SMER3

别名: SMER3 SMER 3 SMER-3 9H-茚并[1,2-e][1,2,5]噁二唑o[3,4-b]吡嗪-9-酮;9H-茚并[1,2-b][1,2,5]恶二唑并[3,4-e]吡嗪-9-酮

目录号: V5826 纯度: ≥98%

COA 产品数据产品说明书 SDS

SMER3 是一种雷帕霉素增强剂，是一种选择性 Skp1-Cullin-F-box (SCF)Met30 泛素连接酶抑制剂。

SMER3 CAS号: 67200-34-4
产品类别: New1

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Nature 2025, 643(8070):192-200.

Nature 2024 Dec 18.

Nature 2021, 597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022: 8, eabm9427.

Nat Neurosci 2024, 27:1468-1474.

Science Adv 2025, 11(33):eadr5199.

Nat Metab 2024, 6: 1108-1127.

Cell Stem Cell 2024, 31:106-126.e13.

Nature 597, 119–125 (2021)

Cell Stem Cell 2020,26(6):845-861.e12.

Science Trans Med 2023,15(701):eadd7872.

STTT 2023,8(1):91.

Cell Reports 2023,42(4):112313

Science Trans Med 2023, 15: eadd7872.

Cancer Cell 2021,39(4):529-547.e7.

Cancer Discov 2022,12(4):1106-1127.

Immunity 2023,56(3):620-634.e11.

Immunity 2024,57:2651-2668.e12.

J Am Chem Soc 2022,144:21831-21836.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022:8,eabm9427.

Nature 2021,597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

PNAS Nexus 2022,1(3):pgac063.

ACS Nano 2023,17(10):9110-9125.

Biomaterial 2023 Sep16:302:122333.

产品描述
生物活性&实验参考方法
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产品描述

SMER3 是一种雷帕霉素增强剂，也是一种选择性 Skp1-Cullin-F-box (SCF)Met30 泛素连接酶抑制剂。SMER3 通过抑制 SCFMet30 来增强雷帕霉素的生长抑制活性。

生物活性&实验参考方法

靶点	SMER3 specifically inhibits the yeast E3 ubiquitin ligase SCF^Met30. It disrupts the interaction between the F-box protein Met30 and the SCF core component Skp1, thereby preventing the assembly or promoting the disassembly of the SCF^Met30 complex. The compound shows high selectivity over the closely related SCF^Cdc4 ligase.[1]
体外研究 (In Vitro)	当酵母细胞暴露于 SMER3（0-60 μM）时，Met4 的泛素化受到抑制。SMER3 可以减轻 met4Δ 细胞的生长抑制 [1]。在连接酶过程中添加 SMER3 可以剂量依赖性地降低 SCFMet30 介导的 Met4 泛素化。SMER3 不改变 Skp1 或 Met30 蛋白的含量，但能强烈抑制 Met30 与 Skp1 的结合 [1]。在一项基于酵母的高通量筛选中，利用包含 30,000 个化合物的 ChemBridge DiverSet 化合物库，SMER3 被鉴定为雷帕霉素 (SMER) 的小分子增强剂。在亚最佳浓度的雷帕霉素存在下，该化合物表现出合成致病性/致死性，可抑制酵母细胞生长，但在测试浓度下单独使用时毒性很小。[1] 用SMER3（30 µM，30 分钟）处理酵母细胞，导致 Met30 与 Skp1 解离，这已通过共免疫沉淀实验证实。[1] 在定量质谱（SILAC）分析中，用 20 µM SMER3 处理表达 HBTH 标签 Skp1 的酵母细胞 30 分钟，特异性地降低了 Skp1 结合复合物中 Met30 的丰度，但未降低其他已鉴定的 F-box 蛋白的丰度。[1] 用 SMER3 处理（6 小时）诱导酵母细胞周期阻滞表型，该表型类似于 Met30 基因抑制的表型，但与诱导的表型不同。通过抑制 Cdc4 或一般 SCF 核心成分。[1] MET4 基因（SCF^Met30 下游的转录激活因子）的缺失，在液体培养生长曲线分析中，赋予了细胞对 4 µM SMER3 生长抑制作用的部分抵抗力。[1]
酶活实验	体外泛素化实验：在昆虫细胞中共表达SCF^Met30复合物的各组分，并使用与Skp1融合的GST标签进行纯化。Met4底物与该复合物结合并进行共纯化。类似地，SCF^Cdc4复合物及其磷酸化底物Sic1也进行了纯化。将纯化的SCF^Met30和SCF^Cdc4连接酶-底物复合物混合，并在室温下与DMSO或指定浓度的SMER3预孵育20分钟。加入E1酶、E2酶（Cdc34）、泛素和ATP启动泛素化反应。反应进行25分钟，并在5分钟时取样，以补偿SCF^Cdc4的较快动力学。反应产物通过免疫印迹法进行分析。SMER3以剂量依赖的方式抑制SCF^Met30介导的Met4泛素化，但对SCF^Cdc4介导的Sic1泛素化没有显著影响。[1] 差示扫描荧光法（DSF）：从昆虫细胞中纯化Met30-Skp1复合物和单独的Skp1。将蛋白质与SMER3和Sypro Orange染料混合于384孔板中。使用PCR仪监测温度升高过程中的荧光信号。分析熔解温度（Tm）的变化。 SMER3改变了Met30-Skp1复合物的Tm值，但并未改变Skp1的Tm值，表明SMER3直接与该复合物结合。[1] 药物亲和力响应靶标稳定性(DARTS)：将含有内源性Met30-RGS6H的酵母细胞裂解液与SMER3或DMSO对照孵育，随后用嗜热蛋白酶消化。通过免疫印迹分析蛋白水解程度。SMER3保护Met30免受蛋白酶消化，表明药物结合后Met30稳定。体外转录/翻译产生的重组Met30 F-box结构域也观察到类似的保护作用。[1]
细胞实验	酵母生长抑制及与雷帕霉素的协同作用：酵母细胞在标准培养基中培养。在初筛中，细胞用亚最佳浓度的雷帕霉素以及化合物库中的化合物处理。生长情况通过目测或分光光度法进行评估。SMER3被鉴定为一种仅在雷帕霉素存在下才能引起“不生长”表型的化合物。[1] 生长曲线分析：酵母细胞（野生型或met4Δ突变体）在液体培养基中用4 µM SMER3或DMSO溶剂处理。每隔 30 分钟自动测量细胞密度 (OD₅₉₅)，以生成生长曲线。[1] 基因互作点滴分析：将温度敏感型酵母突变体（例如 met30-6、cdc4-3、cdc53-1、skp1-25）在容许温度 (25°C) 下培养至对数生长期中期。将细胞进行系列稀释后点涂于含或不含 2.5 nM 雷帕霉素的琼脂平板上。将平板在容许温度（28°C 或 30°C，取决于突变体）下孵育，以评估生长敏感性。[1] Met4 体内泛素化：将酵母细胞培养至对数生长期中期 (0.8 x 10⁷ 个细胞/mL)，并用指定浓度的 SMER3 或雷帕霉素处理 45 分钟。提取总蛋白，并使用抗Met4抗体进行Western blot分析。由于蛋白酶体降解减少，Met4的泛素化形式呈现为较高分子量的条带。[1] 蛋白质-蛋白质相互作用的共免疫沉淀：将表达内源性13Myc标签Met30的酵母菌株用30 µM SMER3或DMSO在30°C下处理30分钟。裂解细胞，并进行13Myc-Met30的免疫沉淀。通过蛋白质印迹法分析免疫复合物中Skp1的存在。[1] 基于SILAC的定量质谱分析：将表达内源性HBTH标签Skp1的酵母菌株分别培养于含有精氨酸和赖氨酸“重”同位素（¹³C/¹⁵N）或“轻”同位素（¹²C/¹⁴N）的两种培养基中。重同位素培养基用DMSO处理，轻同位素培养基用20 µM SMER3处理，于30°C孵育30分钟。然后用1%甲醛交联细胞10分钟。在变性条件下（8M尿素）制备细胞裂解液，等量混合，并在变性条件下使用镍柱和链霉亲和素柱依次纯化HBTH-Skp1结合复合物。纯化的复合物经胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS分析肽段。通过比较轻（SMER3处理）和重（DMSO处理）样品中肽段峰强度来确定相对蛋白丰度。[1] 细胞周期阻滞形态分析：将温度敏感突变体转移至限制温度（37°C）下培养4小时。为抑制Skp1表达，在葡萄糖培养基中培养12小时。为药物处理，用SMER3处理细胞6小时。然后用显微镜观察细胞形态。[1]
毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK)	在最初的酵母筛选中，在所用浓度下，SMER3 本身毒性很小，但与雷帕霉素联合使用时表现出合成致病性/致死性。[1]
参考文献	[1]. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nat Biotechnol. 2010 Jul;28(7):738-42.
其他信息	LSM-42773 是一种芳香酮。 SMER3 是在酵母中进行的基于表型的无偏化学遗传筛选中发现的，它是一种“雷帕霉素小分子增强剂”（SMER）。它建立了 TOR 信号通路与 SCF^Met30 介导的含硫氨基酸感知/代谢网络之间的功能联系。该研究表明，尽管 SCF 泛素连接酶复合物的结构相似，但开发针对特定 SCF 泛素连接酶复合物的特异性抑制剂是可行的。SMER3 是研究 SCF 生物学的第一代化学工具，并为与雷帕霉素联合治疗癌症等疾病提供了潜在策略，但其在哺乳动物中的直接靶点和治疗潜力仍需进一步阐明。[1]

*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性

化学信息 & 存储运输条件

分子式	C11H4N4O2
分子量	224.17
精确质量	224.033
CAS号	67200-34-4
PubChem CID	568763
外观&性状	Light yellow to green yellow solid powder
密度	1.7±0.1 g/cm3
沸点	437.2±55.0 °C at 760 mmHg
熔点	296 °C(dec.)
闪点	218.2±31.5 °C
蒸汽压	0.0±1.0 mmHg at 25°C
折射率	1.779
LogP	0.9
tPSA	81.77
氢键供体(HBD)数目	0
氢键受体(HBA)数目	6
可旋转键数目(RBC)	0
重原子数目	17
分子复杂度/Complexity	350
定义原子立体中心数目	0
InChi Key	SFSSAKVWCKFRHE-UHFFFAOYSA-N
InChi Code	InChI=1S/C11H4N4O2/c16-9-6-4-2-1-3-5(6)7-8(9)13-11-10(12-7)14-17-15-11/h1-4H
化学名	13-oxa-10,12,14,16-tetrazatetracyclo[7.7.0.02,7.011,15]hexadeca-1(16),2,4,6,9,11,14-heptaen-8-one
别名	SMER3 SMER 3 SMER-3
HS Tariff Code	2934.99.9001
存储方式	Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month
运输条件	Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

溶解度数据

溶解度 (体外实验)	DMSO : ~12.5 mg/mL (~55.76 mM)
溶解度 (体内实验)	配方 1 中的溶解度: 1.25 mg/mL (5.58 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

溶解度 (体外实验)

DMSO : ~12.5 mg/mL (~55.76 mM)

溶解度 (体内实验)

配方 1 中的溶解度: 1.25 mg/mL (5.58 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

制备储备液		1 mg	5 mg	10 mg
	1 mM	4.4609 mL	22.3045 mL	44.6090 mL
	5 mM	0.8922 mL	4.4609 mL	8.9218 mL
	10 mM	0.4461 mL	2.2305 mL	4.4609 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器

质量

浓度

体积

分子量*

计算重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度

参见示例

使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？

在分子量（MW）框中输入350.26
在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。

浓度 (起始)

体积 (起始)

浓度 (终)

体积 (终)

计算重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：

在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中

分子式

分子量

g/mol

计算重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4 c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：

要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。

分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：

分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。

配液体积

质量

配液浓度

计算重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
单击“计算”按钮
答案显示在体积框中

动物体内实验配方计算器（澄清溶液）

第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）

给药剂量 mg/kg

动物平均体重 g

每只动物给药体积 μL

动物数量

第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。

% DMSO

% Tween 80

% ddH₂O

计算重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH₂O，混匀澄清。

注意： (1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

生物数据图片

Two unsupervised data analyses classify five SMERs into three different groups based on their gene expression profiles a, Chemical structures of SMER1 to SMER5. b, Two dimensional (2-D) hierarchical clustering reveals that the expression profile of SMER1 is similar to that of rapamycin, whereas the profiles of SMERs 2, 4 and 5 are indistinguishable from that of DMSO (solvent) control. The profile of SMER3 is distinct. Each row corresponds to a gene, and each column corresponds to an experimental sample. c, Principal component analysis is consistent with hierarchical clustering. Light blue: DMSO; blue: SMER1; cyan: SMER2; red: SMER3; sage: SMER4; chartreuse: SMER5; green: rapamycin. Replicates were obtained from independent small molecule treatments in separate experiments.[1].Mariam Aghajan, et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nat Biotechnol. 2010 Jul;28(7):738-42.

SMER3 targets SCFMet30 a, Biochemical evidence for SCFMet30 inhibition by SMER3 but not rapamycin. Yeast cells were cultured in YPDA medium to mid-log 0.8×107 cells/ml, treated with indicated concentrations of SMER3 or rapamycin for 45 min, and total protein was extracted for Western blot analyses (Supplementary Information). Met4 ubiquitination in vivo can be directly assessed by immunoblotting because ubiquitinated forms of Met4 are not subjected to proteasomal degradation and can thus be detected due to a characteristic mobility shift on denaturing gels30. Asterisk (*) denotes a non-specific band immuno-reactive to the anti-Met4 antibody (generous gift from Mike Tyers). b, SMER3 resistance in met4Δ cells. Yeast cells were treated with either vehicle (DMSO) or 4 μM SMER3 and growth curve analysis was performed with an automated absorbance reader measuring O.D. at 595 nm every 30 min (Supplementary Information). Cell growth was measured in liquid because SMER3 activity is undetectable on agar. c, Genetic interaction between SCFMet30 and TOR. Temperature sensitive mutants as indicated were grown at 25°C to mid-log phase in YPDA medium and serial dilutions were spotted onto plates with or without 2.5 nM rapamycin. The plates were incubated at the permissive temperatures for the mutants: 28°C for cdc34-3, cdc53-1, cdc4-3 and met30-6 because these mutants exhibited fitness defects at 30°C even without rapamycin, or 30°C (standard growth temperature) for met30-9 and skp1-25 because these alleles are not temperature sensitive until at 37°C. d, SMER3 specifically inhibits SCFMet30 E3 ligase in vitro. Components of SCFMet30 were co-expressed in insect cells and the complex was purified based on a GST-tag fused to Skp1.[1].Mariam Aghajan, et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nat Biotechnol. 2010 Jul;28(7):738-42.

Molecular mechanism for the specificity of SCFMet30 inhibition by SMER3 a, Protein-protein interaction between Met30 and Skp1 is diminished by SMER3 in vivo. Yeast strains expressing endogenous 13Myc-tagged Met30 were either untreated, or treated with solvent control (DMSO) or 30μM SMER3 for 30 minutes at 30°C. 13MycMet30 was immunopurified and immuncomplexes were analyzed for Skp1 binding by Western blot analysis. b, SMER3 specifically targets SCFMet30 in vivo as determined by quantitative mass spectrometry. A yeast strain expressing endogenous HBTH-tagged Skp1 was grown in medium containing either heavy (13C/15N) or light (12C/14N) arginine and lysine to metabolically label proteins. The “heavy” culture was treated with solvent control (DMSO) and the “light” culture with 20μM SMER3 for 30 minutes at 30°C. Cells were incubated with 1% formaldehyde to cross-link and stabilize protein complexes in vivo for 10 minutes at 30°C. Cell lysates were prepared under denaturing conditions in 8M urea, mixed at equal amounts, and HBTHSkp1-bound complexes were sequentially purified on Ni2+ and streptavidin sepharose under fully denaturing conditions. Tryptic peptides of the purified complexes were analyzed by LC-MS/MS. Relative abundance of proteins was determined by measuring the peptide peak intensities. Abundance ratios for SCF components identified by multiple quantifiable peptides are shown as SILAC ratios of “light” (SMER3-treated) over “heavy” (DMSO-treated) peptide intensities. c, SMER3 specificity for SCFMet30 vs. SCFCdc4 as verified by cell cycle arrest morphology. Temperature sensitive mutants were shifted to 37°C for 4 hours. The Skp1 depletion phenotype was observed after repression of Skp1 expression in dextrose medium for 12 hours. SMER3 treatment of cells was for 6 hours. d, SMER3 directly binds to Met30-Skp1, but not Skp1 alone as determined by differential scanning fluorimetry (DSF).[1].Mariam Aghajan, et al. Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase. Nat Biotechnol. 2010 Jul;28(7):738-42.