Sweroside   中文名称: 獐牙菜苷

Natural product; anti-osteoporotic, cytoprotective, and hepatoprotective effects
- Sweroside modulates melanogenesis by activating Akt and extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) signaling pathways, leading to decreased MITF (microphthalmia-associated transcription factor) expression, which in turn downregulates tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 [2].

在筛选黑色素生成抑制剂的过程中，从金银花（Lonicera japonica）中分离得到苦参苷（sweroside）。通过质谱和核磁共振分析等光谱分析方法确定了其化学结构。苦参苷在300μM浓度下能有效抑制melan-a细胞的黑色素生成，且无细胞毒性。此外，苦参苷还能降低melan-a细胞中酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 (TRP-1) 和TRP-2的表达。为了探究苦参苷的信号通路，我们研究了苦参苷对Akt和细胞外信号调节激酶 (ERK) 激活的影响。结果表明，苦参苷以剂量依赖的方式诱导Akt和ERK的激活。此外，分别使用特异性抑制剂LY294002和U0126研究了Akt和ERK信号通路的特异性抑制，结果表明其可导致黑色素合成增加。[2]

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通过与右泛醇在培养的鸡胚成纤维细胞上的比较，评估了龙胆（Gentiana lutea ssp. symphyandra）提取物及其主要成分龙胆苦苷、苦参苷和苦参碱（化合物1-3）的伤口愈合特性。同时，采用高效液相色谱法（HPLC）分析了提取物的成分。将受精卵中的鸡胚成纤维细胞与植物提取物及其成分化合物1-3一起孵育。利用显微镜观察培养的成纤维细胞的有丝分裂能力、形态变化和胶原蛋白生成情况，并以此作为评价指标。龙胆的伤口愈合活性似乎主要归因于化合物 2 和 3 分别促进胶原蛋白生成和有丝分裂活性（所有情况下 p < 0.005）。这三种化合物均表现出细胞保护作用，这可能对龙胆的伤口愈合活性产生协同作用。这些发现证实了龙胆的伤口愈合活性，而此前的报道仅基于民族医学数据[1]。

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- 在培养的鸡胚成纤维细胞中，浓度为 0.4 μg/mL 的龙胆苷（化合物 2）可使成纤维细胞总数略有增加（与 DMSO 对照组相比，p<0.10），而浓度为 2 μg/mL 时则无效（p>0.10）。它对有丝分裂活性没有显著影响（两种浓度下 p>0.10）。在浓度为 0.4 μg/mL 时，Sweroside 显著增加了多边形成纤维细胞的比例 (p<0.005)，在浓度为 2 μg/mL 时也增加了多边形细胞的比例 (p<0.05)。仅在浓度为 2 μg/mL 时，它才略微降低了梭形细胞的比例 (p<0.10)。在所有测试化合物中，Sweroside 对胶原蛋白的生成表现出最强的作用，使成纤维细胞中胶原蛋白颗粒的数量增加了 8 倍以上 (0.4 μg/mL 时 p<0.005，2 μg/mL 时 p<0.01)。它还显著降低了含液泡细胞和圆形细胞的百分比（分别为 p<0.005 和 p<0.01）[1]。
- 在 melan-a 小鼠黑素细胞中，浓度高达 300 μM 的 Sweroside 未显示出明显的细胞毒性。它以剂量依赖的方式显著降低了黑色素含量（0–300 μM，与对照组相比，p<0.01 和 p<0.001）。Western blot 分析显示，Sweroside 以剂量依赖的方式降低了酪氨酸酶、TRP-1 和 TRP-2 的蛋白表达（300 μM 时与未处理组相比，p<0.001）。 Sweroside 可剂量依赖性地增加 Akt 的磷酸化水平 (p-Akt)（300 μM 时 p<0.001），并略微增加 p-ERK 水平，同时以剂量依赖的方式显著降低 MITF 蛋白的表达（100 μM 时 p<0.01，300 μM 时 p<0.001，与未处理组相比）。特异性 Akt 抑制剂 LY294002 和 ERK 抑制剂 U0126 可逆转 Sweroside 对黑色素合成和 MITF 表达的抑制作用，证实 Sweroside 通过 Akt 和 ERK 通路发挥作用 [2]。

在斑马鱼体内模型中，苦参苷表现出对体色色素沉着和酪氨酸酶活性的抑制作用。这些结果表明，从日本苦参（L. japonica）中分离得到的苦参苷可能通过调节MAP激酶和黑色素生成酶的表达而成为一种有效的皮肤美白剂[2]。

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- 在斑马鱼（Danio rerio）模型中，将不同浓度的苦参苷添加到受精后9至72小时（hpf）的胚胎培养基中。立体显微镜观察显示，苦参苷呈剂量依赖性地减少了斑马鱼胚胎上的黑色素斑点数量。从整个胚胎提取物（受精后9至35小时处理）中测得的总黑色素含量被苦参苷显著降低（与对照组相比，p<0.01和p<0.001）。从斑马鱼胚胎（受精后9至48小时处理）中测得的酪氨酸酶活性也因Sweroside处理而显著降低（与对照组相比，p<0.01和p<0.001）。在所测试的浓度下，超过95%的斑马鱼在Sweroside处理后存活[2]。

化合物处理及基于表型的评估[2]
收集同步化胚胎，并用移液器将其排列在24孔板中（每孔7-9个胚胎，每孔含1 ml胚胎培养基）。将测试化合物溶解于0.1% DMSO溶液中，然后在受精后9至72小时（hpf）加入胚胎培养基中（暴露63小时）。在体视显微镜下观察化合物对斑马鱼色素沉着的影响。每日进行少量搅拌并更换培养基，以确保化合物均匀分布。在所有实验中，均使用0.1 mM PTU处理斑马鱼，使其在不干扰发育过程的情况下获得透明斑马鱼，作为标准阳性对照。基于表型的体色评估方法如下：用镊子去除卵膜，用甲磺酸三卡因溶液麻醉，将胚胎置于35 mm培养皿（35 × 10 mm）中，并用3%甲基纤维素固定，然后在MZ16立体显微镜下拍照。

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- 测定斑马鱼胚胎中的酪氨酸酶活性。将约100个斑马鱼胚胎在受精后9至48小时用Sweroside处理，然后在蛋白提取液中进行超声处理。裂解液经10,000 g离心5分钟澄清。蛋白质定量后，取250 μg总蛋白与100 μL 5 mM L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）混合。对照孔中含有100 μL裂解缓冲液和100 μL 5 mM L-DOPA。在 37 °C 下孵育 60 分钟后，使用微孔板读数仪在 475 nm 处测量吸光度 [2]。

细胞培养[2]
Melan-a 黑素细胞是一种高度色素沉着的永生化正常小鼠黑素细胞系，来源于 C57BL/6 小鼠。本研究中使用的 Melan-a 细胞由 Dorothy Bennett 博士提供。细胞在 37 °C、95% 空气、5% CO₂ 的条件下，于添加了 10% 热灭活胎牛血清、1% 青霉素/链霉素和 200 nM 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯的 RPMI 1640 培养基中培养。细胞活力采用 CCK-8 细胞计数试剂盒测定。汇合的单层黑素细胞用 0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA 的混合液进行消化收集。

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黑色素含量测定[2]
将Melan-a细胞用化合物处理72小时后，在60℃下用1 N NaOH溶解细胞30分钟。然后，使用分光光度计在450 nm处测量裂解液的吸光度。数据根据细胞裂解液的蛋白质含量进行标准化。随后，使用BCA蛋白测定试剂盒测定细胞裂解液的蛋白质浓度。

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蛋白质印迹分析[2]
用含150 mM NaCl的10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）（PBS）洗涤Melan-a细胞一次，然后在含0.1% SDS和10 mM巯基乙醇的PBS中裂解细胞。将裂解液上样至10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶。根据制造商的说明，使用mini-Protean系统将凝胶中的蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜上。然后用含0.1% Tween-20的10 mM Tris缓冲盐溶液（TBS，pH 7.2）（TBS-T）洗涤膜一次，再用含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭1小时。除非另有说明，一抗稀释度为1:1000，并在4℃孵育过夜。最后，用TBS-T缓冲液洗涤膜三次，每次10分钟。将膜与稀释度为 1:3000 的 HRP 标记二抗（溶于 TBS-T 缓冲液）于室温孵育 1 小时，用 TBS-T 缓冲液洗涤 3 次，每次 3 分钟，然后使用 ECL 化学发光试剂盒显色。

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- 鸡胚成纤维细胞：将受精鸡卵在 38.5 °C 下孵育 8 天。使用细胞分离筛将胚胎解离，并用胰蛋白酶消化后分离成纤维细胞。将细胞培养于添加了葡萄糖、NaHCO₃、谷氨酰胺、青霉素、链霉素、酚红和胎牛血清的 DMEM 培养基中。将 Sweroside（化合物 2）溶解于 DMSO 中，并以 0.4 和 2 μg/mL 的浓度加入培养基中。孵育后，使用 Masson 三色染色法对细胞进行染色。在400倍和800倍光学显微镜下进行形态计量分析，以评估细胞总数、有丝分裂细胞数、多边形/梭形/圆形细胞百分比、含空泡细胞数和胶原颗粒数。每个实验重复5次或10次，具体重复次数见参考文献[1]。
- Melan-a细胞（小鼠黑素细胞）：将Melan-a细胞在37℃、10% CO₂气氛下，使用添加了10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/链霉素和200 nM 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯的RPMI 1640培养基进行培养。用不同浓度的Sweroside（0–300 μM）处理后，使用CCK-8法评估细胞活力。为了测定黑色素含量，将细胞用Sweroside处理72小时，然后在60℃下用1 N NaOH溶解30分钟，并在450 nm处测量吸光度。蛋白质浓度使用BCA法进行标准化。对于蛋白质印迹分析，细胞用Sweroside处理12小时（用于Akt/ERK/MITF检测）或72小时（用于酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2检测），然后在含有0.1% SDS和10 mM β-巯基乙醇的PBS缓冲液中裂解，并通过10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜上，并用一抗（抗酪氨酸酶、抗TRP-1、抗TRP-2、抗磷酸化Akt、抗Akt、抗磷酸化ERK、抗ERK、抗MITF）进行孵育，随后用HRP标记的二抗进行孵育。最后使用ECL试剂盒进行检测。在抑制剂研究中，细胞先用 20 μM LY294002（Akt 抑制剂）或 10 μM U0126（ERK 抑制剂）预处理 1 小时，然后加入 300 μM Sweroside 处理 12 小时，之后进行蛋白质印迹分析 [2]。

斑马鱼酪氨酸酶活性和黑色素含量[2]
采用分光光度法测定酪氨酸酶活性。简而言之，将约100个斑马鱼胚胎在受精后9至48小时用苦参苷处理，并在Pro-Prep蛋白提取液中进行超声破碎。裂解液经10,000g离心5分钟澄清。定量后，加入250 μg总蛋白，随后加入100 μl 5 mM L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）。对照孔包含100 μl裂解缓冲液和100 μl 5 mM L-DOPA。在37 °C孵育60分钟后，使用微孔板检测器在475 nm处测量吸光度。为了测定黑色素含量，简而言之，将约100个斑马鱼胚胎在受精后9至35小时（hpf）用苦参苷处理，并在Pro-Prep蛋白提取液中进行超声处理。离心后，将沉淀物溶解于500 μl 1 N NaOH溶液中，并在100 °C下加热10分钟。然后将混合物剧烈涡旋以溶解黑色素。在490 nm波长下测量上清液的光密度。斑马鱼色素沉着测定：将成年斑马鱼饲养于28.5 °C，光照/黑暗周期为14/10小时。在开灯后30分钟内从自然产卵中获取胚胎。将同步化的胚胎（24孔板，每孔7-9个，每孔含1 mL胚胎培养基）在受精后9至72小时（hpf）用溶于0.1% DMSO的Sweroside处理，以观察色素沉着情况。每日更换培养基以确保化合物均匀分布。阳性对照组用0.2 mM 1-苯基-2-硫脲（PTU）处理。处理结束后，用三卡因甲磺酸盐溶液麻醉胚胎，将其固定在3%甲基纤维素溶液中，置于35 mm培养皿上，并在体视显微镜（MZ16）下拍照[2]。

- 在黑素细胞中，浓度高达 300 μM 的 Sweroside 未显示出明显的细胞毒性作用，CCK-8 检测结果证实了这一点 [2]。
- 在斑马鱼中，超过 95% 的胚胎在所用浓度的 Sweroside 处理后存活（未报告具体的致死剂量）[2]。
- 未提供关于肝毒性、肾毒性、药物相互作用、血浆蛋白结合或 LD50 的信息 [1][2]。

[1]. Effects of gentiopicroside, sweroside and swertiamarine, secoiridoids from gentian (Gentiana lutea ssp. symphyandra), on cultured chicken embryonic fibroblasts. Planta Med. 2006 Mar;72(4):289-94.

[2]. Modulation effects of sweroside isolated from the Lonicera japonica on melanin synthesis. Chem Biol Interact. 2015 Aug 5;238:33-9.

苦参苷是一种糖苷。据报道，它存在于大叶龙胆（Gentiana macrophylla）、糙龙胆（Gentiana scabra）以及其他具有相关数据的生物体中。另见：金银花（部分）；野桐（Mallotus trifoliata）（部分）；矢车菊（Cornflower）、红花（部分）。

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- 苦参苷是一种裂环烯醚萜类糖苷，其吡喃环的C-1位连接着一个葡萄糖基。据报道，它具有保肝、抗菌、抗真菌、抗骨质疏松和抗过敏活性[2]。
- 在鸡胚成纤维细胞伤口愈合模型中，苦参苷是所测试的裂环烯醚萜类化合物中刺激胶原蛋白生成作用最强的（增加8倍以上），并且它还通过减少含液泡细胞和圆形细胞显示出细胞保护作用。这些研究结果表明，龙胆苷可能通过与其他环烯醚萜类化合物（龙胆苦苷和龙胆苦苷）的协同作用，促进龙胆提取物的伤口愈合[1]。在抑制黑色素生成方面，龙胆苷通过激活Akt和ERK信号通路发挥作用，导致MITF磷酸化和降解，进而下调酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2的表达。使用特异性抑制剂LY294002（Akt）和U0126（ERK）证实了这一机制，这两种抑制剂逆转了龙胆苷的抗黑色素生成作用。该化合物还能减少斑马鱼体内的色素沉着，表明其具有作为天然美白剂治疗色素沉着过度疾病的潜力[2]。

C16H22O9

358.3405

358.126

C, 53.63; H, 6.19; O, 40.18

14215-86-2

161036

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

630.3±55.0 °C at 760 mmHg

100 °C

231.8±25.0 °C

0.0±4.2 mmHg at 25°C

1.602

Gentiana macrophylla; Gentiana algida; Lonicera japonica

-2.81

134.91

4

9

4

25

548

8

O([C@@]1([H])[C@]([H])(C([H])=C([H])[H])[C@@]2([H])C(C(=O)OC([H])([H])C2([H])[H])=C([H])O1)[C@@]1([H])[C@@]([H])([C@]([H])([C@@]([H])([C@@]([H])(C([H])([H])O[H])O1)O[H])O[H])O[H]

VSJGJMKGNMDJCI-ZASXJUAOSA-N

InChI=1S/C16H22O9/c1-2-7-8-3-4-22-14(21)9(8)6-23-15(7)25-16-13(20)12(19)11(18)10(5-17)24-16/h2,6-8,10-13,15-20H,1,3-5H2/t7-,8+,10-,11-,12+,13-,15+,16+/m1/s1

(3S,4R,4aS)-4-ethenyl-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,4a,5,6-tetrahydro-3H-pyrano[3,4-c]pyran-8-one

(−) Sweroside; (−)-Sweroside; 1,9-trans-9,5-cis-Sweroside

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~279.06 mM)
H2O : ~50 mg/mL (~139.53 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 100 mg/mL (279.06 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。