Sunifiram (DM-235)   中文名称: 舒尼菲拉姆

AMPA receptor;
Sunifiram acts as a positive modulator of AMPA receptors and enhances glycine binding at the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) glycine-binding site. [1]
Modulates NMDAR-mediated synaptic transmission via the glycine-binding site. [2]
Activates calcium/calmodulin-dependent kinase II (CaMKII) and protein kinase C (PKC). [3]

Sunifiram 是一种新型吡咯烷酮益智药，其结构与吡拉西坦类似，后者是为治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病而开发的。为了解答 sunifiram 是否影响海马 CA1 区 N-甲基-D-天冬氨酸受体 (NMDAR) 依赖性突触功能的问题，我们通过电生理学评估了 sunifiram 对 NMDAR 依赖性长期增强 (LTP) 的影响，并通过免疫印迹分析评估了 sunifiram 对突触蛋白磷酸化的影响。在小鼠海马切片中，10-100 nM 的 sunifiram 以钟形剂量反应关系显著增强了 LTP，在 10 nM 时达到峰值。Sunifiram 在 1-1000 nM 的治疗以剂量依赖性方式增加了场兴奋性突触后电位 (fEPSP) 的斜率。这种增强与通过激活 CaMKII 导致的 AMPAR 受体磷酸化增加有关。有趣的是，在基础条件下，sunifiram 处理增加了 PKCα（Ser-657）和 Src 家族（Tyr-416）的活性，其钟形剂量反应曲线与 LTP 的峰值相同，在 10 nM 时达到峰值。7-ClKN 处理可抑制 sunifiram 诱导的 PKCα（Ser-657）和 Src（Tyr-416）磷酸化的增加。sunifiram 引起的 LTP 增强作用被 Src 家族抑制剂 PP2 显著抑制。最后，当用高浓度甘氨酸（300 μM）预处理时，sunifiram 处理无法增强 CA1 区的 LTP。总之，sunifiram 刺激 NMDAR 的甘氨酸结合位点，同时通过 Src 激酶激活 PKCα。 PKCα活性增强会通过激活CaMKII来增强海马LTP。[2]

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在小鼠海马切片中，sunifiram（10-100 nM）以钟形剂量反应关系显著增强长时程增强（LTP），峰值效应在10 nM。该增强作用可被7-氯犬尿喹啉酸（NMDAR甘氨酸结合位点拮抗剂）阻断，但不被艾芬地尔（NMDAR多胺位点抑制剂）抑制。 [2]

OBX 小鼠术后 10 天起每天给药一次 sunifiram (0.01-1.0 mg/kg po)，连续 7-12 天，联合或不联合使用加维斯汀 (10 mg/kg ip)，加维斯汀是 N-甲基-d-天冬氨酸受体 (NMDAR) 的甘氨酸结合位点抑制剂。在 OBX 小鼠中，sunifiram 治疗显著改善了 Y 型迷宫评估的空间参考记忆和新物体识别任务评估的短期记忆。Sunifiram 还恢复了未用加维斯汀治疗的 OBX 小鼠海马 LTP 损伤。相反，sunifiram 治疗并不能改善 OBX 小鼠悬尾任务评估的抑郁行为。值得注意的是，sunifiram 治疗将 OBX 小鼠海马 CA1 区的 CaMKIIα (Thr-286) 自身磷酸化和 GluR1 (Ser-831) 磷酸化恢复到对照小鼠的水平。同样，sunifiram 治疗将 PKCα (Ser-657) 自身磷酸化和 NR1 (Ser-896) 磷酸化改善至对照水平。sunifiram 对 CaMKII 和 PKC 自身磷酸化的刺激通过预先用 gavestinel 治疗而显著抑制。然而，sunifiram 治疗不影响 CaMKIV (Thr-196) 和 ERK 的磷酸化。总之，sunifiram 通过刺激 NMDAR 的甘氨酸结合位点，改善 OBX 引起的记忆相关行为缺陷和海马 CA1 区受损的 LTP。[3]

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DM 232和DM 235/sunifiram是结构上与ampakines相关的新型抗记忆化合物。因此，在体内和体外研究了AMPA受体在DM 232和DM 235作用机制中的作用。在小鼠被动回避试验中，这两种化合物（0.1mg/kg（-1）i.p.）都能够逆转AMPA受体拮抗剂NBQX（30mg/kg（-1，i.p.））诱导的失忆。在有效剂量下，所研究的化合物没有损害运动协调性，如旋转棒试验所示，也没有改变自发运动和检查活动，如孔板试验所示。DM 232和DM 235在大鼠海马切片中进行的犬尿酸试验中逆转了犬尿酸诱导的NMDA介导的[（3）H]NA释放的拮抗作用。NBQX取消了这一影响。DM 232在体外以浓度依赖的方式增加大鼠海马中的兴奋性突触传递。这些结果表明，DM 232和DM 235通过激活AMPA介导的神经传递系统充当认知增强剂。[1]

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阿尔茨海默病（AD）表现为内侧隔膜胆碱能系统的退化，从而导致患者嗅觉功能下调。我们之前报道过，嗅球切除（OBX）小鼠表现出海马依赖性记忆障碍，这是通过记忆相关行为任务和海马长时程增强（LTP）来评估的。在本研究中，我们重点研究了新型吡咯烷酮促智药物桑尼菲拉姆是否能改善OBX小鼠的记忆障碍和抑郁。从术后10天开始，OBX小鼠每天服用一次桑尼菲拉姆（0.01-1.0mg/kg p.o.），持续7-12天，服用或不服用强饲试验（10mg/kg i.p.），强饲试验是N-甲基-d-天冬氨酸受体（NMDAR）的甘氨酸结合位点抑制剂。通过Y迷宫评估的空间参考记忆和通过新物体识别任务评估的短期记忆在OBX小鼠中通过桑尼菲拉姆治疗得到了显著改善。Sunifiram还恢复了未经强饲试验治疗的OBX小鼠海马LTP损伤。相比之下，桑尼菲拉姆治疗并没有改善OBX小鼠尾部悬吊任务评估的抑郁行为。值得注意的是，桑尼菲拉姆治疗使OBX小鼠海马CA1区的CaMKIIα（Thr-286）自磷酸化和GluR1（Ser-831）磷酸化恢复到对照组小鼠的水平。同样，桑尼菲拉姆治疗将PKCα（Ser-657）自磷酸化和NR1（Ser-896）磷酸化提高到对照水平。灌胃试验预处理可显著抑制桑尼菲拉姆对CaMKII和PKC自磷酸化的刺激。然而，桑尼菲拉姆治疗不影响CaMKIV（Thr-196）和ERK的磷酸化。综上所述，桑尼菲拉姆通过刺激NMDAR的甘氨酸结合位点，改善了OBX诱导的记忆相关行为缺陷和海马CA1区LTP受损[3]。

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Sunifiram（0.1 mg/kg 腹腔注射）可逆转AMPA受体拮抗剂NBQX（30 mg/kg 腹腔注射）诱导的小鼠被动回避遗忘症，且不损害运动协调性（转棒试验）或自发活动（洞板试验）。 [1]
在嗅球切除（OBX）小鼠中，每日口服sunifiram（0.01-1.0 mg/kg）7-12天可改善认知缺陷并恢复海马CaMKII/PKC活性。与加维斯替奈（NMDAR甘氨酸位点抑制剂）联用则阻断此效应。 [3]

生化分析[2]
如前所述进行生化分析（Laemmli，1970；Moriguchi等人，2008）。我们使用了如下所列的抗体：抗磷酸化CaMKII（1:5000；Fukunaga等人，2002），抗CaMKII，（1:5000，Fukunaga等，1995），抗磷酸化PKCα（Ser-657）（1:2000），抗PKCα（1:2000 1:2000；Millipore）、抗NR1（1:2000）、抗磷酸化Src家族（Tyr-416）（1:20000）和抗β-微管蛋白（1:5000）。使用增强化学发光检测系统对结合的抗体进行可视化，并使用美国国立卫生研究院图像程序进行半定量分析。

Drugs [DM 232 (unifiram) and DM 235 (sunifiram)] were dissolved in isotonic (NaCl 0.9%) saline solution immediately before use. Drug concentrations were prepared so that the necessary dose could be administered in a volume of 10 ml/kg−1 by i.p. injection for mice. For electrophysiological experiments DM 232 was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and stock solutions were made to obtain concentrations of DMSO of 0.05% and 0.01% in aCSF, respectively. Control experiments, carried out in parallel for an unrelated project, showed that this concentration of DMSO did not affect the amplitude of synaptic potential. [1]

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Electrophysiology [2]
Hippocampal slices were prepared as described previously (Moriguchi et al., 2008). Transverse hippocampal slices (400 μm thick) prepared using a vibratome were incubated for 2 h in continuously oxygenized (95% O2, 5% CO2) artificial cerebrospinal fluid (ACSF) at room temperature. After a 2-h recovery period, slices were transferred to an interface recording chamber and perfused at a flow rate of 2 ml/min with ACSF warmed to 34°C. Field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) were evoked by a 0.05-Hz test stimulus through a bipolar stimulating electrode placed on the Schaffer collateral/commissural pathway and recorded from the stratum radiatum of CA1 region using a glass electrode filled with 3 M NaCl. High-frequency stimulation (HFS) of 100 Hz with a 1-s duration was applied twice with a 10-s interval and test stimulation was continued for the indicated periods. After recording, slices were transferred to a plastic plate cooled on ice to dissect out the CA1 areas. CA1 regions were frozen in liquid nitrogen and stored at –80°C until biochemical analysis was performed.

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Operation [3]
OBX mice were prepared as describe previously [30]. Mice were treated once a day for 7–12 days with sunifiram or sunifiram plus gavestinel starting at 10 days after OBX operation. Behavioral tests were performed at 7–8 days treatment with sunifiram (p.o.) or sunifiram plus gavestinel (i.p.) and electrophysiological and biochemical experiments were performed 9–12 days after sunifiram or sunifiram plus gavestinel treatments. OBX-operated mice had no stereotype killing behavior at least until 3 weeks after operation. However, aggressive behavior without killing behavior was observed in several mice. In the present study, we did not use the aggressive mice separated after OBX surgery for experiment. We breed 3 or 4 mice in each cage and treated the same drug. All animals were sacrificed at the end of experiment and the lesions were verified histologically.

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Drug treatment [3]
Sunifiram was dissolved in (CMC) and administered orally (p.o.) using metal gastric zonde. The dose or volume of injection of sunifiram was 0.1 or 1.0 mg/kg in a volume of 1 ml/100 g body weight. We compared both sunifiram treatment mice and CMC treatment mice (vehicle). Gavestinel was dissolved in tap water and administered intraperitoneal injection (i.p.). The dose or volume of injection of gavestinel was 10 mg/kg. We compared both gavestinel treatment and tap water treatment (vehicle).

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Passive avoidance test: Mice received sunifiram (0.1 mg/kg) or vehicle via intraperitoneal (i.p.) injection 30 minutes before NBQX (30 mg/kg i.p.). Memory retention was assessed 24 hours after foot-shock training. [1]
Olfactory bulbectomy model: OBX mice were orally administered sunifiram (0.01, 0.1, or 1.0 mg/kg) once daily for 7-12 days post-surgery. Behavioral tests (e.g., object recognition) and biochemical analyses (CaMKII/PKC activation in hippocampus) were performed. [3]
Hippocampal LTP study: Mice were sacrificed, and hippocampal slices were treated with sunifiram (10-100 nM) in artificial cerebrospinal fluid. Field excitatory postsynaptic potentials (fEPSPs) were recorded to assess synaptic efficacy. [2]

[1]. AMPA-receptor activation is involved in the antiamnesic effect of DM 232 (unifiram) and DM 235 (sunifiram). Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2003 Dec;368(6):538-45.

[2]. Novel nootropic drug sunifiram enhances hippocampal synaptic efficacy via glycine-binding site of N-methyl-D-aspartate receptor. Hippocampus. 2013 Oct;23(10):942-51.

[3]. Novel nootropic drug sunifiram improves cognitive deficits via CaM kinase II and protein kinase C activation in olfactory bulbectomized mice. Behav Brain Res. 2013 Apr 1;242:150-7.

苏尼芬是一种新型吡咯烷酮类促智药，其结构与吡拉西坦类似，后者最初是为治疗阿尔茨海默病等神经退行性疾病而开发的。已知苏尼芬在某些行为学实验（例如莫里斯水迷宫实验）中能够增强认知功能。为了探究苏尼芬是否影响海马CA1区N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）依赖性突触功能，我们通过电生理学方法评估了苏尼芬对NMDAR依赖性长时程增强（LTP）的影响，并通过免疫印迹分析检测了其对突触蛋白磷酸化的影响。在小鼠海马切片中，浓度为10-100 nM的苏尼芬显著增强了LTP，其剂量反应呈钟形曲线，并在10 nM时达到峰值。舒尼拉姆增强长时程增强作用（LTP）可被NMDAR甘氨酸结合位点拮抗剂7-氯犬尿酸（7-ClKN）抑制，但不受NMDAR多胺结合位点抑制剂伊芬普罗地尔的影响。舒尼拉姆增强LTP与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）激活导致α-氨基-3-羟基-5-甲基异唑-4-丙酸受体（AMPAR）磷酸化水平升高以及蛋白激酶Cα（PKCα）激活导致NMDAR磷酸化水平升高有关。浓度为1-1000 nM的舒尼拉姆可剂量依赖性地增加场兴奋性突触后电位（fEPSP）的斜率。这种增强作用与CaMKII激活导致AMPAR受体磷酸化水平升高有关。有趣的是，在基础条件下，sunifram 处理可增加 PKCα (Ser-657) 和 Src 家族 (Tyr-416) 的活性，其剂量反应曲线与 LTP 的曲线呈相同的钟形，峰值浓度为 10 nM。sunifram 诱导的 PKCα (Ser-657) 和 Src (Tyr-416) 磷酸化水平的升高可被 7-ClKN 处理抑制。Src 家族抑制剂 PP2 可显著抑制 sunifiram 增强 LTP 的作用。最后，当预先用高浓度甘氨酸 (300 μM) 处理时，sunifram 处理无法增强 CA1 区的 LTP。综上所述，sunifram 通过 Src 激酶激活 PKCα，并刺激 NMDAR 的甘氨酸结合位点。 PKCα活性的增强可通过激活CaMKII来增强海马长时程增强（LTP）。[2]这是首篇报道，表明促智药舒尼拉明（sunifriam）可通过刺激NMDAR的甘氨酸结合位点来增强海马LTP。甘氨酸结合位点存在于NR1亚基中（Wafford等人，1995），是阿尔茨海默病（AD）药物的理想靶点。例如，NMDAR甘氨酸结合位点的配体，如甘氨酸前药米拉西米（milacemide）和部分甘氨酸激动剂D-环丝氨酸（D-cycloserine），已在AD患者中进行临床试验（Schwartz等人，1991，1996；Dysken等人，1992）。此外，已知部分甘氨酸激动剂D-环丝氨酸和甘氨酸前药米拉西米能够改善老年大鼠的记忆缺陷（Hanndelmann等，1989；Baxter等，1994）。我们此前报道过，另一种促智药奈非拉西坦能够通过大鼠皮层神经元中NMDAR的甘氨酸结合位点增强突触传递（Moriguchi等，2003）。我们假设激活NMDAR的甘氨酸结合位点能够改善阿尔茨海默病患者的认知功能和记忆缺陷。在本研究中，我们阐明了舒尼拉姆通过NMDAR的甘氨酸结合位点增强长时程增强（LTP）的精确分子机制。舒尼拉姆增强的LTP呈现钟形剂量反应关系，峰值浓度为10 nM。在CA1区，PKCα（Ser-657）自磷酸化和NR1（Ser-896）磷酸化的钟形增加与舒尼拉明诱导的LTP呈钟形增强密切相关。PKC介导的NR1磷酸化增加对于LTP增强至关重要，因为NR1磷酸化可上调NMDAR功能（Tingley等，1993）。此外，Src激酶Tyr-416磷酸化的增强以及伴随的NR2B（Tyr-1472）磷酸化增加也与舒尼拉明诱导的LTP呈钟形增强相关。NR2B（Tyr-1472）位点可被Src家族酪氨酸激酶（如Fyn）磷酸化（Nakazawa等，2001）。 Src激酶通过PKC依赖性酪氨酸激酶被NMDAR刺激激活（Kelso等，1992；Luttrell等，1996；Della Rocca等，1997），并且足以诱导LTP（Lu等，1998）。有趣的是，在海马CA1切片中用Src家族抑制剂PP2处理后，PKCα（Ser-657）的自磷酸化和Src家族（Tyr-416）的磷酸化均未能被舒尼拉姆增强。此外，PP2处理也抑制了舒尼拉姆在CA1中对LTP的增强作用。我们的数据表明，PKC 和 Src 的激活应该是 NMDAR 甘氨酸位点受到刺激后的下游事件。
我们发现，舒尼拉姆以剂量依赖的方式（1–1000 nM）通过激活 AMPAR 增强 CA1 区的 fEPSP。Galeotti 等人 (2003) 报道，舒尼拉姆通过激活 AMPAR 改善认知功能。事实上，其他促智药也能直接激活 AMPAR 的功能（Ito 等人，1990；Galeotti 等人，2003；Moriguchi 等人，2003）。高浓度促智化合物对 L 型 Ca2+ 通道和 AMPAR 的激活可能由 CaMKII 活性介导（Yoshii 等人，1997）。事实上，高浓度的奈非拉西坦可通过增加皮层中CaMKII的活性来增强AMPA受体的功能（Moriguchi等，2003）。在本研究中，舒尼拉明增强AMPA受体的功能可能也是通过增加CaMKII的活性实现的。
我们还发现，NR1的PKC依赖性磷酸化促进了舒尼拉明在CA1区增强NMDA受体的功能。PKCα（Ser-657）自身磷酸化和NR1（Ser-896）磷酸化的钟形增加与舒尼拉明引起的LTP的钟形增强密切相关。舒尼拉明激活PKCα（Ser-657）可触发NMDA受体功能的增强，因为PKCα（Ser-657）可磷酸化NMDA受体NR1亚基的Ser-896（Tingley等，1997）。然而，目前尚不清楚舒尼拉姆激活NMDAR功能和增强LTP的钟形剂量反应曲线背后的机制。
阿尔茨海默病（AD）与脑内胆碱能和谷氨酸能活性的下调有关（Greenamyre等，1987；Giacobini，2000）。近年来，临床上尝试使用抗胆碱酯酶药物（如多奈哌齐、加兰他敏和利伐斯的明）来增强胆碱能系统，并使用抗NMDAR药物（如美金刚）来发挥神经保护作用。本研究发现，舒尼拉姆通过作用于海马中NMDAR的甘氨酸结合位点，有效增强NMDAR依赖性LTP。此外，包括舒尼拉姆在内的促智药可增加大鼠脑内乙酰胆碱的释放（Manetti等，2000）。我们的假设是，舒尼芬增强胆碱能和谷氨酸能活性似乎可以改善阿尔茨海默病患者的认知缺陷。
总之，本研究表明，舒尼芬治疗通过NMDAR的甘氨酸结合位点显著增强海马长时程增强（LTP）。舒尼芬通过激活PKCα和Src激酶来刺激NMDAR的甘氨酸结合位点。PKCα活性的增强通过CaMKII介导的NMDAR激活来增强海马LTP。舒尼芬增强海马LTP是改善阿尔茨海默病患者认知和记忆缺陷的基础。[2]

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舒尼芬是一种哌嗪类衍生的安帕卡因样促智药，其效力显著高于吡拉西坦。其认知增强作用涉及AMPA受体激活和NMDAR甘氨酸结合位点调节，从而增强突触可塑性和长时程增强作用（LTP）。[1][2]
从机制上讲，苏尼菲仑激活海马中的CaMKII和PKC通路，这些通路对记忆形成至关重要。这种激活依赖于谷氨酸能传递和NMDAR甘氨酸结合位点的结合。[3]
在有效剂量（0.01-0.1 mg/kg）下，未观察到运动协调障碍或自发活动改变。[1][3]

C14H18N2O2

246.31

246.136

C, 68.27; H, 7.37; N, 11.37; O, 12.99

314728-85-3

4223812

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

442.0±38.0 °C at 760 mmHg

205.0±19.1 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.561

0.26

40.62

0

2

2

18

303

0

CCC(=O)N1CCN(CC1)C(=O)C2=CC=CC=C2

DGOWDUFJCINDGI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H18N2O2/c1-2-13(17)15-8-10-16(11-9-15)14(18)12-6-4-3-5-7-12/h3-7H,2,8-11H2,1H3

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 50 mg/mL (203.00 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。