Spinosin   中文名称: 斯皮诺素

Nrf2/HO-1; Aβ
5-HT1A receptor (antagonist) [1]
Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) / heme oxygenase-1 (HO-1) pathway (activator) [2]

本研究主要探讨了棘霉素是否能够通过影响淀粉样前体蛋白（APP）的加工过程，改善由β-淀粉样蛋白（Aβ）过度生成驱动的阿尔茨海默病（AD）的发病机制。将野生型小鼠Neuro-2a细胞（N2a/WT）和稳定表达人APP695的N2a细胞（N2a/APP695）用棘霉素处理24小时。采用Western blot分析检测APP蛋白水平以及与APP加工密切相关的分泌酶的表达水平。分别采用免疫荧光法和Western blot分析检测氧化应激相关蛋白，如核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）。采用流式细胞术分析细胞内活性氧（ROS）水平，使用ELISA试剂盒测定Aβ1-42水平，并采用硫黄素T（ThT）法检测刺苷对Aβ1-42聚集的影响。结果表明，ROS诱导ADAM10表达并降低BACE1表达，而刺苷通过激活Nrf2并上调HO-1表达抑制ROS生成。此外，刺苷通过影响APP的加工过程降低Aβ1-42的生成，并抑制Aβ1-42的聚集。综上所述，刺苷通过激活N2a/WT和N2a/APP695细胞中的Nrf2/HO-1通路降低Aβ1-42的生成。因此，棘霉素有望成为治疗阿尔茨海默病的一种有前景的药物[2]。在N2a/WT和N2a/APP695细胞中，浓度高达100 μM的棘霉素（6.25、12.5、25 μM，处理24小时）对细胞活力没有影响，但在200和400 μM时，棘霉素对N2a/APP695细胞表现出细胞毒性。[2]与未处理的对照组相比，25 μM的棘霉素使N2a/APP695细胞分泌的Aβ1-42水平降低了87.32%（p<0.001），并使N2a/WT细胞和N2a/APP695细胞内的Aβ1-42水平分别降低了14.48-21.18%和16.72-19.97%。 [2]
Spinosin (25 μM) 使 N2a/WT 细胞中 APP 蛋白水平下调 89% (p<0.001)，使 N2a/APP695 细胞中 APP 蛋白水平下调 21% (p<0.01)。它还以浓度依赖的方式 (6.25-25 μM) 下调 N2a/APP695 细胞中的 BACE1 (p<0.001)，并上调两种细胞系中的 ADAM10。[2]
Spinosin (25 μM) 显著降低了 N2a/APP695 细胞内的 ROS 生成 (p<0.05)，该结果通过 DCFH-DA 流式细胞术测定，但对 N2a/WT 细胞无显著影响。 [2]
在N2a/APP695细胞中，用6.25 μM H2O2预处理90分钟后，BACE1表达增加67.68% (p<0.001)，ADAM10表达降低26.52% (p<0.01)；这些作用可被Spinosin (25 μM)逆转。[2]
Spinosin (25 μM)可增加Nrf2的核转位（通过免疫荧光检测），并上调N2a/WT和N2a/APP695细胞中HO-1蛋白的表达。[2]
用Nrf2抑制剂（维甲酸1 μM或ML385）处理可逆转Spinosin对APP、BACE1、ADAM10和HO-1表达的影响。 [2]
Spinosin (10 μM) 抑制 Aβ1-42 寡聚化并减少纤维聚集，这通过硫黄素 T 荧光测定法测定。[2]

刺枣苷是从刺枣（Zizyphus jujuba var. spinosa）种子中分离得到的一种C-糖苷类黄酮。本研究探讨了刺枣苷对胆碱能阻滞诱导的小鼠记忆障碍的影响。采用被动回避、Y迷宫和莫里斯水迷宫实验评估刺枣苷的记忆改善作用。结果显示，刺枣苷（10或20 mg/kg，口服）显著改善了东莨菪碱诱导的认知障碍，表现为被动回避实验中潜伏期延长、Y迷宫实验中自发交替行为比例增加以及莫里斯水迷宫实验中目标象限游泳时间延长。此外，单次给予正常小鼠刺枣苷也能延长被动回避实验的潜伏期。为探究刺枣苷改善记忆的机制，进行了受体拮抗分析和蛋白质印迹实验。棘霉素对东莨菪碱诱导的记忆障碍的改善作用可被亚有效剂量（0.5 mg/kg，腹腔注射）的 5-HT1A 受体激动剂 8-羟基-2-(二-N-丙基氨基)四氢萘显著拮抗。此外，棘霉素显著提高了海马中磷酸化细胞外信号调节激酶和 cAMP 反应元件结合蛋白的表达水平。综上所述，这些结果表明棘霉素的记忆改善作用可能部分归因于血清素能神经递质系统，并且棘霉素可能有助于治疗阿尔茨海默病等疾病引起的认知功能障碍[1]。在东莨菪碱诱导的记忆障碍雄性 ICR 小鼠中，口服棘霉素（10 或 20 mg/kg）显著改善了认知缺陷。在被动回避任务中，Spinosin（10 或 20 mg/kg，口服）显著逆转了东莨菪碱诱导的穿行潜伏期缩短（p<0.05）。在正常未接受过任何处理的小鼠中，Spinosin（20 mg/kg，口服）单独使用可延长被动回避任务中 0.25 mA 电击下的穿行潜伏期（p<0.05）。[1]
在 Y 型迷宫任务中，Spinosin（10 或 20 mg/kg，口服）显著改善了东莨菪碱诱导的自发交替百分比降低（p<0.05），且不影响总臂进入次数。 [1]在莫里斯水迷宫实验中，与东莨菪碱组相比，多刺素（10或20 mg/kg，口服）显著缩短了第3和第4次训练中的逃避潜伏期，并增加了探针试验中目标象限的游泳时间（p<0.05）。[1]在旷场实验中，多刺素（10或20 mg/kg，口服）不影响总活动距离，表明其对运动活性无影响。[1]在被动回避实验中，多刺素（10或20 mg/kg）的记忆改善作用被亚有效剂量的5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT（0.5 mg/kg，腹腔注射）显著拮抗（双因素方差分析，p<0.05）。 [1] 对给予Spinosin（10或20 mg/kg，口服）1小时后处死的小鼠的海马组织进行蛋白质印迹分析，结果显示ERK和CREB的磷酸化水平升高（p<0.05）。[1]

硫黄素T (ThT) 荧光测定² 将5 μM ThT配制成50 mM甘氨酸-NaOH溶液（pH 8.5）的工作液。Aβ1-42和棘霉素的最终浓度分别为20 μM和10 μM。将Aβ1-42单体和棘霉素在37°C下孵育24小时，以检测棘霉素对Aβ1-42寡聚化的影响。此外，为了检测棘霉素对Aβ1-42纤维化的影响，将Aβ1-42单体在37°C下孵育48小时使其完全聚合，然后再与棘霉素孵育24小时。上述孵育完成后，取50 μL样品加入150 μL 5 μM甘氨酸-NaOH工作液中。采用激发波长 448 nm 和发射波长 488 nm 检测荧光强度。

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硫黄素 T (ThT) 荧光测定法用于评估Spinosin对 Aβ1-42 聚集的影响。将 Aβ1-42 单体 (20 μM) 与 Spinosin (10 μM) 或不与 Spinosin (10 μM) 于 37°C 孵育 24 小时，以评估其寡聚化情况。对于原纤维解聚，首先将 Aβ1-42 单体于 37°C 孵育 48 小时以使其完全聚合，然后与 Spinosin (10 μM) 再孵育 24 小时。孵育后，取 50 μL 样品加入到 150 μL 5 μM ThT 的 50 mM 甘氨酸-NaOH 缓冲液 (pH 8.5) 中。在激发波长 448 nm 和发射波长 488 nm 下测量荧光强度。Spinosin 显著降低了 ThT 荧光强度，表明其抑制了 Aβ1-42 的寡聚化和原纤维的解聚。[2]

细胞培养和药物处理[2]
野生型小鼠Neuro-2a细胞（N2a/WT）购自iCell Bioscience公司，来源于小鼠神经母细胞瘤。稳定表达人APP695的N2a细胞（N2a/APP695）由美国加州拉霍亚桑福德-伯纳姆医学研究所的徐华熙教授和中国福建厦门大学的张云武教授惠赠。细胞培养于含5%胎牛血清的等体积DMEM和Opti-MEM混合培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。稳定转染细胞在0.2 g/L G418二硫酸盐存在下进行筛选。当细胞生长至 80% 汇合度时，用不同浓度的棘霉素（0-400 μM）孵育 24 小时，检测棘霉素对细胞活力的影响，以确定不影响细胞存活的棘霉素最大浓度。为了确定维甲酸对棘霉素抗氧化活性的影响，将细胞用棘霉素（6.25、12.5、25 μM）和维甲酸（1 μM）处理 24 小时，分别收集条件培养基和细胞，用于后续检测各种指标。

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细胞活力检测2]
采用 MTT 法检测细胞活力。将 N2a/WT 和 N2a/APP695 细胞接种于 96 孔细胞培养微孔板（每孔 10⁴ 个细胞）。将细胞用不同剂量的棘霉素（0-400 μM）处理，孵育24小时后，更换培养基为含0.5 mg/ml MTT的新鲜培养基，孵育3小时。之后，移除培养基，向每个孔中加入100 μl含有10% SDS、5%异丙醇和0.12 M HCl的溶液，并在37°C下继续孵育过夜。使用酶标仪在570 nm处测量上清液的吸光度（OD570）。相对定量数据以相对于对照组的相对百分比表示。

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ELISA检测2]
使用ELISA试剂盒，按照制造商的说明书，定量条件培养基和细胞裂解液中Aβ1-42的浓度。使用微孔板读数仪读取每个孔在 450 nm 波长下的光密度值，并通过与 Aβ1-42 标准曲线比较来确定每个样品中 Aβ1-42 的浓度。所有读数均在检测的线性范围内。

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蛋白质印迹分析2]
药物处理 24 小时后，使用添加了蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液在冰上裂解细胞 15 分钟。将细胞裂解液在 4°C 下以 13,000 rpm 离心 15 分钟，收集上清液。根据 BCA 蛋白定量试剂盒的说明进行蛋白质定量分析。将蛋白质 (30 μg) 进行 10% SDS-PAGE 电泳分离，然后转移至硝酸纤维素膜，并用 5% 脱脂奶粉封闭。封闭后，将膜与针对 APP (1:1000)、BACE1 (1:600)、ADAM10 (1:500)、Nrf2 (1:500)、HO-1 (1:500) 或 β-actin (1:3000) 的一抗于 4°C 孵育过夜。然后用 TBST 缓冲液洗涤印迹，并在室温下与二抗孵育 1.5 小时，最后用 ECL 显色。使用 Image Pro 6.0 软件对条带强度进行定量分析。

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细胞活力通过 MTT 法测定。将 N2a/WT 和 N2a/APP695 细胞接种于 96 孔板（10^4 个细胞/孔），并用不同浓度的 Spinosin (0-400 μM) 处理 24 小时。然后将培养基替换为 0.5 mg/mL MTT，孵育 3 小时，随后加入 10% SDS、5% 异丙醇和 0.12 M HCl，并在 37°C 下孵育过夜。在 570 nm 处测量吸光度。[2]
使用 ELISA 试剂盒，按照制造商的说明书，定量条件培养基和细胞裂解液中的 Aβ1-42 水平。读取 450 nm 处的吸光度值，并根据标准曲线确定浓度。[2]
Western blot 分析：用含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解细胞。通过 BCA 法测定蛋白质浓度。将蛋白质（30 μg）经 10% SDS-PAGE 电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，用 5% 脱脂奶粉封闭，并与针对 APP、BACE1、ADAM10、Nrf2、HO-1 或 β-actin 的一抗于 4°C 孵育过夜。洗涤后，将膜与二抗于室温孵育 1.5 小时，并用 ECL 法显色。使用 Image Pro 6.0 软件对条带强度进行定量分析。[2]
使用 DCFH-DA 荧光探针检测细胞内 ROS。将细胞（1×10^6/mL）与 10 μM DCFH-DA 于 37°C 避光孵育 30 分钟，然后用流式细胞仪在激发波长 485 nm 和发射波长 538 nm 下进行分析。 [2]
Nrf2 核转位的免疫荧光检测：用Spinosin处理细胞，然后用抗 Nrf2 抗体和 DAPI 染色；采集图像以评估核定位。[2]

小鼠被随机分为以下4组（每组n=10）：（I）对照组；（II）Aβ1-42组；（III）Aβ1-42+10 µg/kg棘霉素组；（IV）Aβ1-42+100 µg/kg棘霉素组。II-IV组小鼠均经腹腔注射水合氯醛（4 g/kg）麻醉，在立体定位仪下（AP：-0.5 mm；ML：-1.1 mm；DV：-3.0 mm）向左侧海马注射3 µL Aβ1-42。注射持续3分钟，注射针在原位停留2分钟后拔出。随后，在小鼠右心室上方5 mm处（AP：-0.2 mm；ML：-1.0 mm；DV：-3.0 mm）植入套管（8.0 mm）。用牙科水泥将套管固定在颅骨上。术后7天，每天对小鼠进行脑室内（ICV）注射棘霉素（10和100 µg/kg）。动物实验的时间线如图1A所示。[3]

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雄性ICR小鼠（25-30 g，6周龄）饲养于12小时光照/黑暗循环、温度23±1°C、湿度60±10%的环境中。棘霉素溶于10%吐温80溶液中，于行为学测试前1小时通过胃管灌注（po）给药。多奈哌齐（5 mg/kg，po）用作阳性对照。在测试前30分钟腹腔注射东莨菪碱（1 mg/kg）或生理盐水以诱导记忆障碍。[1]
被动回避任务：该装置由两个隔间（20×20×20 cm）组成，隔间之间由一道闸门隔开。习得试验：将小鼠置于光照充足的房间内；10秒后门打开；当小鼠进入黑暗房间后，门关闭，并给予小鼠持续3秒的足底电击（0.5 mA）。24小时后进行记忆保持试验，记录小鼠进入黑暗房间的潜伏期，最长记录300秒。在记忆增强研究（不使用东莨菪碱）中，电击强度为0.25 mA，潜伏期记录最长600秒。在拮抗研究中，于给予多巴胺后、东莨菪碱前5分钟，腹腔注射亚有效剂量的8-OH-DPAT（0.5 mg/kg）。[1]
Y迷宫任务：迷宫有三个臂（长40 cm，宽3 cm，高12 cm），角度为120°。将小鼠置于其中一个臂中，允许其探索8分钟；手动记录小鼠进入迷宫臂的次数和交替次数。交替率 (%) = [(交替次数) / (臂进入总次数 – 2)] × 100。[1]
莫里斯水迷宫实验：一个圆形水池（直径 90 厘米，高 45 厘米），池内注满含有黑色素的水（温度 24±1°C）。一个隐藏平台（直径 6 厘米）放置在其中一个象限。小鼠连续 4 天，每天进行两次试验；如果小鼠在 60 秒内没有找到平台，则将其放置在平台上 10 秒。训练结束后一天，进行一次探针试验（60 秒，不放置平台），并记录小鼠在目标象限停留的时间。每天第一次试验前 1 小时给予小鼠棘霉素。[1]
旷场实验：将小鼠放入一个黑色有机玻璃箱（40×40×40 厘米）中，使用视频系统记录小鼠 20 分钟内的总移动距离。[1]

在 N2a/APP695 细胞中，浓度为 200 μM 和 400 μM 的 Spinosin 在处理 24 小时后显示出细胞毒性（细胞活力下降），而 0-100 μM 的浓度对 N2a/WT 或 N2a/APP695 细胞的细胞活力均无显著影响。[2]

[1]. Ameliorating effect of spinosin, a C-glycoside flavonoid, on scopolamine-induced memory impairment in mice. Pharmacol Biochem Behav. 2014 May;120:88-94.

[2]. Spinosin Inhibits Aβ1-42 Production and Aggregation via Activating Nrf2/HO-1 Pathway. Biomol Ther (Seoul). 2019 Dec 3.

[3]. Neuroprotective Effects of Spinosin on Recovery of Learning and Memory in a Mouse Model of Alzheimer's Disease. Biomol Ther (Seoul). 2019 Jan 1;27(1):71-77.

棘霉素是一种黄酮类C-糖苷，其结构由C-糖苷键连接的黄酮类化合物组成。5'和4'位被羟基取代，7'位被甲氧基取代，6'位被2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基取代。它是一种植物代谢产物，也是一种抗焦虑药物。棘霉素是一种黄酮类C-糖苷、二羟基黄酮和单甲氧基黄酮，其功能与黄酮类化合物密切相关。据报道，刺参（Spinosin）存在于扭叶山豆（Desmodium tortuosum）、枣（Ziziphus jujuba）以及其他具有相关数据的生物体中。

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刺参是一种C-糖苷类黄酮（2″-β-O-吡喃葡萄糖基苦参素），是从刺枣（Zizyphus jujuba var. spinosa）种子中分离得到的。在中国、日本和韩国，刺枣种子传统上被用作镇静剂。[1]
刺参的化学结构如图1所示（参考文献[1]和图1，参考文献[2]）。[1][2]
据报道，刺参可通过突触前5-HT1A受体通路促进戊巴比妥诱导的催眠，并抑制5-HT1A受体激动剂诱导的体温过低。然而，在一项初步研究中，用刺参处理的未接受过任何处理的小鼠并未观察到镇静作用。棘霉素。[1]
棘霉素的记忆改善作用部分是通过血清素能神经递质系统（5-HT1A受体信号传导）介导的，并涉及海马中ERK和CREB磷酸化水平的升高。[1]
在阿尔茨海默病模型中，棘霉素通过激活Nrf2/HO-1通路来减少Aβ1-42的产生和聚集，从而抑制氧化应激并调节APP的加工（下调BACE1和上调ADAM10）。[2]

C28H32O15

608.5447

608.174

C, 55.26; H, 5.30; O, 39.44

72063-39-9

155692

Light yellow to yellow solid

1.7±0.1 g/cm3

901.4±65.0 °C at 760 mmHg

258 °C

296.7±27.8 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.734

-1.04

249.2

9

15

7

43

987

10

O([C@@]1([H])[C@@]([H])([C@]([H])([C@@]([H])([C@@]([H])(C([H])([H])O[H])O1)O[H])O[H])O[H])[C@@]1([H])[C@]([H])(C2=C(C([H])=C3C(C(C([H])=C(C4C([H])=C([H])C(=C([H])C=4[H])O[H])O3)=O)=C2O[H])OC([H])([H])[H])O[C@]([H])(C([H])([H])O[H])[C@]([H])([C@]1([H])O[H])O[H]

VGGSULWDCMWZPO-ODEMIOGVSA-N

InChI=1S/C28H32O15/c1-39-14-7-15-18(12(32)6-13(40-15)10-2-4-11(31)5-3-10)22(35)19(14)26-27(24(37)21(34)16(8-29)41-26)43-28-25(38)23(36)20(33)17(9-30)42-28/h2-7,16-17,20-21,23-31,33-38H,8-9H2,1H3/t16-,17-,20-,21-,23+,24+,25-,26+,27-,28+/m1/s1

6-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-7-methoxychromen-4-one

Flavoayamenin

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~410.82 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。