17,20-lyase/CYP17

奥特罗内对雄烯二酮和脱氢表雄酮（DHEA）的IC50值均为110 nM，这两种物质均在猴肾上腺细胞受促肾上腺皮质激素（ACTH）刺激后产生。此外，奥特罗内对人肾上腺皮质肿瘤细胞系H295R中DHEA的合成具有显著的抑制作用，IC50值为37 nM[1]。奥特罗内对大鼠类固醇17,20-裂解酶和人类固醇17,20-裂解酶的IC50值分别为54 nM和38 nM，表明其在体外对这两种酶均具有强烈的抑制活性。奥特罗内对CYP3A4和11-羟化酶等其他CYP同工酶的影响不明显。与其他CYP同工酶相比，奥特罗内对表达人CYP同工酶的微粒体中的17,20-裂解酶具有更高的抑制作用，IC50值为19 nM1。

口服奥特罗内（1 mg/kg）可获得良好的药代动力学特征，其Tmax、Cmax、t1/2和AUC0-24小时分别为1.7小时、0.147 μg/mL、3.8小时和0.727 μg/mL[1]。口服1 mg/kg奥特罗内可显著降低食蟹猴体内DHEA和血清睾酮水平[2]。

猴17,20-裂解酶/17-羟化酶抑制活性测定[1]
17,20-裂解酶抑制活性测定方法参照文献并稍作修改。从两只完整的5岁雄性食蟹猴中取出肾上腺，在含有250 mmol/L蔗糖、25 mmol/L KCl、0.5 mM EDTA-K、1 mmol/L二硫苏糖醇、0.02 mg/mL苯甲基磺酰氟和20% (v/v)甘油的10 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.4）中匀浆。然后通过离心分离肾上腺微粒体，并将其悬浮于含有5 mmol/L MgCl2和25% (v/v)甘油的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒（美国加州赫拉克勒斯）测定微粒体组分的蛋白浓度。为评估类固醇生物合成，反应体系包含50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、5 μmol/L 17-α-羟基孕烯醇酮（相当于0.05 μL/管的17-α-羟基-[1,2(n)-3H]-孕烯醇酮，活度为1 mCi/mL，41.9 Ci/mmol）、NADPH生成系统（0.6 mmol/L β-NADP+、10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、5 mmol/L氯化镁、1.5 U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、2.5% (v/v)丙二醇、微粒体蛋白（终浓度为50 μg/mL）和待测化合物，总体积为200 μL。反应混合物在 37 °C 下孵育 120 分钟。反应底物和产物（DHEA、雄烯二酮）通过薄层色谱法（TLC，Whatman LHPK）在己烷：四氢呋喃（4:1）溶剂系统中分离。使用 BAS 2000 II 生物成像分析仪对 TLC 板上的相应区域进行鉴定并测定放射性，酶活性以 nmol/h/mg 蛋白表示。17-羟化酶活性测定与上述方法类似。以 5 μmol/L 孕烯醇酮（ICN Biomedicals）代替 17-α-羟基孕烯醇酮作为底物，其中包含相当于 0.05 μL/管 [7-3H (N)]-孕烯醇酮（1 mCi/mL，17.5 Ci/mmol），反应混合物孵育 5 分钟。底物和产物（17-α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮 (17-OHP)、脱氢表雄酮 (DHEA)、雄烯二酮、脱氧皮质醇）采用环己烷：乙酸乙酯 (3:2) 薄层色谱法分离，并按上述方法测定和表达活性。

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11-羟化酶活性测定[1]
猴11-羟化酶抑制活性测定方法参照文献并稍作修改。肾上腺按上述方法取出。肾上腺线粒体经离心制备，并悬浮于含5 mmol/L MgCl₂的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。线粒体组分的蛋白浓度采用Bio-Rad蛋白测定试剂盒（美国加州赫拉克勒斯）测定。反应混合物包含 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）、2 μmol/L 11-脱氧皮质醇（Pfaltz & Bauer，美国康涅狄格州），其中包含相当于 0.05 μL/管的羟基-11-脱氧皮质酮 [1,2-3H(N)]（NEN，56.8 Ci/mmol）、NADPH 生成系统（0.6 mmol/L β-NADP+、10 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、5 mmol/L 氯化镁、1.5 单位/mL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、10 mmol/L 氯化钙、5% (v/v) 丙二醇、线粒体蛋白（终浓度 50 μg/mL）以及待测化合物，总体积为 200 μL。反应混合物在 37 °C 下孵育 120 分钟。底物和产物（3H-皮质醇）在甲苯-丙酮（3.5:1）溶剂体系中分离。所有其他步骤均按上述方法进行，活性以nmol/h/mg蛋白表示。

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使用类似的方法测试了PD151746对其他蛋白酶的选择性：在与钙蛋白酶类似的条件下，测试木瓜蛋白酶（7-10 ng）、嗜热蛋白酶（5 μg）和胰蛋白酶（1.25 μg）；在室温下，用50 mM MES（pH 5.5）、100 μM Cbz-Arg-Arg-MNA、抑制剂和2 mM DTT测定组织蛋白酶B（0.002单位，牛脾），反应60分钟，然后进行荧光读数（激发波长340±15 nm，发射波长425±20 nm）。[1]

控制性腺雄激素生物合成的手术或药物方法是治疗多种非肿瘤性疾病和肿瘤性疾病的有效手段。例如，雄激素剥夺疗法及其导致的循环睾酮水平降低是治疗晚期前列腺癌的有效方法。然而，由于疾病进展至“去势抵抗性前列腺癌”（CRPC）状态，这种疗法的疗效往往是暂时的，而CRPC的治疗选择非常有限。CRPC的发生机制之一被认为是性腺外雄激素的合成，以及这些残留的性腺外雄激素对前列腺肿瘤细胞增殖的影响。CYP17A1是合成性腺外雄激素的重要酶，它同时具有17,20-裂解酶和17-羟化酶的催化活性，其中17,20-裂解酶活性在雄激素生物合成过程中起着关键作用。 Orteronel (TAK-700) 是一种新型、选择性强效的 17,20-裂解酶抑制剂，目前正在开发用于抑制雄激素合成。本研究通过评估 Orteronel 对去势和完整雄性食蟹猴口服给药后 CYP17A1 酶活性、猴肾上腺细胞和人肾上腺肿瘤细胞中类固醇生成以及血清脱氢表雄酮 (DHEA)、皮质醇和睾酮水平的影响，定量分析了 Orteronel 对睾丸和肾上腺雄激素生成的抑制活性和特异性。结果表明，Orteronel 能有效抑制猴肾上腺细胞中雄激素的生成，但对皮质酮和醛固酮的生成抑制作用较弱；Orteronel 对皮质醇的 IC50 值约为对 DHEA 的 3 倍。单次口服给药后，完整食蟹猴血清中DHEA、皮质醇和睾酮水平迅速降低。在去势猴中，每日两次服用奥特罗内，DHEA和睾酮的抑制作用持续整个治疗期间。在体内模型中，与我们的体外数据一致，口服给药后血清皮质醇水平的抑制程度低于DHEA。就人CYP17A1和人肾上腺肿瘤细胞而言，在无细胞酶活性测定中，奥特罗内对17,20-裂解酶活性的抑制作用比对17-羟化酶活性的抑制作用强5.4倍；在人肾上腺肿瘤细胞中，奥特罗内对DHEA生成的抑制作用比对皮质醇生成的抑制作用强27倍，这表明在人类中，奥特罗内对17,20-裂解酶和17-羟化酶活性的抑制特异性高于猴子。总之，奥特罗内能有效抑制猴和人CYP17A1的17,20-裂解酶活性，并降低猴体内血清雄激素水平。这些发现表明，奥特罗内可能是一种有效的治疗选择，用于治疗那些需要抑制雄激素的疾病，例如雄激素敏感性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌。[1]

药代动力学研究[1]
[14C]orteronel悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以1 mg (183 μCi)/kg的剂量口服给药于喂食后的猴子。对于静脉注射，[14C]orteronel溶解于二甲基乙酰胺和生理盐水（体积比1:4）的混合物中，以0.5 mg (91 μCi)/kg的剂量注射（体重2.38–3.08 kg）。给药后5、10（仅限静脉注射）、15、30分钟以及1、2、3、4、6、8和24小时，从股静脉取血，离心获得血浆。随后将样品冷冻于−20 °C直至分析。为定量血浆中的[14C]奥特罗内，用甲醇（5体积比）提取血浆，然后在室温下用氮气流吹干。将残余物溶解于80%（体积比）甲醇水溶液中。使用预涂有硅胶60F254（0.25 mm厚）的薄层色谱板分离溶液组分，并在氯仿-甲醇-28%氨水（10:4:0.2，体积比）中进行一维展开。展开后，使用生物成像分析仪（BAS-2000或BAS-2000II）和成像板（BAS III；富士胶片株式会社）通过放射自显影法定位板上的放射性区域，或通过向测试样品中添加奥特罗内作为内标物进行紫外吸收定位，或两者结合使用。将对应于奥特罗内的硅胶部分从板上刮下，并通过液体法测定每个部分的放射性。通过闪烁计数，并根据比放射性计算奥特罗内尔的浓度。最大血浆浓度 (Cmax) 和达到 Cmax 的时间 (Tmax) 的值直接从数据中计算得出。血浆半衰期 (t1/2) 和血浆浓度-时间曲线下面积 (AUC) 分别使用 Microsoft Excel 95 通过线性回归分析和梯形法则计算得出。生物利用度 (BA) 在剂量标准化后确定。除非另有说明，否则血浆中 [14C]奥特罗内尔的药代动力学参数以三只动物结果的平均值或平均值±标准差 (SD) 表示。[1]

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药效学研究中的给药和血液采样[1]
在所有口服给药实验中，给药前均采用放射免疫分析法 (RIA)（如上所述）测定血清 DHEA 和睾酮水平，以建立基线值。[1]
在单剂量实验中，20 只猴子被随机分为 5 组 (n = 4)。每组分别接受不同剂量的奥特罗内尔或赋形剂（0.5%甲基纤维素，3 mL/kg）。口服给药时，奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，于上午10点以0.3、1、3或10 mg/kg的剂量给药。分别于给药后48小时、24小时、给药前以及给药后2、5、10、24和48小时采集血样，并将血清储存于-30 °C。[1]
在多剂量实验中，20只猴子被随机分为4组（n = 5）。每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以3、7.5和15 mg/kg的剂量口服给药，连续7天。前6天，每天两次，分别于上午10点和晚上10点左右给药；最后一天，每天一次，于上午10点左右给药。一天；一组仅接受赋形剂（0.5%甲基纤维素，3 mL/kg）。从给药前3天至末次给药后9小时，每天两次采集血样（大约下午2点和晚上7点，以补偿昼夜节律变化）。采集后，血清储存在−30 °C。[1]
一项多剂量研究也在去势雄性猴子中进行。在该研究中，6只去势猴子被分为2组（n = 3），每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素中，以7.5或15 mg/kg的剂量，每天两次（大约上午8点和晚上8点）口服给药，持续7天，前6天每日两次（大约上午8点和晚上8点），最后一天在上午8点左右给药一次。从给药前3天至末次给药后9小时，每天两次（大约中午12点和下午5点）采集血样。在最后一次给予奥特罗内（orteronel）后约1个月，6只去势猴中的5只接受了赋形剂（0.5% (w/v) 甲基纤维素溶液，3 mL/kg），给药方案与给予奥特罗内相同。随后采集全血，并按照奥特罗内给药期间所述方法处理血清。因此，在奥特罗内给药后1个月收集基线数据，以避免单独口服给药对激素昼夜节律模式的影响。所有血清样本中的类固醇浓度均采用放射免疫分析法（RIA）测定，方法如前所述。

溶于 0.5% 甲基纤维素；≤1 mg/kg；灌胃

成年雄性食蟹猴。

将[14C]奥特隆尼口服给予完整猴子进行药代动力学分析。当剂量为1 mg/kg时，观察到Tmax、Cmax、t1/2和AUC0–24 h分别为1.7 h、0.147 μg/mL、3.8 h和0.727 μg·h/mL（表2）。总体而言，奥特隆尼显示出较高的生物利用度（BA）和合理的t1/2，这些都是口服给药的重要参数。考虑到体外抑制猴肾上腺细胞中DHEA生成所需的浓度>300 nmol/L (>0.1 μg/mL)（图2A），预计每日两次口服5-15 mg/kg的奥特隆尼德可使其达到维持17,20-裂解酶抑制所需的最低谷浓度，并显著降低血清DHEA水平（假设其药代动力学特征呈线性）[1]。

[1]. Orteronel (TAK-700), a novel non-steroidal 17,20-lyase inhibitor: effects on steroid synthesis in human and monkey adrenal cells and serum steroid levels in cynomolgus monkeys. J Steroid Biochem Mol Biol. 2012 Apr;129(3-5):115-28.

[2]. Discovery of orteronel (TAK-700), a naphthylmethylimidazole derivative, as a highly selective 17,20-lyase inhibitor with potential utility in the treatment of prostate cancer. From Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011), 19(21), 6.

奥特罗内尔（Orteronel）属于吡咯并咪唑类化合物，分子式为6,7-二氢-5H-吡咯并[1,2-c]咪唑，其7位被羟基和6-(甲基氨基甲酰基)萘-2-基取代（7S-立体异构体）。它是一种非甾体类17,20-裂解酶抑制剂，可抑制雄激素合成。该药物曾用于治疗去势抵抗性前列腺癌的临床开发，但试验已终止。奥特罗内尔具有抗肿瘤活性，同时也是甾醇生物合成抑制剂和EC 1.14.99.9（甾体17α-单加氧酶）抑制剂。它是一种萘酰胺、仲甲酰胺、吡咯并咪唑和叔醇类化合物。奥特罗内尔曾被用于前列腺癌的治疗研究。 Orteronel 是一种高生物利用度、口服生物利用度的非甾体类雄激素合成抑制剂，它能抑制类固醇 17α-单加氧酶（17,20-裂解酶），具有潜在的抗雄激素活性。TAK-700 与睾丸和肾上腺中的类固醇 17α-单加氧酶结合并抑制其活性，从而抑制雄激素的产生。这可能降低雄激素依赖性生长信号传导，并可能抑制雄激素依赖性肿瘤细胞的增殖。细胞色素 P450 酶 CYP17A1 (P450C17) 位于内质网 (ER) 中，具有 17α-羟化酶和 17,20-裂解酶活性，在类固醇生成途径中发挥着关键作用，该途径产生孕酮、盐皮质激素、糖皮质激素、雄激素和雌激素等类固醇激素。

C18H17N3O2

307.35

307.132

C, 70.34; H, 5.58; N, 13.67; O, 10.41

566939-85-3

426219-18-3 (racemic);566939-85-3 (s-isomer);

9796590

White to light brown solid powder

1.4±0.1 g/cm3

685.1±45.0 °C at 760 mmHg

368.2±28.7 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.695

-0.13

67.15

2

3

2

23

471

1

CNC(=O)C1=CC2=C(C=C1)C=C(C=C2)[C@]3(CCN4C3=CN=C4)O

OZPFIJIOIVJZMN-SFHVURJKSA-N

InChI=1S/C18H17N3O2/c1-19-17(22)14-3-2-13-9-15(5-4-12(13)8-14)18(23)6-7-21-11-20-10-16(18)21/h2-5,8-11,23H,6-7H2,1H3,(H,19,22)/t18-/m0/s1

(S)-6-(7-hydroxy-6,7-dihydro-5H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-7-yl)-N-methyl-2-naphthamide

TAK700; TAK-700; TAK 700; (S)-Orteronel; (S)-6-(7-hydroxy-6,7-dihydro-5H-pyrrolo[1,2-c]imidazol-7-yl)-N-methyl-2-naphthamide; TAK700; UE5K2FNS92; Orteronel (s-isomer);

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (4.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% methylcellulose: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。