17,20-lyase/CYP17

Orteronel 对雄烯二酮的 IC50 为 110 nM，对 DHEA 的 IC50 为 110 nM，这两种物质均由猴肾上腺细胞响应 ACTH 刺激而产生。此外，ortersteronel 的 IC50 为 37 nM，可显着减少人肾上腺皮质肿瘤系 H295R 细胞中 DHEA 的合成[1]。 Orteronel 对大鼠类固醇 17,20-裂解酶的 IC50 值分别为 54 nM，对人类固醇 17,20-裂解酶的 IC50 为 38 nM，在体外对这两种酶均具有很强的抑制活性。 Orteronel 不会明显影响 CYP3A4 或 11-羟化酶以及其他 CYP 亚型。与其他 CYP 异构体相比，Orteronel 对表达人 CYP 异构体的微粒体中的 17,20-裂解酶具有更高的抑制作用，IC50 为 19 nM1。

Ortionel（1 mg/kg，口服）获得了良好的药代动力学特征，Tmax、Cmax、t1/2 和 AUC0-24 小时分别为 1.7 小时、0.147 μg/mL、3.8 小时和 0.727 μg/mL。 1]。口服1 mg/kg Orteronel可显着降低食蟹猴体内DHEA和血清睾酮水平[2]。

猴17,20-裂合酶/17-羟化酶抑制活性测定[1]
17,20-裂合酶抑制活性如所述进行了一些修改。从两只完整的5岁雄性食蟹猴身上切下的肾上腺在10 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.4）中均质化，该缓冲液含有250 mmol/L蔗糖、25 mmol/L KCl、0.5 mM EDTA 2 K、1 mmol/L二硫苏糖醇、0.02 mg/mL苯甲基磺酰氟和20%（v/v）甘油。然后通过离心分离肾上腺微粒体，并将其悬浮在含有5 mmol/L MgCl2和25%（v/v）甘油的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒（Hercules，CA，USA）测定微粒体部分的蛋白质浓度。为了评估类固醇生物合成，反应混合物含有50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、5μmol/L 17-α-羟基孕烯醇酮，包括相当于0.05μL/管17-α羟基-[1,2（n）-3H]-孕烯醇酮（1 mCi/mL，41.9 Ci/mmol）、NADPH生成系统（0.6 mmol/Lβ-NADP+，10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，5 mmol/L氯化镁，1.5单位/mL G-6-P脱氢酶）、2.5%（v/v）丙二醇、微粒体蛋白（50μG/mL，终浓度）和总体积为使用200μL。将反应混合物在37°C下孵育120分钟。在己烷：四氢呋喃（4:1）溶剂体系中，通过薄层色谱（TLC，Whatman LHPK）分离反应底物和产物（DHEA、雄烯二酮）。使用BAS 2000 II生物图像分析仪对TLC板上的适当区域进行鉴定并测量放射性，酶活性表示为nmol/h/mg蛋白质。 17-羟化酶活性的测定与上述类似。5μmol/L孕烯醇酮（ICN Biomedicals），包括相当于0.05μL/管[7-3H（N）]孕烯醇酮的当量（1 mCi/mL，17.5 Ci/mmol），取代17-α-羟基雷公藤酮作为底物，将反应混合物温育5分钟。在环己烷：乙酸乙酯（3:2）溶剂系统中，通过TLC分离底物和产物（17-α-Hydrophenolone，17α-羟基孕酮（17-OHP），DHEA，雄烯二酮，脱氧皮质醇），并如上所述测定和表示活性。

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11-羟化酶活性测定[1]
根据其他地方描述的方法，经过一些修改后，测定了对猴11-羟化酶的抑制活性。如上所述切除肾上腺。通过离心制备肾上腺线粒体，并将其悬浮在含有5 mmol/L MgCl2的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒（Hercules，CA，USA）测定线粒体部分的蛋白质浓度。反应混合物含有50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、2μmol/L 11-脱氧皮质醇（美国康涅狄格州普法尔茨和鲍尔公司），包括相当于0.05μL/管羟基-11-脱氧皮质酮、[1,2-3H（N）]（NEN，56.8 Ci/mmol）、NADPH生成系统（0.6 mmol/Lβ-NADP+，10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，5 mmol/L氯化镁，1.5单位/mL G-6-P脱氢酶）、10 mmol/L氯化钙、5%（v/v）丙二醇、线粒体蛋白（50μG/mL，终浓度）和总体积为200μL。将反应混合物在37°C下孵育120分钟。底物和产物（3H-皮质醇）在甲苯-丙酮（3.5:1）溶剂体系中分离。所有其他程序均如上所述进行，活性以nmol/h/mg蛋白质表示。

控制性腺雄激素生物合成的手术或药物方法是治疗各种非肿瘤性和肿瘤性疾病的有效途径。例如，雄激素消融及其导致的循环睾酮水平的降低是晚期前列腺癌的有效治疗方法。不幸的是，这种方法的治疗效果往往是暂时的，因为疾病进展到“去势抵抗”(CRPC)状态，这种情况下的治疗选择有限。一种被认为是导致CRPC发生的机制是生殖腺外雄激素的合成以及这些残留的生殖腺外雄激素对前列腺肿瘤细胞增殖的影响。负责合成性腺外雄激素的一个重要酶是CYP17A1，它具有17,20-裂解酶和17-羟化酶的催化活性，其中17,20-裂解酶的活性是雄激素生物合成过程的关键。Orteronel (TAK-700)是一种新型的，选择性的，有效的17,20-裂解酶抑制剂，作为一种抑制雄激素合成的药物正在开发中。在本研究中，我们通过评估其对阉割和完整雄性食环猴口服给药后对CYP17A1酶活性、猴肾上腺细胞和人肾上腺肿瘤细胞中类固醇生成以及血清脱氢表雄酮(DHEA)、皮质醇和睾酮水平的影响，量化了orteronel对睾丸和肾上腺雄激素产生的抑制活性和特异性。我们报道，奥特龙能有效抑制猴子肾上腺细胞雄激素的产生，但仅微弱地抑制皮质酮和醛固酮的产生;奥特罗内酯对皮质醇的IC(50)值比对DHEA的IC(50)值高3倍。单次口服给药后，完整食蟹猴的血清脱氢表雄酮、皮质醇和睾酮水平迅速被抑制。在被阉割的猴子中，每天用奥特罗奈治疗两次，在整个治疗期间，DHEA和睾酮的抑制持续存在。在体内模型和与我们的体外数据一致，口服给药后血清皮质醇水平的抑制低于DHEA。在人CYP17A1和人肾上腺肿瘤细胞中，在无细胞酶测定中，orteronel抑制17,20-裂解酶活性的效力是17-羟化酶活性的5.4倍，在人肾上腺肿瘤细胞中，DHEA产生的效力是皮质醇产生的27倍，这表明在人与猴子中，17,20-裂解酶和17-羟化酶活性的抑制具有更大的特异性。综上所述，奥特罗内酯能有效抑制猴和人体内CYP17A1的17,20裂解酶活性，降低猴体内血清雄激素水平。这些发现表明，对于雄激素抑制至关重要的疾病，如雄激素敏感和CRPC，奥特罗奈可能是一种有效的治疗选择。[1]

\n\n药代动力学研究[1]
\n\n[14C]orteronel悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以1 mg (183 μCi)/kg的剂量口服给药于喂食后的猴子。对于静脉给药，[14C]orteronel溶解于二甲基乙酰胺和生理盐水（体积比1:4）的混合物中，以0.5 mg (91 μCi)/kg的剂量注射（体重2.38–3.08 kg）。给药后5、10（仅限静脉给药）、15、30分钟以及1、2、3、4、6、8和24小时，从股静脉采集血液样本。将血浆离心后，置于−20 °C冷冻保存直至分析。为定量血浆中的[14C]奥特罗内，用甲醇（5体积比）提取血浆，然后在室温下用氮气吹干。将残余物溶解于80%（体积比）甲醇水溶液中。使用预涂有硅胶60F254（0.25 mm厚）的薄层色谱板分离溶液组分，展开剂为氯仿-甲醇-28%氨水（10:4:0.2，体积比）。展开后，使用生物成像分析仪（BAS-2000或BAS-2000II）和成像板（BAS III；富士胶片株式会社）通过放射自显影法定位板上的放射性区域，或通过添加奥特罗内作为内标物到测试样品中，或通过奥特罗内的紫外吸收法定位，或两者结合使用。刮取色谱板上与奥特罗内对应的硅胶部分，测定其放射性。通过液体闪烁计数法测定各部分的放射性，并根据比放射性计算奥特罗内尔的浓度。最大血浆浓度 (Cmax) 和达到 Cmax 的时间 (Tmax) 的值直接从数据中计算得出。血浆半衰期 (t1/2) 和血浆浓度-时间曲线下面积 (AUC) 分别使用 Microsoft Excel 95 通过线性回归分析和梯形法则计算得出。生物利用度 (BA) 在剂量标准化后确定。除非另有说明，否则血浆中 [14C]奥特罗内尔的药代动力学参数以三只动物结果的平均值或平均值±标准差 (SD) 表示。[1]

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\n\n药效学研究中的给药和血液采样[1]
\n\n在所有口服给药实验中，给药前均采用放射免疫分析法 (RIA)（如上所述）测定血清 DHEA 和睾酮水平，以建立基线值。[1]
\n\n在单次给药实验中， 20只猴子被随机分为5组（n = 4）。每组分别接受不同剂量的奥特罗内尔或赋形剂（0.5%甲基纤维素，3 mL/kg）。口服给药时，奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，于上午10点以0.3、1、3或10 mg/kg的剂量给药。分别于给药后48小时、24小时、给药前以及给药后2、5、10、24和48小时采集血样，并将血清储存于−30 °C。[1]
\n\n在多剂量实验中，20只猴子被随机分为4组（n = 5）。每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，于上午10点左右以3、7.5和15 mg/kg的剂量每日两次口服给药，连续7天。前6天每天晚上10点给药一次，最后一天早上10点左右给药一次；一组仅接受赋形剂（0.5%甲基纤维素，3 mL/kg）。从给药前3天至末次给药后9小时，每天采集两次血样（大约下午2点和晚上7点，以补偿昼夜节律变化）。采集后，血清储存在−30 °C。[1]
\n\n一项多剂量研究也在去势雄性猴子中进行。在该研究中，6只去势猴子被分为2组（n = 3），每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素中，以7.5或15 mg/kg的剂量，每天两次（大约上午8点和晚上8点）口服给药（3 mL/kg），持续7天，前6天每日两次（大约上午8点和晚上8点），最后一天早上8点左右给药一次。每天采集两次血样（大约下午2点和晚上7点），以补偿昼夜节律变化。在给药前3天至最后一次服用奥特罗内后9小时，分别于中午12点和下午5点进行检测。在最后一次服用奥特罗内后约1个月，6只去势猴中的5只接受了赋形剂（0.5% (w/v) 甲基纤维素溶液，3 mL/kg），给药方案与服用奥特罗内相同，并采集全血，按照奥特罗内给药期间所述方法处理血清。因此，在奥特罗内给药后1个月收集基线数据，以避免单独口服给药对激素昼夜节律模式的影响。所有血清样本中的类固醇浓度均采用放射免疫分析法（RIA）测定，方法如前所述。

溶于 0.5% 甲基纤维素；≤1 mg/kg；灌胃

成年雄性食蟹猴。

将[14C]奥特罗内口服给予完整猴子进行药代动力学分析。当给药剂量为1 mg/kg时，观察到Tmax、Cmax、t1/2和AUC0–24 h分别为1.7 h、0.147 μg/mL、3.8 h和0.727 μg·h/mL（表2）。总的来说，奥特罗内表现出较高的生物利用度（BA）和合理的t1/2，这些都是口服给药的重要参数。考虑到在猴肾上腺细胞体外抑制DHEA生成所需的浓度>300 nmol/L（>0.1 μg/mL）（图2A），预计每日两次口服5–15 mg/kg的剂量可使奥特罗内达到维持17,20-裂解酶抑制所需的最低谷浓度，并显著降低血清DHEA水平（假设药代动力学呈线性特征）[1]。

[1]. Orteronel (TAK-700), a novel non-steroidal 17,20-lyase inhibitor: effects on steroid synthesis in human and monkey adrenal cells and serum steroid levels in cynomolgus monkeys. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012 Apr;129(3-5):115-28.

[2]. Discovery of orteronel (TAK-700), a naphthylmethylimidazole derivative, as a highly selective 17,20-lyase inhibitor with potential utility in the treatment of prostate cancer. From Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011), 19(21), 6.

奥特罗奈（Orteronel）属于吡咯并咪唑类化合物，其分子式为6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑，在7位被羟基和6-(甲基氨基甲酰基)萘-2-基取代（7S-立体异构体）。它是一种非甾体类17,20-裂解酶抑制剂，可抑制雄激素合成。该药曾用于治疗去势抵抗性前列腺癌的临床开发，但试验现已终止。奥特罗奈具有抗肿瘤活性，同时也是甾醇生物合成抑制剂和EC 1.14.99.9（甾体17α-单加氧酶）抑制剂。它是一种萘甲酰胺、仲甲酰胺、吡咯并咪唑和叔醇。
Orteronel 已被研究用于治疗前列腺癌。
Orteronel 是一种口服生物利用度高的非甾体类雄激素合成抑制剂，可抑制类固醇 17α-单加氧酶（17,20 裂解酶），具有潜在的抗雄激素活性。TAK-700 可与睾丸和肾上腺中的类固醇 17α-单加氧酶结合并抑制其活性，从而抑制雄激素的产生。这可能降低雄激素依赖性生长信号传导，并可能抑制雄激素依赖性肿瘤细胞的增殖。细胞色素 P450 酶 CYP17A1 (P450C17) 定位于内质网 (ER)，具有 17α-羟化酶和 17,20-裂解酶活性，在产生类固醇激素（如孕激素、盐皮质激素、糖皮质激素、雄激素和雌激素）的类固醇生成途径中起关键作用。

C18H17N3O2

307.35

307.132

C, 70.34; H, 5.58; N, 13.67; O, 10.41

566939-85-3

426219-18-3 (racemic);566939-85-3 (s-isomer);

9796590

White to light brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

685.1±45.0 °C at 760 mmHg

368.2±28.7 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.695

-0.13

67.15

2

3

2

23

471

1

CNC(=O)C1=CC2=C(C=C1)C=C(C=C2)[C@]3(CCN4C3=CN=C4)O

OZPFIJIOIVJZMN-SFHVURJKSA-N

InChI=1S/C18H17N3O2/c1-19-17(22)14-3-2-13-9-15(5-4-12(13)8-14)18(23)6-7-21-11-20-10-16(18)21/h2-5,8-11,23H,6-7H2,1H3,(H,19,22)/t18-/m0/s1

(S)-6-(7-hydroxy-6,7-dihydro-5H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-7-yl)-N-methyl-2-naphthamide

TAK700; TAK-700; TAK 700; (S)-Orteronel; (S)-6-(7-hydroxy-6,7-dihydro-5H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-7-yl)-N-methyl-2-naphthamide; TAK700; UE5K2FNS92; Orteronel (s-isomer);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% methylcellulose: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。