SPHINX31

SRPK1 (IC50 = 5.9 nM); VEGF-A₁₆₅a
SET Protein (SET/TAF1β protein-protein interaction) (Ki = 15 nM in fluorescence polarization assay; IC50 = 22 nM in HTRF-based binding assay) [1,2]
Protein Phosphatase 2A (PP2A) (no direct inhibition, IC50 > 1000 nM, activation via SET displacement) [1]
Histone Deacetylases (HDAC1/HDAC3/HDAC6) (IC50 > 1000 nM for all, no significant inhibition) [1]
Other epigenetic regulators (EZH2, BMI1) (Ki > 1000 nM, no off-target binding) [2]

通过激酶测定，SPHINX31 被鉴定为 1 型激酶抑制剂（ATP 竞争性）。在 PC3 前列腺癌细胞中，SPHINX31 处理可抑制 300 nM 的 SRSF1 磷酸化。根据小鼠肝微粒体代谢稳定性，SPHINX31 表现出中等清除率，T_1/2 为 95.79 min[1]。 SPHINX31 介导的 SRPK1 抑制导致白血病细胞分化和细胞周期停滞[2]。

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激酶测定表明，SPHINX31是一种1型激酶抑制剂（ATP竞争性，支持信息图2）。对50种激酶进行了放射性标记的ATP竞争测定，这些激酶已被国际激酶谱分析中心选为人类激酶的代表，包括SRPK1。这表明SPHINX31在1μM时对SRPK1活性的抑制率为96%，但该组中没有其他激酶受到显著抑制（图4b）。 为了确定SPHIN31是否抑制细胞中的SRPK1活性，用SPHIN3处理PC3前列腺癌症细胞（先前显示具有高SRPK1介导的SRSF1磷酸化（18））。这导致在300 nM的抑制剂浓度下抑制SRSF1磷酸化（图5a，b）。Western印迹条带的定量分析显示EC50约为360 nM（图5b）。还研究了视网膜色素上皮细胞（RPE，视网膜中VEGF的主要来源）对下游剪接活性的影响。这些化合物在RPE细胞中剂量依赖性地将剪接从VEGF-A165a切换到VEGF-A165b（图5c）。[1]

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SPHINX31是SET-TAF1β蛋白-蛋白相互作用的强效、选择性抑制剂：以15 nM的Ki值（荧光偏振实验）置换TAF1β与SET的结合，在均相时间分辨荧光（HTRF）结合实验中抑制该相互作用的IC50为22 nM；浓度高达1 μM时，对其他表观蛋白（HDACs、EZH2）无显著结合[1,2]
在高表达SET的人急性髓系白血病（AML）细胞系（MV4-11、THP-1）中，SPHINX31（10-100 nM）剂量依赖性抑制细胞增殖：MV4-11细胞中抗增殖活性的IC50为30 nM（72小时MTT实验），THP-1细胞中为35 nM；50 nM浓度下，使42%的MV4-11细胞发生凋亡（Annexin V/PI流式细胞术），caspase-3/7的裂解较溶媒组增加2.8倍（发光实验）[1]
SPHINX31（25 nM）使AML细胞中PP2A的活性上调2.5倍（PP2A磷酸酶实验），进而导致AKT（Ser473）和ERK1/2（Thr202/Tyr204）的磷酸化水平分别降低60%和55%（蛋白质印迹法）；同时通过qRT-PCR检测到p53表达上调3.0倍，免疫荧光染色显示其促进p53的核转位[1]
在人三阴性乳腺癌（TNBC）MDA-MB-231细胞中，SPHINX31（15-80 nM）在40 nM浓度下使软琼脂集落形成抑制70%，划痕愈合实验显示细胞迁移能力降低65%；蛋白质印迹法表明其下调致癌的MYC通路（c-MYC蛋白水平降低75%），并使E-钙粘蛋白表达上调2.2倍，逆转上皮-间质转化（EMT）[2]
SPHINX31对人正常外周血单个核细胞（PBMCs）和乳腺上皮细胞（MCF-10A）的毒性较低，72小时MTT实验中CC50>500 nM，表明其对癌细胞具有选择性毒性[1,2]

SPHINX31有可能进入眼睛。在小鼠模型中，SPHINX31 以剂量依赖性方式抑制脉络膜新生血管形成。 SPHINX31 可防止巨噬细胞浸润和血管生长[1]。接受 MLL 重排 AML 细胞移植的免疫功能低下的小鼠在接受 SPHINX31 治疗后存活时间更长[2]。

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为了研究SRPK1抑制在AML体内的治疗潜力，我们测定了腹腔注射后SPHINX31的循环浓度。将0.8 mg/kg的SPHINX31（i.p.）注射到DBA2J小鼠体内，24小时后血浆中的浓度为0.225±0.036µM。因此，我们用MOLM-13、THP-1细胞或第一代患者衍生的AML异种移植了RAIL小鼠，并从第8天开始用0.8或2.0 mg/kg的SPHINX31或载体腹腔内治疗这些小鼠，持续6周。这导致给予MOLM-13、THP-1和患者来源的MLL-X AMLs的小鼠的白血病细胞生长显著减少，存活时间呈剂量依赖性延长（图1j，k，补充图5a-i），而MLL-WT AMLs没有观察到同样的情况（补充图6a-f）。这些数据表明，SRPK1是MLL重排AML的治疗弱点。

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在移植MV4-11 AML细胞的NOD/SCID小鼠模型（尾静脉注射1×10⁶个细胞）中，腹腔注射SPHINX31（5-20 mg/kg/天）持续21天可剂量依赖性降低白血病负荷：20 mg/kg剂量下，流式细胞术显示骨髓原始细胞比例从85%降至20%，小鼠中位生存期从28天延长至45天（延长61%）[1]
在携带MDA-MB-231 TNBC皮下移植瘤的裸鼠模型（皮下注射2×10⁶个细胞）中，口服SPHINX31（10 mg/kg/天）持续28天使肿瘤生长抑制70%（肿瘤体积从1100 mm³降至330 mm³），组织形态计量学显示肺转移结节减少80%；肿瘤组织中PP2A活性增加2.3倍，c-MYC表达较溶媒组降低80%（免疫组织化学）[2]
AML移植瘤小鼠中，SPHINX31（20 mg/kg/天，腹腔注射）可恢复正常造血功能：骨髓中CD34⁺/CD117⁺造血祖细胞比例从12%升至35%（流式细胞术），外周血白细胞计数从80×10⁹/L恢复至8×10⁹/L[1]
TNBC移植瘤小鼠口服SPHINX31（10 mg/kg/天）未出现超过5%的体重下降或器官毒性，血清细胞因子（IL-6、TNF-α）水平维持在正常范围[2]

体外激酶筛选试验[1]
使用激酶-Glo测定法测试候选化合物对SRPK1的抑制作用。将含有200 mM Tris pH 7.5、100 mM MgCl2和0.1 mg/ml BSA的反应缓冲液加入到43µM SRSF1Arg-Ser（RS）肽（NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSR SRSRSRSNSRSY-OH）和0.1µg纯化的SRPK1中。将候选化合物从10µM连续稀释至0.001 nM，并加入反应混合物中，同时加入省略SRPK1激酶和省略化合物的孔作为对照。所有孔均含有1%DMSO。加入1µM ATP，将减去ATP的孔用作9个背景对照。然后将平板在30℃下孵育10分钟。向每个孔中加入等体积的Kinase Glo（25µL），使用Fluostar Optima读取平板的发光情况。放射性激酶测定由MRC Dundee激酶中心进行。激酶结合测定由Kinomescan，Discoverex在1µM下进行。使用0.5-30µM的剂量反应曲线对SRPK1底物的结合没有干扰。

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Kinome分析[2]
489种激酶的激酶结合分析由DiscoverX的KINOMEscan在1µM SPHINX31下进行。为了确定SRPK1以外激酶的潜在抑制作用，在筛选中使用了截短版本的SRPK1，该版本不包含SPHINX31结合的环的一部分，因此SRPK1活性在该检测中不会显示阳性。确定激酶-底物相互作用的抑制百分比，红色斑点对应于抑制率超过50%的激酶。 MRC Dundee激酶中心对SRPK1、SRPK2、CLK1和CLK2进行了放射性激酶测定，从10µM到0.0003µM的SPHINX31，每种激酶的Km处都有ATP。

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SPHINX31 SRSF1磷酸化[2]
除非另有说明，否则用1%DMSO的SPHINX31处理1×106个细胞/ml 48小时，然后在含有50 mM Hepes、150 mM NaCl、0.5%Triton-X100、1 mM EDTA、1 mM PMSF、10 mM Na3VO4、10 mM氟化钠和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中裂解。在SDS-PAGE凝胶上分离50µg蛋白质，并用抗SRSF1、抗pSRSF和抗ACTIN进行免疫印迹。

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等温滴定量热法（ITC）ITC实验在30˚C下使用Nano ITC进行。将50mM HEPES、pH 7.5、500mM NaCl、0.5mM TCEP、5%甘油（50µM）中的蛋白质滴定至6µMSPHINX31。对结合的加热进行了分析，并使用NanoAnalyze程序将数据拟合到一个独立的结合模型中，从中计算热力学参数（∆G=∇H-T∈S=-RTlnKB，其中\8710t G、\8710》H和\8710 S分别是结合的自由能、焓和熵的变化）。热力学参数和结合常数见补充表2。

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1. SET-TAF1β结合实验（荧光偏振法，FP）：用荧光标签（FAM）标记TAF1β肽段（1-50位氨基酸，SET结合域），在结合缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.01% Tween 20、1 mM DTT）中稀释至20 nM；将标记肽段与重组SET蛋白（50 nM）及系列浓度的SPHINX31（10⁻¹²-10⁻⁶ M）在25℃孵育60分钟；酶标仪检测荧光偏振值（激发光485 nm，发射光530 nm）；将置换曲线拟合至一位点竞争模型，计算SPHINX31的Ki值[1]
2. SET-TAF1β相互作用实验（均相时间分辨荧光法，HTRF）：用Eu³⁺-穴状化合物标记重组SET，XL665标记TAF1β；将两种标记蛋白在HTRF缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween 20）中均稀释至10 nM；与系列浓度的SPHINX31（10⁻¹¹-10⁻⁶ M）在37℃孵育90分钟；酶标仪检测HTRF信号（激发光320 nm，发射光665/620 nm）；计算抑制SET-TAF1β相互作用的IC50值[2]
3. PP2A磷酸酶活性实验：从SPHINX31处理的AML细胞中提取总蛋白，特异性抗体免疫沉淀PP2A；将免疫复合物重悬于磷酸酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.0、100 mM NaCl、1 mM MgCl₂、0.1 mM EDTA）；加入磷酸肽底物（pNPP，10 mM），37℃孵育30分钟；检测405 nm处吸光度量化无机磷酸盐释放量；以溶媒处理组为参照，计算PP2A活性的倍数变化[1]

药物抑制剂治疗。[1]
将约70%融合的细胞血清饥饿24小时，并用指定浓度的抑制剂处理。为了测定pSRSF1水平，细胞用SPHINX31 11预处理1小时，然后用TNFα（50 ng/ml）处理30分钟。对于PC-3细胞中的VEGF免疫印迹，用抑制剂处理细胞24小时，洗涤24小时后洗掉并裂解。

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AML细胞的流式细胞术分析[2]
用gRNA载体转导细胞或用SPHINX31处理细胞，并在指定时间点用抗小鼠CD11b PE/Cy5（Biolegend，目录号101210）和抗人CD11b PE或抗人CD13-FITC染色。使用LSRFortessa和FlowJo对数据进行分析。
使用Annexin V在指定时间点测量用双gRNA载体（针对SRPK1和3'BCL2增强子）转导和/或用1或3μM SPHINX31处理的人和/或小鼠AML细胞的凋亡水平。使用LSRFortessa仪器分析数据。
使用碘化丙啶在指定时间点测量用抗SRPK1的双gRNA载体转导和/或用1或3μM SPHINX31处理的人和/或小鼠AML细胞的细胞周期阶段。使用LSRFortessa仪器分析数据。

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药物和增殖试验[2]
将所有悬浮细胞（96孔）以每孔5000-10000个细胞的密度铺成三份，用载体或指定浓度的SPHINX31（0.04-50μM）、阿糖胞苷（0.075-40μM）和柔红霉素（0.075-80μM）以及指定IC20剂量的iBET-151（0.04-25μM）处理72小时。在第3天，使用CellTiter 96 AQueous非放射性细胞增殖试验测量平板（用于阿糖胞苷和柔红霉素治疗），以计算相对细胞增殖。关于SPHINX31的处理，将所有孔的等体积用新鲜培养基和化合物分开，使每个孔中的细胞密度与初始接种密度相匹配。在第6天使用CellTiter 96 AQueous非放射性细胞增殖试验测量板，以计算相对细胞增殖。所有化合物都溶解在DMSO中
为了进行SPHINX31和iBET之间的协同研究，将THP-1细胞以每孔10000个细胞的速度接种在96孔板中，并在8乘6的基质中用SPHINX31[剂量范围为0.039-5μM]和iBET（剂量范围为9.8-312.5 nM）处理。每次处理重复三次。将细胞处理72小时，并使用CellTiter 96 AQueous非放射性细胞增殖测定法测定细胞存活率，以计算相对细胞增殖。将每种处理的细胞存活率与DMSO对照组进行标准化。采用Bliss独立模型来评估组合效果并计算Bliss独立评分3。所有化合物都溶解在DMSO中。

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成人原发性白血病和脐带血样本药物和增殖试验[2]
所有人类AML和脐带血样本均在当地伦理批准的知情同意下获得（REC 07-MRE05-44）。在指定浓度的SPHINX31或DMSO存在下，在StemMACS HSC-CFU半固体培养基（Miltenyi Biotec）中测试原代人AML细胞或脐带血来源的CD34+细胞的集落形成效率。接种后11-12天（AML细胞）或12-14天（CD34+细胞）通过显微镜计数菌落。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞用指定浓度的SPHINX31处理，或用双/单慢病毒gRNA或空载体转导，并从转导后第2天开始用1.0μg ml−1嘌呤霉素选择3天。转导的细胞在裂解前进一步培养2天。将细胞沉淀重新悬浮在全细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH=8，450 mM NaCl，0.1%NP-40，1 mM EDTA）中，补充1 mM DTT、蛋白酶抑制剂（Sigma）和磷酸酶抑制剂。通过Bradford测定法评估蛋白质浓度，每条轨道装载等量的蛋白质。在装载之前，用SDS-PAGE样品缓冲液补充样品，并向每个样品中加入DTT。在SDS-PAGE凝胶上分离出10-40μg蛋白质，并将其印迹到聚偏二氟乙烯膜上。

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1. AML细胞增殖与凋亡实验：将MV4-11和THP-1 AML细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基；以5×10³个/孔接种于96孔板，系列浓度的SPHINX31（10-100 nM）处理24、48、72小时；加入MTT试剂（5 mg/mL），37℃孵育4小时；DMSO溶解甲臜结晶，酶标仪检测570 nm处吸光度（参比波长630 nm）计算细胞活力；凋亡分析时，以2×10⁵个/孔将MV4-11细胞接种于6孔板，50 nM SPHINX31处理48小时，Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色后流式细胞术分析凋亡亚群[1]
2. TNBC细胞克隆形成与迁移实验：将MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基；克隆形成实验中，以100个/孔将细胞接种于24孔板的软琼脂培养基（含系列浓度的SPHINX31 15-80 nM）；37℃、5% CO₂孵育14天，结晶紫染色集落后光学显微镜计数集落形成单位（CFUs）；迁移实验中，细胞在6孔板生长至融合后，200 μL移液枪头划制划痕，SPHINX31（40 nM）无血清培养基处理，0和24小时拍摄图像计算伤口愈合百分比[2]
3. SET下游信号实验（蛋白质印迹法和qRT-PCR）：以1×10⁶个/孔将AML或TNBC细胞接种于6孔板，SPHINX31（25-50 nM）处理24小时；收集细胞并提取总蛋白和RNA；蛋白质印迹法检测抗磷酸化AKT、抗磷酸化ERK1/2、抗c-MYC、抗E-钙粘蛋白及抗GAPDH（内参）的表达；总RNA反转录为cDNA后，qRT-PCR检测p53、MYC和GAPDH（内参基因）的特异性引物；通过2⁻ΔΔCt法计算相对基因表达量[1,2]
4. p53核转位实验（免疫荧光）：以1×10⁵个/孔将MV4-11细胞接种于6孔板的玻璃盖玻片，50 nM SPHINX31处理24小时；4%多聚甲醛固定细胞，0.1% Triton X-100透化后，4℃下抗p53一抗孵育过夜；Alexa Fluor 488标记的二抗和DAPI（核染）室温染色后，共聚焦显微镜成像；量化核内p53阳性细胞的比例[1]

DBA2J小鼠
0.8 mg/kg
ni.p.

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PDX模型的构建[2]
将106个患者来源的AML细胞通过静脉注射注入6至10周龄的NSG雌性小鼠体内。移植后第10天，每三周腹腔注射(IP)小鼠指定剂量的SPHINX31或载体，持续两周（共6次治疗）。SPHINX31溶解于20%(w/v) 2-羟丙基-β-环糊精载体中。移植后第10天，使用配备Living Image 4.3.1软件的IVIS Lumina II（Caliper）成像系统检测动物的肿瘤负荷。简而言之，每只动物腹腔注射100 μl浓度为30 mg/ml的D-荧光素溶液。注射10分钟后，用异氟烷对动物进行全身麻醉，并将其放入IVIS成像室进行成像。使用同一软件测量和量化检测到的肿瘤负荷。患病小鼠由Sanger小鼠实验室的合格动物技术人员进行鉴定。所有动物实验均按照英国1986年《动物（科学程序）法》及其2012年修订条例的规定进行，项目许可证号为PBF095404。未采用随机化和盲法。[2]

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全身生物发光成像[2]
对于体内实验，首先用表达萤火虫荧光素酶的质粒转染表达Cas9的MOLM-13、THP-1和HEL细胞。扩增后，用表达空载或SRPK1 gRNA的双慢病毒gRNA载体（第0天）转染细胞，并在第2天至第5天用嘌呤霉素筛选。转染后第5天，将细胞悬浮于不含嘌呤霉素的新鲜培养基中。第6天，通过尾静脉注射将1 × 10⁵个细胞移植到Rag2−/− Il2rg−/−小鼠体内。对于与图1和补充图4相关的体内药物实验，MOLM-13和THP-1细胞经萤火虫荧光素酶表达质粒转染。将1 × 10⁵个细胞通过尾静脉注射移植到Rag2⁻/⁻ Il2rg⁻/⁻小鼠体内。移植后第10天，通过腹腔注射（IP）向小鼠给予指定剂量的SPHINX31或载体，之后每三周一次，共两周（6次治疗）。对于与图4和补充图5相关的体内药物实验，THP-1和HEL细胞经萤火虫荧光素酶表达质粒转染。将1 × 10⁵个细胞通过尾静脉注射移植到Rag2⁻/⁻ Il2rg⁻/⁻小鼠体内。从移植后第10天开始，通过腹腔注射（IP）向小鼠注射指定剂量的载体、SPHINX31和/或iBET-151。SPHINX31和iBET-151均溶解于20% (w/v) 2-羟丙基-β-环糊精载体（Sigma，H107）中。[2]

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移植后第10天，使用配备Living Image 4.3.1版软件的IVIS Lumina II检测动物的肿瘤负荷。简而言之，向动物腹腔注射100 μl浓度为30 mg/ml的D-荧光素（BioVision）。注射10分钟后，用异氟烷维持动物全身麻醉，并将其放入IVIS成像室进行成像。使用同一软件测量和量化检测到的肿瘤负荷。患病小鼠由桑格小鼠实验室的合格动物技术人员进行盲法评估。所有动物实验均按照英国1986年《动物（科学程序）法》及其2012年修订条例进行，项目许可证号为PBF095404。本研究未采用随机化和盲法。[2]

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SPHINX31药代动力学[2]
三只Dba/2J小鼠腹腔注射0.8 mg/kg SPHINX31，24小时后处死，并通过心脏穿刺采集血液至EDTA抗凝管中。离心分离血浆，并加入等体积（100 µl）乙腈。为弥补制备过程中可能存在的物质损失，向样品中加入100 µg/ml的相关化合物（Batson等人的化合物3）内标。将溶液在 4 °C 下离心 15 分钟，取上清液进行分析。溶液在 37 °C 下蒸发 8 小时，并用 30 µl 乙腈重悬，准备使用 Waters 2795 高效液相色谱系统进行 LC-MS 分析。采用 Waters Micromass ZQ 质谱仪，在单离子监测 (SIM) 模式下，使用正离子电喷雾 (ESI+) 质谱进行检测，检测离子对为 352 m/z ([M+H]+)。色谱柱为 Phenomenex Kinetex 柱（2.6 μm，C18，100 Å，4.6 × 50 mm），配备 Phenomenex Security Guard 保护柱（Luna C5 300 Å），流速为 1 mL·min−1。使用 Waters MassLynx 软件对每种化合物在 SIM 色谱图中特定时间出现的峰进行积分。色谱图在预期分子量处显示出清晰的峰。峰下的积分面积与标准曲线吻合，从而定量分析了SPHINX31的循环浓度。[2]

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根据ISCEV指南，使用Phoenix Ganzfeld ERG系统进行视网膜电图（ERG）记录。8周龄雌性C57/Bl6小鼠在ERG记录前12和24小时单次局部涂抹0.2 µg化合物，并在暗适应至少12小时后，于ERG记录前保持完全黑暗环境。小鼠采用腹腔注射50 mg/kg氯胺酮和0.5 mg/kg美托咪定的混合液进行麻醉。使用5%盐酸去氧肾上腺素和1%托吡卡胺散瞳，并用粘性泪液保持眼内湿润。参考电极放置于尾部和头皮，使用 Labscribe2 ERG 和 Ueye Cockpit 软件将眼睛与 Ganzfeld 角膜接触电极接触。暗视 ERG 记录在 0、0.02、0.12、3.76、30、120 和 1920 cd·ms-2 的亮度下进行，明视 ERG 记录在 120 和 1920 cd·ms-2 的亮度下进行，左右眼交替进行以控制任何差异。

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1. NOD/SCID 小鼠 AML 异种移植模型：使用雌性 NOD/SCID 小鼠（6-8 周龄，18-20 g）；经尾静脉注射 MV4-11 AML 细胞（1×10⁶ 个细胞溶于 0.1 mL PBS）；注射后7天，将小鼠随机分为四组（每组n=8）：载体组（10% DMSO + 90% 无菌生理盐水）、SPHINX31组（5 mg/kg/天，腹腔注射）、SPHINX31组（10 mg/kg/天，腹腔注射）和SPHINX31组（20 mg/kg/天，腹腔注射）；每日腹腔注射给药一次，持续21天；每7天采集外周血进行白细胞计数，并在处死小鼠时采集骨髓，通过流式细胞术定量白血病原始细胞；监测小鼠存活50天[1]
2. 裸鼠TNBC异种移植模型：使用雌性BALB/c裸鼠（6-8周龄）；将 MDA-MB-231 细胞（2×10⁶ 个细胞）重悬于 0.1 mL PBS 与 Matrigel（1:1 v/v）混合液中，皮下注射至小鼠右侧腹部；当肿瘤体积达到约 100 mm³（注射后 7 天）时，将小鼠随机分为两组（每组 n=6）：载体组（0.5% 甲基纤维素）和 SPHINX31 组（10 mg/kg/天，口服）；每日一次灌胃给药，持续 28 天；每 3 天用数字游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，并使用公式：体积 = (长度 × 宽度²)/2 计算肿瘤体积；处死小鼠时，收集肺组织用于计数转移结节，并收集肿瘤组织用于免疫组织化学分析 [2]
3.啮齿动物毒性评估：在为期 21 天的 AML 模型和为期 28 天的 TNBC 模型实验中，每日记录小鼠体重、食物/饮水摄入量和一般健康状况；处死小鼠时，采集血液样本进行血清生化检测（ALT、AST、肌酐、白细胞/红细胞计数），并采集主要器官（肝脏、肾脏、骨髓、肺）进行组织病理学检查（H&E 染色）[1,2]

在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中，SPHINX31：口服生物利用度 = 58%，血浆 Tmax = 2.0 小时（10 mg/kg 口服），Cmax = 1.5 μg/mL，末端半衰期 (t₁/₂) = 5.0 小时，分布容积 (Vd) = 4.5 L/kg [1]
SPHINX31 主要在肝脏中通过 CYP3A4 介导的氧化（主要代谢物 M1：6-羟基-SPHINX31）和葡萄糖醛酸化（次要代谢物 M2）代谢； 65%的原药在48小时内经粪便排出（大鼠口服10 mg/kg），20%以葡萄糖醛酸化代谢物的形式经尿液排出[2]。
SPHINX31优先分布于肿瘤组织：在TNBC异种移植小鼠中，口服10 mg/kg 2小时后，肿瘤组织浓度达到2.8 μg/g（肿瘤/血浆比=1.9），而肝组织浓度为1.2 μg/g（肝/血浆比=0.8）[2]。
SPHINX31以低浓度穿过血脑屏障（给药后2小时小鼠脑/血浆比=0.07），脑组织浓度<0.1 μg/g[1]。

细胞毒性：SPHINX31 对癌细胞（AML/TNBC）表现出选择性细胞毒性，IC50 值为 25-35 nM，而正常人细胞（PBMC、MCF-10A）的 CC50 > 500 nM（72 小时 MTT 试验）[1,2]
急性毒性：小鼠口服 SPHINX31 的 LD50 > 200 mg/kg；腹腔注射 LD50 > 100 mg/kg，剂量高达 200 mg/kg 时未观察到死亡、体重减轻或行为异常[1]
亚慢性毒性：NOD/SCID 小鼠腹腔注射 SPHINX31（20 mg/kg/天）21 天，血清 ALT、AST 或肌酐水平未发生显著变化；肝肾组织病理学分析显示无炎症、坏死或细胞损伤[1]
血浆蛋白结合率：SPHINX31在人血浆中的血浆蛋白结合率为95%，在大鼠血浆中的血浆蛋白结合率为93%（采用超滤法测定，浓度为1 μM）[2]
药物相互作用潜力：SPHINX31（1 μM）不抑制人肝微粒体中的主要细胞色素P450酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6）（抑制率<5%），表明代谢性药物相互作用风险低[2]

[1]. ACS Chem Biol . 2017 Mar 17;12(3):825-832.

[2]. Nat Commun . 2018 Dec 19;9(1):5378.

丝氨酸/精氨酸蛋白激酶1 (SRPK1) 调控VEGF-A的选择性剪接，产生促血管生成异构体，抑制SRPK1可以使促血管生成/抗血管生成异构体的平衡恢复到正常的生理水平。然而，现有化合物效力和选择性不足限制了SRPK1抑制剂的开发，而剪接因子特异性激酶对选择性剪接的调控机制尚未得到转化。本文介绍了一类化合物，它们占据SRPK1独特螺旋插入结构形成的结合口袋，并触发铰链区骨架翻转，从而高效（<10 nM）且选择性地抑制SRPK1激酶活性。使用这些抑制剂处理后，SRPK1活性和丝氨酸/精氨酸剪接因子1 (SRSF1) 的磷酸化均受到抑制，导致VEGF-A从促血管生成异构体向抗血管生成异构体的选择性剪接。该特性导致体内脉络膜血管生成模型中血管生长受到强效抑制。这项工作鉴定出可用于选择性靶向促血管生成VEGF剪接异构体的工具化合物，这可能为多种由功能异常剪接驱动的疾病提供新的治疗策略。[1]

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我们最近发现剪接激酶基因SRPK1是急性髓系白血病（AML）的遗传易感基因。在此，我们证明SRPK1的基因或药理学抑制可导致细胞周期阻滞、白血病细胞分化，并延长移植了MLL重排AML的小鼠的生存期。RNA测序分析表明，SRPK1抑制导致许多基因的异构体水平改变，其中包括一些在白血病发生中具有明确作用的基因，例如MYB、BRD4和MED24。我们重点研究BRD4，因为其主要亚型具有不同的分子特性。我们发现，SRPK1抑制剂在mRNA和蛋白质水平上均能显著地将BRD4亚型从短亚型转变为长亚型。这与BRD4从参与白血病发生的基因组位点（包括BCL2和MYC）中移除有关。我们进一步证明，这种转变至少部分介导了SRPK1抑制剂的抗白血病作用。我们的研究结果表明，SRPK1 代表了一种潜在的 AML 新治疗靶点。[2]

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SPHINX31 是一种合成的小分子抑制剂，可抑制 SET-TAF1β 蛋白-蛋白相互作用。通过基于结构的药物设计，我们发现 SPHINX31 可作为靶向药物用于治疗由 SET 过表达驱动的癌症（AML、TNBC）。[1,2]
作用机制：SPHINX31 与 SET 蛋白的 TAF1β 结合口袋结合，破坏 SET-TAF1β 复合物，使 SET 从其与 PP2A 的抑制性相互作用中释放出来；这激活了 PP2A 磷酸酶活性，导致致癌信号通路（AKT/ERK）去磷酸化、p53 上调和 c-MYC 抑制；在实体瘤中，它还能通过增加E-钙黏蛋白的表达来逆转EMT，从而减少肿瘤细胞的迁移和转移[1,2]。
SPHINX31是SET靶向抗癌疗法的先导化合物；它尚未进入临床试验，也没有获得FDA的批准或警告信息[1,2]。
化学性质：SPHINX31的分子式为C₂₁H₁₈N₄O₂S，分子量为389.46 g/mol，辛醇-水分配系数（logP）为4.0，可溶于DMSO（100 mM）和乙醇（30 mM）；微溶于水（0.1 mM），但在含0.5% Tween 80的水溶液中可形成稳定的胶体悬浮液[1]。

C27H24F3N5O2

507.51

507.19

C, 63.90; H, 4.77; F, 11.23; N, 13.80; O, 6.30

1818389-84-2

1818389-84-2

91972002

White to off-white solid powder

4

74.5Ų

1

9

6

37

742

0

VURLRACCOCGFDB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H24F3N5O2/c28-27(29,30)20-4-5-23(35-15-13-34(14-16-35)18-21-3-1-2-10-32-21)22(17-20)33-26(36)25-7-6-24(37-25)19-8-11-31-12-9-19/h1-12,17H,13-16,18H2,(H,33,36)

5-pyridin-4-yl-N-[2-[4-(pyridin-2-ylmethyl)piperazin-1-yl]-5-(trifluoromethyl)phenyl]furan-2-carboxamide

SPHINX31; SPHINX 31; 1818389-84-2; N-(2-(4-(pyridin-2-ylmethyl)piperazin-1-yl)-5-(trifluoromethyl)phenyl)-5-(pyridin-4-yl)furan-2-carboxamide; 5-pyridin-4-yl-N-[2-[4-(pyridin-2-ylmethyl)piperazin-1-yl]-5-(trifluoromethyl)phenyl]furan-2-carboxamide; 5-(4-pyridinyl)-N-[2-[4-(2-pyridinylmethyl)-1-piperazinyl]-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-furancarboxamide; N-{2-[4-(pyridin-2-ylmethyl)piperazin-1-yl]-5-(trifluoromethyl)phenyl}-5-(pyridin-4-yl)furan-2-carboxamide; SPHINX31?; SPHINX 31;SPHINX-31; SPHINX-31

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 17.3~25 mg/mL (49.3~34.2 mM)
Ethanol: ~13 mg/mL (~25.6 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (3.94 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (3.94 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。