PTPN11) (IC50 = 0.071 μM, binds to the interface of N-terminal SH2, C-terminal SH2, and PTP domains to exert allosteric inhibition) [2]

体外活性：SHP-099 与 SHP2 复合物的 X 射线共晶揭示了与受体的碱性胺和 Phe113 主链羰基的新相互作用。 SHP099 在 KYSE-520 模型中显示出对细胞增殖的抑制作用，IC50 为 1.4 μM。 SHP099 在 Caco-2 细胞中表现出高溶解度和高渗透性，没有明显的外排。 SHP099 同时结合 N 端 SH2、C 端 SH2 和蛋白酪氨酸磷酸酶结构域的界面，从而通过变构机制抑制 SHP2 活性。 SHP099 抑制 RAS-ERK 信号传导，从而抑制受体酪氨酸激酶驱动的人类癌细胞的增殖。激酶测定：生化测定。 SHP2 通过双酪氨酰磷酸化肽与其 Src 同源 2 (SH2) 结构域结合而被变构激活。后一个激活步骤导致 SHP2 自抑制界面的释放，从而使 SHP2 PTP 具有活性并可用于底物识别和反应催化。使用替代底物 DiFMUP 以即时荧光测定形式监测 SHP2 的催化活性。更具体地说，磷酸酶反应在室温下在 384 孔黑色聚苯乙烯板、平底、低凸缘、非结合表面（康宁，目录号 3575）中进行，最终反应体积为 25 μL，并采用以下测定缓冲液条件：60 mM HEPES，pH 7.2，75 mM NaCl，75 mM KCl，1 mM EDTA，0.05% P-20，5 mM DTT。使用一种测定法监测测试化合物（浓度范围为 0.003 – 100 μM）对 SHP2 的抑制，其中 0.5 nM 的 SHP2 与 0.5 μM 的肽 IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222（序列：H2NLN(pY)IDLDLV( dPEG8)LST(pY)ASINFQK-酰胺)。在 25 oC 下孵育 30-60 分钟后，将替代底物 DiFMUP（Invitrogen，目录号 D6567，200 μM）添加到反应中，并在 25 oC 下孵育 30 分钟（2-593 为 200 μM，1-593 为 100 μM）。 525 构造）。然后通过添加 5 μL 160 μM bpV(Phen) 溶液（Enzo Life Sciences 目录号 ALX-270-204）猝灭反应。使用酶标仪（Envision，Perki-Elmer）监测荧光信号，激发波长和发射波长分别为 340 nm 和 450 nm。使用归一化IC50回归曲线拟合与基于对照的归一化来分析抑制剂剂量反应曲线。细胞测定：使用 AlphaScreen® SureFire™ Phospho-ERK 1/2 试剂盒 (PerkinElmer) 进行 p-ERK 细胞测定：KYSE-520 细胞（30,000 个细胞/孔）在 96 孔板培养物中生长过夜，并在 30 ℃下用 SHP2 抑制剂处理。浓度为 20、6.6、2.2、0.74、0.24、0.08、0.027 μM，37 °C 2 小时。通过添加由 SureFire 磷酸细胞外信号调节激酶 (p-ERK) 测定试剂盒 (PerkinElmer) 提供的 30 μL 裂解缓冲液 (PerkinElmer) 终止孵育。样品根据制造商的指示进行处理。使用 2101 多标记读数器 (Perkin Elmer Envision) 重复测量 p-ERK 的荧光信号。抑制百分比通过总 ERK 信号标准化并与 DMSO 载体对照进行比较。

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1. SHP099 HCl（文献中简称SHP099）是SHP2的变构调节剂。通过高通量筛选，它被鉴定为具有开发潜力的SHP2抑制化学实体。X射线晶体学证实其结合于SHP2一个此前未被发现的变构口袋，基于结构的药物设计优化了它与SHP2的相互作用，鉴定出多个新的蛋白-配体相互作用，从而增强其抑制效力。后续评估显示其对SHP2具有高选择性，且具备口服生物利用度[1]
2. SHP099 HCl（文献中简称SHP099）对SHP2具有高 potency，IC50为0.071 μM。它可同时结合于SHP2的N端SH2、C端SH2与PTP结构域界面，使蛋白稳定在自抑制构象，通过变构机制抑制SHP2活性。在受体酪氨酸激酶（RTK）驱动的人类癌细胞系中，它可抑制RAS–ERK信号通路的激活，进而显著抑制癌细胞增殖[2]

SHP099 在异种移植模型中表现出剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用。单剂量 30 和 100 mg/kg 后，在异种移植物中观察到药效标记物 p-ERK 的剂量依赖性暴露和调节。每日口服剂量 10 或 30 mg/kg 分别可抑制 19% 和 61% 的肿瘤生长。 100 mg/kg 即可实现肿瘤停滞。所有动物研究均根据诺华实验动物护理和使用指南进行。将雌性裸鼠皮下接种（3 x 106 个细胞）于汉克平衡盐溶液中含有 50% 无酚红基质胶（BD Biosciences）的悬浮液中，并与亲本 KYSE-520 细胞一起接种。对于 PK/PD 研究，一旦肿瘤达到大约 500 mm3，小鼠就被给予单剂量的载体对照或通过口服强饲法给予 1 剂。随后在单剂量化合物后的预定时间点对小鼠实施安乐死，此时收集血浆和异种移植物碎片分别用于测定1浓度和p-ERK调节。为了进行功效研究，每周两次对小鼠进行二维测径。一旦肿瘤达到大约 200 mm3，小鼠就被随机分配到治疗组。对于功效研究，小鼠被分配接受媒介物1（10、30或100 mg/kg，每日一次）或厄洛替尼（80 mg/kg，每日一次）口服灌胃。每周两次评估肿瘤体积和小鼠体重。为了评估异种移植蛋白裂解物中的 MAPK 途径调节，使用市售试剂盒（Meso Scale Discovery 目录号 K15107D）评估了总 ERK1/2 和磷酸 ERK1/2。该测定按照 Meso Scale Discovery 的建议进行，不同之处在于蛋白质裂解物需要孵育过夜。

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1. SHP099 HCl（文献中简称SHP099）在小鼠肿瘤异种移植模型中展现出药效。对荷有RTK驱动人类癌细胞异种移植瘤的裸鼠给药后，它可通过抑制肿瘤组织中的RAS–ERK信号通路，实现肿瘤生长抑制，证实其体内抗肿瘤活性[2]

生化测定。双酪氨酰磷酸化肽与 SHP2 的 Src 同源 2 (SH2) 结构域的结合会导致蛋白质的变构激活。在后一个激活步骤中，SHP2 的自抑制界面的释放使 SHP2 PTP 具有活性，并为底物识别和反应催化做好准备。替代底物 DiFMUP 用于即时荧光测定形式，以追踪 SHP2 的催化活性。磷酸酶反应在室温下在具有平底、低凸缘和非结合表面的 384 孔黑色聚苯乙烯板（Corning，目录号 3575）中进行。最终反应体积为 25 μL，测定缓冲液条件如下：pH 7.2、75 mM NaCl、75 mM KCl、1 mM EDTA、0.05% P-20 和 5 mM DTT 均存在于 60 mM 中赫佩斯。使用将 0.5 nM SHP2 与 0.5 μM 肽 IRS1_pY1172(dPEG8)pY1222（序列：H2NLN(pY)IDLDLV(dPEG8)LST(pY)ASINFQK-amide）一起孵育的测定，测试化合物的抑制效果（浓度范围观察到从 0.003 – 100 μM）。添加替代底物 DiFMUP（Invitrogen，目录号 D6567，200 μM）后，将反应物在 25 oC 下孵育 30 分钟（2-593 为 200 μM，1-525 构建体为 100 μM）。下一步涉及添加 5 μL 160 μM bpV(Phen) 溶液（Enzo Life Sciences 目录号 ALX-270-204）以淬灭反应。在激发和发射波长分别为 340 nm 和 450 nm 时，使用酶标仪（Envision，Perki-Elmer）观察荧光信号。使用基于对照的归一化拟合的归一化 IC50 回归曲线来分析抑制剂剂量反应曲线。

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1. 高通量筛选实验：对大型小分子化合物库进行筛选，以鉴定可抑制SHP2活性的化合物。实验使用重组SHP2蛋白，通过合适的底物检测SHP2的磷酸酶活性。筛选出可降低SHP2磷酸酶活性的候选化合物，SHP099 HCl（SHP099）从这些候选物中被鉴定为潜在活性分子[1]
2. 结合位点鉴定的X射线晶体学实验：将重组SHP2蛋白与SHP099 HCl（SHP099）孵育形成蛋白-配体复合物，随后对复合物进行结晶并收集X射线衍射数据。通过衍射数据分析，明确SHP099 HCl结合于SHP2的N端SH2、C端SH2与PTP结构域界面处，证实该变构口袋的存在[1]
3. SHP2磷酸酶活性抑制实验：将重组SHP2蛋白与不同浓度的SHP099 HCl（SHP099）及特定磷酸肽底物混合，在优化的缓冲条件下启动反应。通过检测方法（如荧光或吸光度法）测定去磷酸化产物的生成量，计算SHP2的磷酸酶活性。通过拟合活性抑制的剂量-反应曲线，确定SHP099 HCl对SHP2的IC50为0.071 μM[2]

在 96 孔板培养中，KYSE-520 细胞（30,000 个细胞/孔）生长过夜，然后在 37°C 下用浓度为 20、6.6、2.2、0.74、0.24、0.08 和 0.08 的 SHP2 抑制剂处理两小时。 0.027μM。添加 SureFire p-ERK 检测试剂盒附带的 30 μL 裂解缓冲液以结束孵育。

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1. RTK驱动癌细胞增殖实验：将具有激活型RTK信号的人类癌细胞系（如携带RTK突变的肺癌或乳腺癌细胞系）接种于培养板。细胞贴壁后，用不同浓度的SHP099 HCl（SHP099）处理，并培养特定时间（如48–72小时）。使用细胞计数试剂盒或比色法（如MTT法）检测细胞活力，通过计算各浓度下的生长抑制率，评估SHP099 HCl对细胞增殖的抑制作用[2]
2. 信号通路检测的Western blot实验：收集经SHP099 HCl（SHP099）处理的RTK驱动癌细胞，裂解后提取总蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白并转移至膜上，用针对RAS–ERK信号通路关键蛋白（如磷酸化ERK、总ERK）的一抗和二抗孵育膜。采用化学发光检测定量磷酸化蛋白的表达水平，证实SHP099 HCl可抑制RAS–ERK通路的激活[2]

10, 30, or 100 mg/kg qd by oral gavage.
Female nude mice were inoculated subcutaneously (3 x 106 cells) in a suspension containing 50% phenol red-free matrigel (BD Biosciences) in Hank’s balanced salt solution with parental KYSE-520 cells.

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1. Mouse tumor xenograft model establishment and treatment: Nude mice (both male and female) were subcutaneously injected with RTK-driven human cancer cells to establish tumor xenograft models. When tumors reached a specific volume (e.g., 100–200 mm³), the mice were randomly divided into treatment and control groups. SHP099 HCl (SHP099) was formulated in a suitable vehicle (e.g., aqueous solution with solubilizers or organic solvent mixtures, specific formulation not detailed) and administered orally at a predetermined frequency (e.g., once or twice daily, specific frequency not detailed). Tumor volume and mouse body weight were measured regularly (e.g., every 2–3 days) for the duration of the experiment (e.g., 2–3 weeks). At the end of the experiment, tumors were excised for further analysis (e.g., western blot to detect RAS–ERK pathway activity) [2]

1. SHP099 HCl (referred to as SHP099 in the literature) is characterized as orally bioavailable. However, specific ADME parameters such as absorption rate, distribution volume, metabolism pathways, excretion route, half-life (t1/2), Cmax (maximum plasma concentration), and AUC (area under the plasma concentration-time curve) are not provided [1]
2. SHP099 HCl (referred to as SHP099 in the literature) exhibits oral bioavailability, which was confirmed in in vivo studies. [2]

[1]. J Med Chem . 2016 Sep 8;59(17):7773-82.

[2]. Nature . 2016 Jul 7;535(7610):148-52.

1. SHP2, encoded by the PTPN11 gene, is a nonreceptor protein tyrosine phosphatase involved in cell growth and differentiation via the MAPK signaling pathway and plays a role in the programmed cell death (PD-1/PD-L1) pathway. As an oncoprotein associated with multiple cancers and a potential immunomodulator, targeting SHP2 is of significant therapeutic interest. SHP099 HCl (SHP099) was developed through high-throughput screening and structure-based drug design, representing a potent and selective allosteric inhibitor of SHP2 [1]
2. SHP2 is the first reported oncogenic tyrosine phosphatase; activating mutations of SHP2 are associated with developmental disorders (e.g., Noonan syndrome) and multiple cancers (leukemia, lung cancer, breast cancer, neuroblastoma). It regulates cell survival and proliferation mainly via the RAS–ERK pathway and mediates the PD-1/BTLA immune checkpoint pathways. SHP099 HCl (SHP099) inhibits SHP2 activity to suppress tumor cell growth, validating pharmacological inhibition of SHP2 as a promising therapeutic strategy for cancer treatment [2]

C16H19CL2N5.HCL

388.72

387.078

C, 49.44; H, 5.19; Cl, 27.36; N, 18.02

1801747-11-4

SHP099;1801747-42-1;SHP099 monohydrochloride;2200214-93-1

121241170

Yellow solid powder

81.1Ų

3

5

2

24

402

0

ClC1C(=C([H])C([H])=C([H])C=1C1C(N([H])[H])=NC(=C([H])N=1)N1C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])C1([H])[H])N([H])[H])Cl.Cl[H]

KHQHYRFUYAXWOQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H19Cl2N5.ClH/c1-16(20)5-7-23(8-6-16)12-9-21-14(15(19)22-12)10-3-2-4-11(17)13(10)18;/h2-4,9H,5-8,20H2,1H3,(H2,19,22);1H

6-(4-amino-4-methylpiperidin-1-yl)-3-(2,3-dichlorophenyl)pyrazin-2-amine;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。