17,20-lyase/CYP17
Orteronel targets human 17,20-lyase (also known as CYP17A1), a key enzyme in the biosynthesis of androgens. 17,20-lyase catalyzes the conversion of pregnenolone and progesterone to dehydroepiandrosterone (DHEA) and androstenedione, respectively, which are precursors to testosterone and dihydrotestosterone (DHT). Inhibition of 17,20-lyase reduces androgen production in the testes, adrenal glands, and within prostate cancer tumors. Orteronel is a non-steroidal inhibitor that exhibits >1000-fold selectivity over other cytochrome P450 enzymes (CYPs), which reduces the risk of off-target effects. The compound has an IC50 of 38 nM for human 17,20-lyase. The racemic mixture contains both the S- and R-enantiomers.

体外活性：体外实验表明，TAK-700 对大鼠和人 17,20-裂解酶具有强效抑制活性，IC50 值分别为 54 nM 和 38 nM。而其他 CYP 同工酶，包括 11-羟化酶和 CYP3A4，则不受 TAK-700 的显著影响。在表达人 CYP 同工酶的微粒体中，TAK-700 对 17,20-裂解酶的抑制作用更强，IC50 值为 19 nM，高于其他 CYP 同工酶。TAK-700 对猴 17,20-裂解酶和 17-羟化酶也具有抑制活性，IC50 值分别为 27 nM 和 38 nM。在猴肾上腺细胞中，TAK-700 可抑制 ACTH 刺激的 DHEA 和雄烯二酮的生成，IC50 值分别为 110 nM 和 130 nM。此外，TAK-700 还能有效抑制人肾上腺皮质肿瘤细胞系 H295R 中 DHEA 的生成，IC50 值为 37 nM。
激酶活性测定：大鼠 11-羟化酶活性测定方法参照先前报道的侧链裂解活性测定方法并稍作修改。反应混合物包含 200 mM 甘露醇、4.5 mM HEPES、2.3 mM 磷酸钾（pH 7.4）、0.1 mM EDTA·2K、0.03% BSA（结晶）、4.5 mM NADPH、11 mM 氯化钙、4 μg 线粒体蛋白、10 nM [1,2-3H]-羟基-11-脱氧皮质酮（11-脱氧皮质醇）（NEN，溶于 0.02% Tween-80）以及 1-1000 nM 的待测化合物，总体积为 150 μL。试剂浓度以反应混合物中的最终浓度表示。待测化合物用二甲基甲酰胺进行系列稀释，取 1.5 μL 直接加入反应混合物中。在 37°C 下孵育 30 分钟后，加入 400 μL 乙酸乙酯和 100 μL 蒸馏水终止反应，涡旋振荡 30 秒，然后短暂离心。取 300 μL 有机相转移至新的离心管中，用氮气吹干。用 30 μL 乙酸乙酯溶解类固醇，并将全部溶液点样于硅胶薄层色谱板上。底物和产物（11-脱氧皮质醇和皮质醇）在甲苯-丙酮 (7:2) 溶剂体系中分离。
细胞实验：在猴肾上腺细胞中，奥特罗内抑制 ACTH 刺激的 DHEA 和雄烯二酮的生成，IC50 值分别为 110 nM 和 130 nM。此外，奥特罗内尔还能有效抑制人肾上腺皮质肿瘤细胞系H295R中DHEA的生成，IC50值为37 nM。体外实验表明，奥特罗内尔对大鼠和人17,20-裂解酶均具有强效抑制活性，IC50值分别为54 nM和38 nM。而其他CYP同工酶，包括11-羟化酶和CYP3A4，则不受奥特罗内尔的显著影响。在表达人CYP同工酶的微粒体中，奥特罗内尔对17,20-裂解酶的抑制作用更强，IC50值为19 nM，高于对其他CYP同工酶的抑制作用。

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体外实验表明，奥特罗内尔对人17,20-裂解酶具有强效活性，IC50值为38 nM。该化合物对其他CYP酶的选择性超过1000倍，表明其具有良好的选择性，可最大限度地减少脱靶效应。在细胞实验中，Orteronel可抑制表达17,20-裂解酶的细胞中的雄激素合成，导致DHEA、雄烯二酮、睾酮和DHT的生成减少。该化合物的非甾体结构和高选择性使其成为研究雄激素合成及其在前列腺癌中作用的宝贵工具。Orteronel的活性已在多种体外系统中得到表征，证实了其作为17,20-裂解酶抑制剂的作用机制。

在食蟹猴中，口服1 mg/kg剂量的TAK-700可显著降低血清睾酮和脱氢表雄酮（DHEA）水平。口服1 mg/kg剂量的TAK-700可获得良好的药代动力学参数，其Tmax、Cmax、t1/2和AUC0-24小时分别为1.7小时、0.147 μg/mL、3.8小时和0.727 μg·h/mL。Orteronel已在临床前和临床研究中评估了其治疗前列腺癌的潜力。该化合物具有良好的口服生物利用度，并已被证明可降低体内雄激素水平。在临床前模型中，Orteronel可抑制雄激素依赖性前列腺癌异种移植瘤的生长。临床试验已对Orteronel在去势抵抗性前列腺癌患者中的应用进行了研究，包括单药治疗和与其他药物联合治疗。尽管Orteronel在降低PSA水平和延缓疾病进展方面显示出活性，但其临床开发最终还是终止了。即便如此，Orteronel仍然是研究雄激素合成和前列腺癌生物学的重要工具。详细的体内疗效数据和临床试验结果已发表在相关文献中。

猴17,20-裂解酶/17-羟化酶抑制活性测定[1]
17,20-裂解酶抑制活性测定方法参照文献并稍作修改。从两只完整的5岁雄性食蟹猴中取出肾上腺，在含有250 mmol/L蔗糖、25 mmol/L KCl、0.5 mM EDTA-K、1 mmol/L二硫苏糖醇、0.02 mg/mL苯甲基磺酰氟和20% (v/v)甘油的10 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.4）中匀浆。然后通过离心分离肾上腺微粒体，并将其悬浮于含有5 mmol/L MgCl2和25% (v/v)甘油的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒（美国加州赫拉克勒斯）测定微粒体组分的蛋白浓度。为评估类固醇生物合成，反应体系包含50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、5 μmol/L 17-α-羟基孕烯醇酮（相当于0.05 μL/管的17-α-羟基-[1,2(n)-3H]-孕烯醇酮，活度为1 mCi/mL，41.9 Ci/mmol）、NADPH生成系统（0.6 mmol/L β-NADP+、10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、5 mmol/L氯化镁、1.5 U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、2.5% (v/v)丙二醇、微粒体蛋白（终浓度为50 μg/mL）和待测化合物，总体积为200 μL。反应混合物在 37 °C 下孵育 120 分钟。反应底物和产物（DHEA、雄烯二酮）通过薄层色谱法（TLC，Whatman LHPK）在己烷：四氢呋喃（4:1）溶剂系统中分离。使用 BAS 2000 II 生物成像分析仪对 TLC 板上的相应区域进行鉴定并测定放射性，酶活性以 nmol/h/mg 蛋白表示。17-羟化酶活性测定与上述方法类似。以 5 μmol/L 孕烯醇酮（ICN Biomedicals）代替 17-α-羟基孕烯醇酮作为底物，其中包含相当于 0.05 μL/管 [7-3H (N)]-孕烯醇酮（1 mCi/mL，17.5 Ci/mmol），反应混合物孵育 5 分钟。底物和产物（17-α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮 (17-OHP)、脱氢表雄酮 (DHEA)、雄烯二酮、脱氧皮质醇）采用环己烷：乙酸乙酯 (3:2) 薄层色谱法分离，并按上述方法测定和表达活性。

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11-羟化酶活性测定[1]
猴11-羟化酶抑制活性测定方法参照文献并稍作修改。肾上腺按上述方法取出。肾上腺线粒体经离心制备，并悬浮于含5 mmol/L MgCl₂的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。线粒体组分的蛋白浓度采用Bio-Rad蛋白测定试剂盒（美国加州赫拉克勒斯）测定。反应混合物包含 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）、2 μmol/L 11-脱氧皮质醇（Pfaltz & Bauer，美国康涅狄格州），其中包含相当于 0.05 μL/管的羟基-11-脱氧皮质酮 [1,2-3H(N)]（NEN，56.8 Ci/mmol）、NADPH 生成系统（0.6 mmol/L β-NADP+、10 mmol/L 葡萄糖-6-磷酸、5 mmol/L 氯化镁、1.5 单位/mL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、10 mmol/L 氯化钙、5% (v/v) 丙二醇、线粒体蛋白（终浓度 50 μg/mL）以及待测化合物，总体积为 200 μL。反应混合物在 37 °C 下孵育 120 分钟。底物和产物（3H-皮质醇）在甲苯-丙酮（3.5:1）溶剂体系中分离。所有其他步骤均按上述方法进行，活性以nmol/h/mg蛋白表示。

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奥特罗内尔的体外酶抑制试验测定人17,20-裂解酶（CYP17A1）活性的抑制情况。将重组人CYP17A1酶与不同浓度的奥特罗内尔（通常为纳摩尔至微摩尔浓度）在底物（孕烯醇酮或孕酮）和辅因子NADPH存在下孵育。酶促反应进行固定时间后，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）或放射性测定法定量17,20-裂解酶产物（DHEA或雄烯二酮）的生成。通过将剂量-反应曲线拟合到抑制数据来确定IC50值。将化合物溶解于DMSO中，并用测定缓冲液稀释至所需最终浓度，所有孔中的DMSO浓度保持恒定。每次测定均包含适当的阳性对照（已知的17,20-裂解酶抑制剂）和阴性对照（DMSO溶剂）。

控制性腺雄激素生物合成的手术或药物方法是治疗多种非肿瘤性疾病和肿瘤性疾病的有效手段。例如，雄激素剥夺疗法及其导致的循环睾酮水平降低是治疗晚期前列腺癌的有效方法。然而，由于疾病进展至“去势抵抗性前列腺癌”（CRPC）状态，这种疗法的疗效往往是暂时的，而CRPC的治疗选择非常有限。CRPC的发生机制之一被认为是性腺外雄激素的合成，以及这些残留的性腺外雄激素对前列腺肿瘤细胞增殖的影响。CYP17A1是合成性腺外雄激素的重要酶，它同时具有17,20-裂解酶和17-羟化酶的催化活性，其中17,20-裂解酶活性在雄激素生物合成过程中起着关键作用。 Orteronel (TAK-700) 是一种新型、选择性强效的 17,20-裂解酶抑制剂，目前正在开发用于抑制雄激素合成。本研究通过评估 Orteronel 对去势和完整雄性食蟹猴口服给药后 CYP17A1 酶活性、猴肾上腺细胞和人肾上腺肿瘤细胞中类固醇生成以及血清脱氢表雄酮 (DHEA)、皮质醇和睾酮水平的影响，定量分析了 Orteronel 对睾丸和肾上腺雄激素生成的抑制活性和特异性。结果表明，Orteronel 能有效抑制猴肾上腺细胞中雄激素的生成，但对皮质酮和醛固酮的生成抑制作用较弱；Orteronel 对皮质醇的 IC50 值约为对 DHEA 的 3 倍。单次口服给药后，完整食蟹猴血清中DHEA、皮质醇和睾酮水平迅速降低。在去势猴中，每日两次服用奥特罗内，DHEA和睾酮的抑制作用持续整个治疗期间。在体内模型中，与我们的体外数据一致，口服给药后血清皮质醇水平的抑制程度低于DHEA。就人CYP17A1和人肾上腺肿瘤细胞而言，在无细胞酶活性测定中，奥特罗内对17,20-裂解酶活性的抑制作用比对17-羟化酶活性的抑制作用强5.4倍；在人肾上腺肿瘤细胞中，奥特罗内对DHEA生成的抑制作用比对皮质醇生成的抑制作用强27倍，这表明在人类中，奥特罗内对17,20-裂解酶和17-羟化酶活性的抑制特异性高于猴子。总之，奥特罗内能有效抑制猴和人CYP17A1的17,20-裂解酶活性，并降低猴体内血清雄激素水平。这些发现表明，奥特罗内可能是一种有效的治疗选择，用于治疗那些雄激素抑制至关重要的疾病，例如雄激素敏感性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌。[1]

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奥特罗内的体外细胞试验采用表达17,20-裂解酶并产生雄激素的细胞进行，例如睾丸间质细胞、肾上腺皮质细胞或雄激素依赖性前列腺癌细胞系（例如LNCaP）。将细胞培养在合适的培养基中，并用不同浓度的奥特罗内或溶剂对照（DMSO）处理。通过ELISA或LC-MS测定培养基中雄激素（睾酮、二氢睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮）的生成量。对雄激素生成的抑制情况进行定量，并确定IC50值。此外，还可以在雄激素依赖性前列腺癌细胞系中评估 Orteronel 对细胞增殖和前列腺特异性抗原 (PSA) 表达的影响。

溶于 0.5% 甲基纤维素溶液；≤1 mg/kg；灌胃给药。成年雄性食蟹猴。药代动力学研究[1]
[14C]orteronel 悬浮于 0.5% 甲基纤维素溶液中，以 1 mg (183 μCi)/kg 的剂量灌胃给药于喂食后的猴子。静脉注射时，[14C]orteronel 溶解于二甲基乙酰胺和生理盐水（体积比 1:4）的混合溶液中，以 0.5 mg (91 μCi)/kg 的剂量注射（体重 2.38–3.08 kg）。给药后5、10（仅限静脉给药）、15、30分钟以及1、2、3、4、6、8和24小时，从股静脉抽取血液，离心后获得血浆，并于-20℃冷冻保存直至分析。为定量血浆中[14C]奥特罗内尔，用甲醇（5倍体积）提取血浆，然后在室温下用氮气吹干。将残余物溶解于80%（体积比）甲醇水溶液中。使用预涂有硅胶60F254（0.25 mm厚）的薄层色谱板分离溶液组分，展开剂为氯仿-甲醇-28%氨水（10:4:0.2，体积比）。显影后，使用生物成像分析仪（BAS-2000 或 BAS-2000II）和成像板（BAS III；富士胶片株式会社）通过放射发光成像法定位板上的放射性区域；或者通过向测试样品中添加奥特罗内作为内标物，并测定其紫外吸收值来确定放射性区域；或者两者结合使用。将对应于奥特罗内的硅胶片从板上刮下，通过液体闪烁计数法测定各片的放射性，并根据比放射性计算奥特罗内的浓度。最大血浆浓度 (Cmax) 和达峰时间 (Tmax) 的值直接从数据中计算得出。血浆半衰期 (t1/2) 和血浆浓度-时间曲线下面积 (AUC) 分别使用 Microsoft Excel 95 软件通过线性回归分析和梯形法则计算得出。生物利用度 (BA) 在剂量标准化后确定。除非另有说明，[14C]orteronel 在血浆中的药代动力学参数以平均值或平均值±标准差 (SD) 表示，数据来自三只动物。[1]

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药效学研究中的给药和血液采样[1]
在所有口服给药实验中，给药前均采用放射免疫分析法 (RIA)（如上所述）测定血清 DHEA 和睾酮水平，以建立基线值。[1]
在单剂量实验中，20 只猴子被随机分为 5 组 (n = 4)。每组分别接受不同剂量的 orteronel 或赋形剂（0.5% 甲基纤维素，3 mL/kg）。口服给药时，将奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，于上午10点以0.3、1、3或10 mg/kg的剂量给药。分别于给药后48小时、24小时、给药前即刻以及给药后2、5、10、24和48小时采集血样，并将血清储存于−30 °C。[1]
在多剂量实验中，20只猴子被随机分为4组（n = 5）。每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以3、7.5和15 mg/kg的剂量，每日两次口服给药，持续7天。前6天，分别于上午10点和晚上10点左右给药；最后一天，于上午10点左右给药一次；另一组仅接受赋形剂（0.5%甲基纤维素溶液，3 mL/kg）。从给药前3天至末次给药后9小时，每天两次（大约下午2点和晚上7点，以补偿昼夜节律变化）采集血样。采集后，血清储存于−30 °C。[1]
还对去势雄性猴进行了多次给药研究。该研究中，6只去势猴被分为2组（n = 3），每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以7.5 mg/kg或15 mg/kg的剂量，每日两次（大约上午8点和晚上8点）口服给药，持续7天，前6天每日两次（大约上午8点和晚上8点），最后一天上午8点左右给药一次。从给药前3天至末次给药后9小时，每天两次（大约中午12点和下午5点）采集血样。在最后一次给予奥特罗内（Orteronel）后约1个月，6只去势猴中的5只接受了与奥特罗内相同的给药方案，仅给予赋形剂（0.5% (w/v) 甲基纤维素溶液，3 mL/kg）。随后采集全血，并按照奥特罗内给药期间所述方法处理血清。因此，在奥特罗内给药后1个月收集基线数据，以避免单独口服给药对激素昼夜节律模式的影响。所有血清样本中的类固醇浓度均采用放射免疫分析法（RIA）测定，方法如前所述。

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已使用免疫缺陷小鼠的雄激素依赖性前列腺癌异种移植模型进行了奥特罗内体内动物实验。将人前列腺癌细胞（例如LNCaP）皮下植入裸鼠或SCID小鼠的侧腹。当肿瘤达到预定大小时，将动物随机分为接受奥特罗内或赋形剂对照的治疗组。由于奥特罗内具有良好的口服生物利用度，因此采用不同剂量口服给药。每周使用卡尺测量两次肿瘤体积，并监测体重。检测血清雄激素水平（睾酮、二氢睾酮）以确认靶点结合情况。在研究终点，收集肿瘤组织用于分析雄激素受体信号传导、增殖标志物和细胞凋亡。通过比较治疗组和对照组的肿瘤生长情况来评估该化合物的抗肿瘤疗效。此外，还开展了针对去势抵抗性前列腺癌患者的临床试验。

将[14C]奥特隆尼口服给予完整猴子进行药代动力学分析。当剂量为1 mg/kg时，观察到Tmax、Cmax、t1/2和AUC0–24 h分别为1.7 h、0.147 μg/mL、3.8 h和0.727 μg·h/mL（表2）。总体而言，奥特隆尼显示出较高的生物利用度（BA）和合理的t1/2，这些都是口服给药的重要参数。考虑到体外抑制猴肾上腺细胞中DHEA生成所需的浓度>300 nmol/L (>0.1 μg/mL)（图2A），预计每日两次口服5-15 mg/kg的奥特罗奈德可使其达到维持17,20-裂解酶抑制所需的最低谷浓度，并显著降低血清DHEA水平（假设其药代动力学呈线性）[1]。

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奥特罗奈德具有口服生物利用度，因此适用于临床前和临床研究中的口服给药。该化合物的分子量为307.35，化学式为C18H17N3O2。外消旋混合物的CAS号为426219-18-3，S-对映异构体的CAS号为566939-85-3。奥特罗奈德可溶于DMSO，用于制剂配制。该化合物应储存于-20°C以确保长期稳定性（粉末状可稳定保存长达3年，溶液状可稳定保存6个月）。临床前和临床研究提供了详细的药代动力学参数，包括半衰期、清除率、分布容积和最大浓度（Cmax），可参考这些参数进行具体的实验设计。

Orteronel 的全面毒理学数据来自其在开发用于治疗前列腺癌期间开展的临床前和临床研究。作为一种研究级化合物，Orteronel（外消旋体）仅供实验室研究用途，尚未获准用于人体治疗。处理该化合物时应遵循标准的实验室安全操作规程，包括使用适当的个人防护装备并在通风良好的区域工作。应按照制造商的建议储存该化合物，以保持其稳定性并防止降解。虽然临床开发已终止，但临床前和临床研究的毒理学数据已发表在相关文献中，可供查阅以获取安全信息。

[1]. J Steroid Biochem Mol Biol.2012 Apr;129(3-5):115-28.
[2]. Bioorg Med Chem.2011 Nov 1;19(21):6383-99;

6-(7-羟基-5,6-二氢吡咯并[1,2-c]咪唑-7-基)-N-甲基-2-萘甲酰胺是一种萘甲酰胺。

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奥特罗内（外消旋体）是一种用于研究雄激素合成和前列腺癌的科研化合物。该化合物是人17,20-裂解酶（CYP17A1）的强效选择性抑制剂，IC50值为38 nM，对其他CYP酶的选择性超过1000倍。奥特罗内具有口服生物利用度，并已在去势抵抗性前列腺癌的临床前和临床研究中进行了评估。该化合物也称为TAK-700。虽然临床开发已终止，但奥特罗内仍然是研究雄激素合成和前列腺癌生物学的重要工具。外消旋混合物包含S-和R-对映异构体。奥特罗内可从多家化学品供应商处获得，用于科研用途。它的作用在于能够选择性地抑制 17,20-裂解酶并减少雄激素的产生。

C18H17N3O2

307.35

307.132

C, 70.34; H, 5.58; N, 13.67; O, 10.41

426219-18-3

426219-18-3 (racemic);566939-85-3 (s-isomer);

9883029

Solid powder

1.4±0.1 g/cm3

685.1±45.0 °C at 760 mmHg

368.2±28.7 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.695

-0.13

67.15

2

3

2

23

471

0

O=C(NC)C1=CC=C2C=C(C3(O)CCN4C=NC=C43)C=CC2=C1

OZPFIJIOIVJZMN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H17N3O2/c1-19-17(22)14-3-2-13-9-15(5-4-12(13)8-14)18(23)6-7-21-11-20-10-16(18)21/h2-5,8-11,23H,6-7H2,1H3,(H,19,22)

6-(7-hydroxy-5,6-dihydropyrrolo[1,2-c]imidazol-7-yl)-N-methylnaphthalene-2-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)