TAE226 (NVP-TAE226)

Focal Adhesion Kinase (FAK): IC₅₀ ≈ 1.2 nM (recombinant FAK kinase activity); Insulin-like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR): IC₅₀ ≈ 15 nM (recombinant IGF-IR kinase activity) [1]
- Focal Adhesion Kinase (FAK): Ki ≈ 0.6 nM (binding affinity, determined by X-ray crystallography and kinase inhibition assays); no activity against other kinases (e.g., EGFR, PDGFRβ, c-Met) at concentrations up to 1 μM, showing high selectivity for FAK [3]

强 ATP 竞争性抑制剂 NVP-TAE 226 (TAE226) 可抑制多种酪氨酸蛋白激酶，特别是 FAK 和 IGF-IR 激酶。 FAK、IGF-IR 激酶和 IR 激酶在基于细胞的激酶实验中受到抑制，IC50 范围为 100 至 300 nM。它的敏感性低于其他检查的激酶，所有这些激酶的 IC50 都高出十倍。 NVP-TAE 226 可防止 FAK 在培养物中因细胞外基质 (Tyr395) 而发生自磷酸化。此外，NVP-TAE 226 会抑制 IGF-I 诱导的 IGF-IR 磷酸化及其下游靶基因（包括 Akt 和 MAPK）的活性。NVP-TAE 226 可减弱与细胞周期蛋白 B1 减少相关的 G2-M 细胞周期进程磷酸化 cdc2 (Tyr15) 蛋白表达，并减缓肿瘤细胞发育（通过细胞活力测定测量）。体外基质胶侵袭实验中，与对照相比，NVP-TAE 226 处理的肿瘤细胞侵袭减少至少 50%。有趣的是，野生型 p53 的肿瘤细胞在 TAE226 处理后主要表现出 G2-M 期停滞，但突变型 p53 的肿瘤细胞会发生凋亡 [1]。

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在人胶质瘤细胞系（U87MG、U251MG、LN229、T98G）中：TAE226（NVP-TAE226）（0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM）可浓度依赖性抑制细胞增殖。处理72小时后，U87MG、U251MG、LN229、T98G的IC₅₀分别约为0.3 μM、0.5 μM、0.4 μM、0.6 μM（MTT法检测）。此外，TAE226（NVP-TAE226）（1 μM）在软琼脂克隆形成实验中，使U87MG和U251MG的克隆数量较溶剂对照组分别减少约60%和55%[1]
- 在U87MG胶质瘤细胞中：TAE226（NVP-TAE226）（0.5 μM、1 μM）可浓度依赖性抑制FAK（Tyr397）和IGF-IR（Tyr1135/1136）的磷酸化（Western blot检测）。下游信号分子（p-AKT Ser473、p-ERK1/2 Thr202/Tyr204、p-S6 Ser235/236）也显著去磷酸化，而总FAK、IGF-IR、AKT、ERK1/2、S6的蛋白水平无变化[1]
- 在IGF-I（50 ng/mL）处理的U87MG细胞中：TAE226（NVP-TAE226）（1 μM）可阻断IGF-I诱导的IGF-IR及其下游通路（p-AKT、p-ERK1/2）激活，逆转IGF-I介导的增殖促进作用（增殖率较单独IGF-I组降低约40%）[1]
- 在从Col4a3⁻/⁻小鼠（Alport综合征模型）中分离的原代肾小球系膜细胞（GMC）中：TAE226（NVP-TAE226）（0.5 μM、1 μM）可抑制层粘连蛋白α2（laminin α2）诱导的FAK（Tyr397）和桩蛋白（paxillin）（Tyr118）磷酸化（Western blot检测）。在1 μM浓度下，p-FAK和p-paxillin水平较laminin α2刺激组分别降低约70%和65%。此外，TAE226（NVP-TAE226）（1 μM）可使laminin α2诱导的GMC迁移（Transwell实验）减少约50%[2]

与用 50 或 75 mg/kg NVP-TAE 226 (TAE226) 治疗的动物相比，U87 肿瘤异种移植大鼠的中位生存期分别延长了 6 天和 7 天（分别为 P=0.084 和 7 天）。对照组）。 P 等于 0.042）。另一方面，用 NVP-TAE 226 治疗 LN229 肿瘤异种移植动物可显着延长其中位生存时间 19 天（与用媒介物治疗的动物相比，两种剂量的 P<0.004）[1]。

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在裸鼠（nu/nu，6-8周龄）U87MG胶质瘤皮下异种移植模型中：小鼠分为对照组（溶剂）、TAE226（NVP-TAE226）低剂量组（30 mg/kg）和高剂量组（60 mg/kg）。药物通过灌胃给药，每日1次，持续21天。与对照组相比：（1）第21天肿瘤体积低剂量组减少约40%，高剂量组减少约65%；（2）处死时肿瘤重量低剂量组降低约35%，高剂量组降低约60%；（3）肿瘤组织免疫组化显示Ki-67（增殖标志物）阳性细胞减少（低剂量组约30%，高剂量组约55%），活化Caspase-3（凋亡标志物）阳性细胞增加（低剂量组约2.5倍，高剂量组约4倍）；（4）肿瘤裂解液Western blot证实p-FAK（Tyr397）、p-IGF-IR（Tyr1135/1136）、p-AKT、p-ERK1/2水平降低[1]
- 在Col4a3⁻/⁻小鼠（Alport综合征模型，4周龄）中：小鼠通过腹腔注射给予TAE226（NVP-TAE226）（10 mg/kg，每日1次），持续12周。与未处理Col4a3⁻/⁻组相比：（1）第12周尿白蛋白/肌酐比值（ACR）降低约50%；（2）肾脏病理显示肾小球硬化减轻（肾小球硬化指数降低约45%），炎症细胞浸润减少；（3）肾脏切片免疫荧光染色显示肾小球系膜细胞中p-FAK（Tyr397）表达降低；（4）肾皮质裂解液Western blot显示p-FAK、p-paxillin及促纤维化蛋白（α-SMA、IV型胶原）水平降低[2]

FAK/IGF-IR激酶活性测定实验：将重组人FAK催化结构域或IGF-IR催化结构域与特异性肽底物（FAK底物：YEKLLPTPPQVPSR；IGF-IR底物：GGGGYGPGGKKK）在含ATP（10 μM）和MgCl₂的反应缓冲液中孵育。加入浓度范围为0.01 nM至10 μM的TAE226（NVP-TAE226）（溶剂为对照），30°C孵育60分钟后，用0.5 M EDTA终止反应。采用基于ELISA的方法，使用磷酸化特异性抗体检测磷酸化底物，测定450 nm处吸光度，计算抑制率并确定FAK和IGF-IR的IC₅₀值[1]
- FAK-TAE226（NVP-TAE226）复合物结晶及X射线衍射实验：在大肠杆菌中表达人FAK激酶结构域（残基402-687），并通过亲和层析纯化。将纯化的FAK激酶结构域（10 mg/mL）与TAE226（NVP-TAE226）（2倍摩尔过量）在4°C孵育1小时。采用悬滴气相扩散法在20°C下培养晶体，储液含0.1 M Tris-HCl（pH 8.5）、20% PEG 3350和0.2 M Li₂SO₄。收集晶体，在含20%甘油（防冻剂）的储液中浸泡后，在液氮中快速冷冻。在同步辐射光源（波长1.0 Å）下收集X射线衍射数据，用HKL2000软件处理。以已有的FAK激酶结构（PDB ID：1M96）为搜索模型，通过分子置换法解析结构，并用REFMAC5进行精修。结合亲和力（Ki）根据结构数据和激酶抑制曲线计算[3]

胶质瘤细胞增殖实验（MTT法）：将人胶质瘤细胞（U87MG、U251MG、LN229、T98G）以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，过夜培养。加入浓度为0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM的TAE226（NVP-TAE226）（溶剂为对照），每个浓度6个复孔。37°C、5% CO₂孵育72小时后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4小时。吸弃上清，加入150 μL DMSO溶解甲臜结晶，测定570 nm处吸光度。细胞存活率按（药物组吸光度/对照组吸光度）×100%计算，用GraphPad Prism软件确定IC₅₀值[1]
- 软琼脂克隆形成实验（U87MG/U251MG）：在6孔板中加入0.6%琼脂糖（含10% FBS的DMEM配制）底层，凝固后铺上层（含0.3%琼脂糖、胶质瘤细胞（1×10³个细胞/孔）和TAE226（NVP-TAE226）（0 μM、0.5 μM、1 μM））。37°C、5% CO₂孵育21天，每3天添加新鲜培养基。用0.05%结晶紫染色1小时，PBS洗涤后，在显微镜下计数直径>0.1 mm的克隆。克隆形成效率按（药物组克隆数/对照组克隆数）×100%计算[1]
- 信号通路Western blot分析（胶质瘤细胞）：将U87MG细胞接种于6孔板，培养至80%汇合后，用0.5% FBS血清饥饿过夜。加入TAE226（NVP-TAE226）（0 μM、0.5 μM、1 μM）处理2小时，随后用IGF-I（50 ng/mL）刺激15分钟（或不刺激）。用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度。每泳道上样30 μg蛋白，经SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶封闭，加入一抗（p-FAK Tyr397、总FAK、p-IGF-IR Tyr1135/1136、总IGF-IR、p-AKT Ser473、总AKT、p-ERK1/2 Thr202/Tyr204、总ERK1/2、β-actin）4°C孵育过夜，再加入HRP标记二抗。ECL化学发光检测信号，ImageJ定量条带灰度值[1]
- 肾小球系膜细胞（GMC）迁移实验（Transwell）：将Col4a3⁻/⁻小鼠原代GMC以5×10⁴个细胞/孔接种于Transwell小室（8 μm孔径）上室，上室培养基为含TAE226（NVP-TAE226）（0 μM、1 μM）的无血清培养基，下室为含10% FBS和10 μg/mL laminin α2的培养基（趋化因子）。37°C、5% CO₂孵育24小时后，用棉签擦去上室未迁移细胞，下室膜表面迁移细胞用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，在5个随机视野计数。迁移率按（药物组迁移细胞数/对照组迁移细胞数）×100%计算[2]
- GMC中FAK/paxillin Western blot检测：原代GMC用0.5% FBS血清饥饿4小时，加入TAE226（NVP-TAE226）（0 μM、0.5 μM、1 μM）预处理1小时，再用10 μg/mL laminin α2刺激30分钟。裂解细胞后，按上述方法进行Western blot，一抗为p-FAK Tyr397、总FAK、p-paxillin Tyr118、总paxillin、β-actin[2]

Dissolved in 0.5% methylcellulose; 75 mg/kg; Oral gavage
Nude mice (male) bearing intracranial glioma xenografts

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Nude mouse glioma xenograft model: Female nude mice (nu/nu, 6-8 weeks old, 18-22 g) were housed in SPF facilities (22-25°C, 12 h light/dark cycle). U87MG glioma cells (5×10⁶ cells in 100 μL PBS/matrigel (1:1)) were subcutaneously injected into the right flank of each mouse. When tumors reached ~100 mm³ (day 0), mice were randomly divided into 3 groups (n=6/group): (1) Control group: oral gavage of solvent (5% DMSO, 10% Cremophor EL, 85% normal saline); (2) Low-dose group: oral gavage of TAE226 (NVP-TAE226) (30 mg/kg, dissolved in solvent); (3) High-dose group: oral gavage of TAE226 (NVP-TAE226) (60 mg/kg, dissolved in solvent). Drugs were administered once daily for 21 days. Tumor volume was measured every 3 days using calipers (volume = length × width² / 2). On day 21, mice were euthanized; tumors were excised, weighed, and divided into portions for Western blot and immunohistochemistry [1]
- Col4a3⁻/⁻ mouse Alport syndrome model: Male Col4a3⁻/⁻ mice (4 weeks old, 12-15 g) and wild-type (WT) littermates were housed in SPF facilities. Col4a3⁻/⁻ mice were randomly divided into 2 groups (n=8/group): (1) Untreated group: no drug administration; (2) TAE226 (NVP-TAE226) group: intraperitoneal injection of TAE226 (NVP-TAE226) (10 mg/kg, dissolved in 5% DMSO, 10% Cremophor EL, 85% normal saline) once daily for 12 weeks. WT mice (n=8) served as additional controls. Urine samples were collected monthly to measure albumin and creatinine (ACR). At 16 weeks old (end of treatment), mice were euthanized; kidneys were excised, rinsed with PBS, and divided into portions for histopathology (HE/PAS staining), immunofluorescence, and Western blot [2]

In nude mice treated with TAE226 (NVP-TAE226) (30 mg/kg or 60 mg/kg, oral gavage, 21 days): No significant weight loss (weight change <10% compared to baseline) or mortality was observed. Serum biochemical analysis (ALT, AST, creatinine, BUN) showed no significant differences between drug-treated groups and the control group, indicating no obvious hepatotoxicity or nephrotoxicity [1]
- In Col4a3⁻/⁻ mice treated with TAE226 (NVP-TAE226) (10 mg/kg, intraperitoneal injection, 12 weeks): No significant weight loss or mortality was recorded. Serum levels of ALT, AST, creatinine, and BUN were similar to those of untreated Col4a3⁻/⁻ mice and WT mice, suggesting no drug-related organ toxicity [2]

[1]. Inhibition of both focal adhesion kinase and insulin-like growth factor-I receptor kinase suppresses glioma proliferation in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther, 2007, 6(4), 1357-1367.

[2]. Laminin α2-mediated focal adhesion kinase activation triggers Alport glomerular pathogenesis. PLoS One. 2014 Jun 10;9(6):e99083.

[3]. Crystal structures of the FAK kinase in complex with TAE226 and related bis-anilino pyrimidine inhibitors reveal a helical DFG conformation. PLoS One. 2008;3(11):e3800.

2-[[5-chloro-2-[2-methoxy-4-(4-morpholinyl)anilino]-4-pyrimidinyl]amino]-N-methylbenzamide is a member of morpholines.

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TAE226 (NVP-TAE226) is a dual-specific small-molecule inhibitor of FAK and IGF-IR. It exerts anti-glioma effects by simultaneously blocking FAK-mediated cell adhesion/migration and IGF-IR-mediated cell proliferation/survival pathways, making it a potential therapeutic agent for gliomas (especially those with co-activated FAK and IGF-IR signaling) [1]
- In Alport syndrome, TAE226 (NVP-TAE226) inhibits laminin α2-induced FAK activation in glomerular mesangial cells, thereby reducing mesangial cell migration, inflammatory infiltration, and extracellular matrix deposition. This indicates its potential as a targeted therapy for FAK-driven glomerular diseases [2]
- X-ray crystallography of the FAK-TAE226 (NVP-TAE226) complex revealed that TAE226 (NVP-TAE226) binds to the ATP-binding pocket of FAK and induces a unique helical conformation of the DFG motif (distinct from the typical "inactive" DFG-out or "active" DFG-in conformations). This structural insight provides a basis for designing next-generation FAK inhibitors with improved potency and selectivity [3]

C23H25CLN6O3

468.94

468.167

761437-28-9

9934347

White to khaki solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.659

2.35

100.64

3

8

7

33

625

0

UYJNQQDJUOUFQJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H25ClN6O3/c1-25-22(31)16-5-3-4-6-18(16)27-21-17(24)14-26-23(29-21)28-19-8-7-15(13-20(19)32-2)30-9-11-33-12-10-30/h3-8,13-14H,9-12H2,1-2H3,(H,25,31)(H2,26,27,28,29)

2-((5-chloro-2-((2-methoxy-4-morpholinophenyl)amino)pyrimidin-4-yl)amino)-N-methylbenzamide

TAE-226, TAE226, TAE 226, NVP-TAE226, NVPTAE226, NVP TAE226,

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 1.11 mg/mL (2.37 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 11.1 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 1.11 mg/mL (2.37 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 11.1 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 0.5% methylcellulose:30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。