SR-2211

Retinoic acid receptor-related orphan receptor γ (RORγ) [1, 2].
Ki: 105 nM (for RORγ) [1].
Retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma (RORγ) - inverse agonist; IC50 = 0.11 ± 0.03 μM (95% max inhibition) in cell-based luciferase reporter gene assay; IC50 = 0.91 ± 0.07 μM (98% max inhibition) in AlphaScreen assay; ΔTm = 6.50°C in thermal shift assay. [2]
SR-2211 selectively binds to RORγt with a Ki of 105 nM, acting as an inverse agonist of constitutive RORγt activity. It inhibits RORγt-mediated transcriptional activity with an IC50 of approximately 320 nM in cell-based reporter assays. The compound demonstrates high selectivity for RORγt over other nuclear receptors, with minimal effects on RORα, liver X receptor alpha (LXRα), and farnesoid X receptor (FXR) activities. By suppressing RORγt activity, SR-2211 inhibits Th17 cell differentiation and reduces the production of pro-inflammatory cytokines such as IL-17.

SR2211处理EL4细胞后，IL-17基因表达降低。类似地，SR2211也显著降低了IL-23受体（Il23r）的表达。与载体处理的细胞相比，SR2211处理EL-4细胞后，细胞内IL-17染色显著减少[1]。

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在放射性配体结合实验中，SR2211以105 nM的计算Kᵢ值将[³H]-T0901317从GST-RORγ-LBD上置换下来[1]。
在基于细胞的Gal4共转染实验中，SR2211以约320 nM的IC₅₀值抑制Gal4-RORγ LBD的转录活性。在 10 μM 浓度下，SR2211 对 Gal4-RORα、Gal4-LXRα、Gal4-FXR 或 Gal4-VP16 对照的转录活性均未观察到显著影响 [1]。
在使用 5X-RORE 荧光素酶构建体的全长 RORγ 报告基因检测中，SR2211 以 RORγ 依赖的方式显著抑制了荧光素酶活性 [1]。
在使用 IL-17 荧光素酶报告基因的天然启动子检测中，SR2211 将 IL-17 启动子驱动的 RORγ 依赖性转录活性抑制了 50% 以上 [1]。
在 EL-4 小鼠 T 淋巴细胞中，用 5 μM SR2211 预处理后，再用 PMA/离子霉素刺激，导致内源性 IL-17A 和 IL-23R mRNA 表达显著降低，这通过定量实时 PCR 检测得到。 SR2211 对 IL-17A 基因表达的抑制作用强于地高辛 [1]。
在 EL-4 细胞中，流式细胞术细胞内细胞因子染色显示，5 μM SR2211 处理显著抑制了 PMA/离子霉素刺激后 IL-17 蛋白的产生 [1]。
在荧光素酶报告基因检测（使用转染 RORγ 的 HEK293 细胞）中，SR2211 显示出抑制活性，IC₅₀ 为 0.11 ± 0.03 μM [2]。
在热迁移实验 (TSA) 中，SR2211 稳定了 RORγ-LBD 蛋白，导致 ΔTm 为 6.50 °C [2]。
在检测 RORγ-LBD 与 SRC1 共激活肽相互作用破坏的 AlphaScreen 实验中，SR2211 显示出…… IC₅₀ 为 0.91 ± 0.07 μM [2]。

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SR-2211 用作阳性对照以校准生化分析，结果表明其具有强效的 RORγ 反向激动剂活性。在基于细胞的荧光素酶报告基因分析中，SR-2211 的 IC50 值为 0.11 ± 0.03 μM，最大抑制率为 95%。[2]
在 AlphaScreen 分析中，该分析检测了 SRC1 共激活肽募集到 RORγ-LBD 的抑制情况，SR-2211 的 IC50 值为 0.91 ± 0.07 μM，最大抑制率为 98%。 [2] 在热稳定性测定中，SR-2211 对 RORγ 蛋白表现出稳定作用，温度变化 (ΔTm) 为 6.50°C。[2] 在体外，SR-2211 在基于细胞的报告基因测定中对 RORγt 表现出强效的反向激动剂活性，IC50 约为 320 nM。该化合物与 RORγt 具有高亲和力 (Ki = 105 nM)，并抑制受体的组成型转录活性。在 Th17 细胞分化测定中，SR-2211 以浓度依赖的方式抑制初始 T 细胞分化为产生 IL-17 的 Th17 细胞。该化合物对 RORα、LXRα 和 FXR 的活性极低，证实了其对 RORγt 的选择性。

在体内，SR-2211 已在包括实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 在内的多种自身免疫性疾病小鼠模型中进行了评估。EAE 是一种多发性硬化症模型。口服或腹腔注射 SR-2211 可减轻疾病严重程度并抑制 Th17 细胞浸润中枢神经系统。该化合物还能降低受试动物血清中 IL-17 和其他促炎细胞因子的水平。在银屑病和炎症性肠病模型中，SR-2211 通过抑制 RORγt 依赖性炎症反应展现出治疗效果。

放射性配体结合分析 (SPA)：该分析采用闪烁邻近分析 (SPA) 形式进行。反应混合物包含 0.25 mg 谷胱甘肽 YSI 磁珠、1 μg GST-RORγ-LBD、5 nM [³H]-T0901317（放射性配体）以及不同浓度的 SR2211，溶于分析缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，0.01% 牛血清白蛋白，150 mM NaCl，5 mM MgCl₂，10% 甘油，1 mM DTT 和蛋白酶抑制剂混合物）中。所有组分轻轻混合，孵育 20 小时后，使用 TopCount 仪器读取结果。分析结合数据以计算 Kᵢ 值 [1]。氢/氘交换 (HDX) 质谱：使用自动化系统进行溶液相酰胺 HDX 分析。将 4 μL 浓度为 10 μM 的 RORγ-LBD 蛋白溶液用含 D₂O 的 HDX 缓冲液稀释，并在 25°C 下孵育不同时间点（10 s、30 s、60 s、900 s、3600 s）。交换完成后，用 0.1% TFA 的 3 M 尿素溶液在 1°C 下稀释蛋白使其变性。将样品通过固定化胃蛋白酶柱，并将生成的肽段捕获在 C8 捕集柱上。然后，将肽段梯度洗脱至 C18 HPLC 柱，并直接电喷雾至 Orbitrap 质谱仪。使用内部开发的软件处理数据，以计算未结合配体（SR2211）的 RORγ-LBD 和结合配体（SR2211）的 RORγ-LBD 之间氘吸收量的差异 [1]。
热稳定性变化分析 (TSA)：采用热稳定性变化分析检测配体结合。所有反应均在含有 10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl 和 5% (v/v) 甘油的缓冲液中进行，RORγ-LBD 蛋白的最终浓度为 10 μM，待测化合物的最终浓度为 200 μM。将 10 μL 反应混合物加入 96 孔 PCR 板中。加入稀释度为 1:1000 的荧光探针，并将混合物与化合物在冰上孵育 30 分钟。将 PCR 板以每分钟 0.5°C 的速率从 30°C 加热至 80°C，并使用实时 PCR 系统 [2] 以 0.5°C 的间隔记录荧光读数。
AlphaScreen 检测：该检测用于评估化合物破坏 RORγ-LBD 与 SRC1 共激活肽之间相互作用的能力。所有反应均包含 200 nM 与镍受体珠结合的 RORγ-LBD (5 μg/mL) 和 50 nM 与链霉亲和素供体珠结合的生物素化 SRC1-4 肽 (5 μg/mL)，以及不同浓度的待测化合物。化合物浓度范围为 150 nM 至 200 μM。AlphaScreen 检测缓冲液包含 50 mM MOPS、50 mM NaF、0.05 mM CHAPS 和 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白，pH 为 7.4。N 端生物素化 SRC1-4 肽序列为 QKPTSPGQTPQAQQKSLIQQLLTE [2]。

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AlphaScreen 检测：该检测监测化合物破坏 RORγ-LBD 与 SRC1 共激活肽之间相互作用的能力。所有反应均包含 200 nM 与镍受体微珠结合的受体 LBD（5 μg/mL）和 50 nM 与链霉亲和素供体微珠结合的生物素化 SRC1-4 肽（5 μg/mL），并加入指定量的对照化合物、SR-2211 或候选化合物。剂量反应实验中化合物浓度范围为 150 nM 至 200 μM。AlphaScreen 检测缓冲液包含 50 mM MOPS、50 mM NaF、0.05 mM CHAPS 和 0.1 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA)，pH 值为 7.4。N 端生物素化共激活肽 SRC1-4 的序列为 QKPTSPGQTPQAQQKSLIQQLLTE。SR-2211 用作阳性对照，用于校准生化实验。 [2]
热稳定性变化分析 (TSA)：所有反应均在含有 10 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM NaCl 和 5% (v/v) 甘油的缓冲液中进行，最终蛋白质浓度为 10 μM，化合物浓度为 200 μM。将 10 μL 反应混合物加入 96 孔 PCR 板中。加入稀释度为 1:1000 的 SYPRO Orange 作为荧光探针，并与化合物在冰上孵育 30 分钟。DMSO 总浓度低于 2%。TSA 使用实时 PCR 系统进行。温度以每分钟 0.5°C 的速率从 30°C 升至 80°C。每隔 0.5°C 记录一次荧光读数。SR-2211 用作阳性对照。 [2]
SR-2211 的体外酶/受体结合试验通常采用放射性配体结合试验，使用 [³H] 标记的 RORγt 配体来测定竞争性结合亲和力 (Ki)。将纯化的 RORγt 配体结合域与不同浓度的 SR-2211 和固定浓度的标记示踪剂孵育，然后通过过滤或闪烁邻近试验分离结合的配体和游离配体。表面等离子共振也可用于测量实时结合动力学。使用包括 RORα、LXRα 和 FXR 在内的相关核受体进行选择性分析，以确认靶标特异性。

Gal4共转染实验：HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。采用1 × 10⁶个细胞接种于6 cm培养皿中，加入3 μg总DNA（受体和报告基因比例为1:1）和转染试剂（DNA与脂质比例为1:3），进行反向转染。次日，将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种于384孔板中。4小时后，用SR2211或DMSO处理细胞。孵育20小时后，通过一步加入检测试剂检测荧光素酶活性，并使用酶标仪读取结果。数据以相对于DMSO处理细胞的倍数变化进行标准化[1]。
全长RORγ报告基因检测（5X-RORE）：使用由5个ROR反应元件重复序列驱动的荧光素酶报告基因（5X-RORE）以及空载体或全长RORγ进行类似的共转染实验[1]。
天然启动子检测（IL-17-Luc）：使用IL-17荧光素酶报告基因和全长RORα或RORγ进行共转染实验，以评估SR2211对天然ROR靶启动子的影响[1]。
EL-4细胞实时PCR分析：将100万个EL-4细胞接种于6孔板中，并用5 μM的SR2211、地高辛或DMSO孵育20小时。随后用 PMA (50 ng/mL) 和离子霉素 (1 μg/mL) 刺激细胞 5 小时。提取 RNA 并合成 cDNA。通过实时 PCR 定量 IL-17A 和 IL-23R 基因表达，并以 GAPDH 的表达进行标准化 [1]。
流式细胞术细胞内细胞因子染色：用 PMA (50 ng/mL) 和离子霉素 (1 μg/mL) 刺激 EL-4 细胞 5 小时。刺激 3 小时后，加入蛋白转运抑制剂继续刺激 2 小时。然后固定细胞，进行透化处理，并用抗 IL-17A 抗体染色。使用流式细胞仪进行细胞分选和分析 [1]。
荧光素酶报告基因检测（用于 RORγ 抑制）：进行此检测是为了测试化合物对 RORγ 转录的活性。 HEK293T细胞与RORγ和荧光素酶报告基因共转染。随后用测试化合物处理细胞20小时，并测定荧光素酶活性。据报道，SR2211的IC₅₀值为0.11 ± 0.03 μM [2]。

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基于细胞的荧光素酶报告基因检测：将293T细胞培养于DMEM培养基中，并使用转染试剂将RORγ表达质粒和含有ROR反应元件的荧光素酶报告质粒转染至细胞中。转染24小时后，将细胞接种于96孔板中，并用不同浓度（150 nM至200 μM）的化合物或DMSO（作为溶剂对照）处理。处理24小时后，裂解细胞，并使用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。 SR-2211用作阳性对照以校准检测。在细胞水平上，SR-2211的IC50为0.11 ± 0.03 μM，最大抑制率为95%。[2]
AlphaScreen检测：详见酶活性检测部分。SR-2211用作阳性对照。[2]
热位移检测：详见酶活性检测部分。SR-2211用作阳性对照。[2]
SR-2211的体外细胞检测通常使用HEK-293或其他哺乳动物细胞，这些细胞转染了Gal4-DNA结合域-RORγt配体结合域融合构建体和在Gal4反应元件控制下的荧光素酶报告基因。将细胞用浓度范围为 0.1 nM 至 10 µM 的 SR-2211 处理 16-24 小时，然后测定荧光素酶活性。反向激动剂活性通过化合物抑制组成型 RORγt 介导的转录的能力来确定，IC50 值由剂量反应曲线计算得出。此外，还采用原代小鼠或人 T 细胞的 Th17 分化实验来评估其功能活性。

SR-2211 的体内动物实验通常采用自身免疫性疾病的小鼠模型。在实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 模型中，C57BL/6 小鼠经髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽免疫后，每日或隔日接受 SR-2211 治疗（通常为 10-50 mg/kg，口服或腹腔注射）。通过临床评分评估疾病严重程度，并检查脊髓切片中的炎症浸润和脱髓鞘情况。采用 ELISA 法检测血清和组织中的细胞因子水平（IL-17、IFN-γ、TNF-α）。在银屑病模型中，局部或全身应用 SR-2211 可减轻皮肤炎症和 Th17 细胞浸润。

SR-2211 具有良好的口服生物利用度和药代动力学特性，适用于体内研究。口服给药后，该化合物在啮齿动物模型中可达到可测量的血浆浓度，其半衰期与每日一次给药方案相符。该化合物经肝酶代谢，其组织分布包括渗透至中枢神经系统等靶器官。临床前研究已对包括 Cmax、AUC 和末端半衰期在内的药代动力学参数进行了表征，以支持疗效和毒性研究的剂量选择。

SR-2211的临床前毒性研究表明，在治疗剂量下具有可接受的安全性。在啮齿动物的重复给药研究中，该化合物耐受性良好，在高达100 mg/kg的剂量下未观察到显著不良反应。该化合物在标准Ames试验或微核试验中均未显示出遗传毒性。靶点相关效应可能包括抑制Th17介导的免疫反应，理论上这可能会增加对某些感染的易感性。然而，总体而言，其安全性足以满足研究应用的需求。

[1]. Identification of SR2211: a potent synthetic RORγ-selective modulator. ACS Chem Biol. 2012 Apr 20;7(4):672-7.

[2]. Identification of N-phenyl-2-(N-phenylphenylsulfonamido)acetamides as new RORγ inverse agonists: Virtual screening, structure-based optimization, and biological evaluation. Eur J Med Chem. 2016 Jun 30;116:13-26.

SR2211 是一种合成的、选择性的 RORγ 反向激动剂/调节剂，可有效抑制细胞中 IL-17 的产生 [1]。
SR2211 的结构为 1,1,1,3,3,3-六氟-2-(2-氟-4-((4-吡啶-4-基甲基)哌嗪-1-基)甲基)-[1,1'-联苯]-4-基)丙-2-醇。 SR2211 是在 SR1001 的基础上，经过多轮构效关系 (SAR) 研究而衍生而来，保留了六氟苯基，同时对左侧部分进行了修饰，用更具亲脂性的基团取代了磺酰胺残基，以期降低其在中枢神经系统的渗透性 [1]。
SR2211 被用作 RORγ 反向激动剂生化测定中的阳性对照 [2]。

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RORγ 是一种核受体，在胸腺中高表达（RORγt 亚型），并在脂肪组织、肝脏、肌肉、胰腺、肾脏、睾丸、前列腺和心脏中显著表达。ROR 在多种生理过程中发挥作用，包括发育、炎症、昼夜节律、脂质代谢、肝糖皮质激素生成和免疫功能。[2]
Th17 细胞产生白细胞介素-17 (IL-17)、IL-17F 和 IL-22； IL-17 的转录由 Th17 特异性转录调节因子 RORα 和 RORγ 介导。鉴于 RORγ 在抑制 IL-17 活性方面发挥着关键作用，它被认为是治疗 Th17 介导的自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症和炎症性肠病）的一个有前景的药物靶点。[2]
SR-2211 是以 T0901317 为先导化合物开发的一系列合成 RORγ 反向激动剂之一。T0901317（一种肝 X 受体激动剂）最初被鉴定为 ROR 反向激动剂。[2]
RORγ 反向激动剂的研发取得了显著进展，目前至少有两种 RORγ 反向激动剂（日本烟草公司的 JTE-151 和 Vitae Pharmaceuticals 公司的 VTP-43742）已进入人体临床试验。 [2] SR-2211 是一种研究化合物，用作化学探针来研究 RORγt 在免疫调节中的功能。它尚未获准用于人体治疗，仅供临床前研究使用。该化合物是一种选择性 RORγt 反向激动剂，Ki 值为 105 nM，IC50 值约为 320 nM。它对 RORα、LXRα 和 FXR 的影响极小，证实了其选择性。SR-2211 广泛用于研究 Th17 细胞在自身免疫性疾病（包括多发性硬化症、银屑病和炎症性肠病）中的作用。

C26H24F7N3O

527.49

527.18

C, 59.20; H, 4.59; F, 25.21; N, 7.97; O, 3.03

1359164-11-6

51035449

Off-white to light brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

552.4±50.0 °C at 760 mmHg

287.9±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.545

4.79

39.6

1

11

6

37

698

0

FC1=C(C2=CC=C(CN3CCN(CC4=CC=NC=C4)CC3)C=C2)C=CC(C(C(F)(F)F)(O)C(F)(F)F)=C1

KVHKWAZUPPBMLL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H24F7N3O/c27-23-15-21(24(37,25(28,29)30)26(31,32)33)5-6-22(23)20-3-1-18(2-4-20)16-35-11-13-36(14-12-35)17-19-7-9-34-10-8-19/h1-10,15,37H,11-14,16-17H2

1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-[3-fluoro-4-[4-[[4-(pyridin-4-ylmethyl)piperazin-1-yl]methyl]phenyl]phenyl]propan-2-ol

SR2211; SR 2211; SR2211; 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-[3-fluoro-4-[4-[[4-(pyridin-4-ylmethyl)piperazin-1-yl]methyl]phenyl]phenyl]propan-2-ol; 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-(3-fluoro-4-(4-((4-(pyridin-4-ylmethyl)piperazin-1-yl)methyl)phenyl)phenyl)propan-2-ol; RefChem:185198; 1359164-11-6; SR-2211

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~189.58 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.74 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。