17,20-lyase/CYP17

体外活性：在体外，TAK-700 对大鼠和人类固醇 17,20-裂合酶显示出有效的抑制活性，IC50 分别为 54 nM 和 38 nM。而其他 CYP 同工型（包括 11-羟化酶和 CYP3A4）不受 TAK-700 的显着影响。在表达人 CYP 同工型的微粒体中，与其他 CYP 同工型相比，TAK-700 对 17,20-裂解酶表现出更大的抑制作用，IC50 为 19 nM。 TAK-700 对猴 17,20-裂解酶和 17-羟化酶具有抑制活性，IC50 分别为 27 nM 和 38 nM。在猴肾上腺细胞中，TAK-700 抑制 ACTH 刺激的 DHEA 和雄烯二酮的产生，IC50 分别为 110 nM 和 130 nM。此外，TAK-700 还可有效抑制人肾上腺皮质肿瘤系 H295R 细胞中 DHEA 的产生，IC50 为 37 nM。激酶测定：根据先前描述的侧链裂解活性的方法并进行一些修改来测量大鼠11-羟化酶活性。反应混合物含有200mM甘露醇、4.5mM HEPES、2.3mM磷酸钾(pH 7.4)、0.1mM EDTA·2K、0.03％BSA(结晶)、4.5mM NADPH、11mM氯化钙、4μg线粒体蛋白、 10 nM [1,2-3H]-羟基-11-脱氧皮质酮（11-脱氧皮质醇）（NEN，溶解在 0.02% Tween-80 中）和 1-1000 nM 测试化合物，总体积为 150 μL。试剂的浓度表示为反应混合物中的最终浓度。将测试化合物用二甲基甲酰胺连续稀释，并将1.5μL直接添加至反应混合物中。 37°C 孵育 30 分钟后，加入 400 μL 乙酸乙酯和 100 μL 蒸馏水终止反应，然后涡旋 30 秒并短暂离心。将三百微升有机相转移至新管中并使用氮气蒸发直至干燥。将类固醇用 30 μL 乙酸乙酯溶解，并将整个体积涂在硅胶 TLC 板上。底物和产物（11-脱氧皮质醇和皮质醇）在甲苯-丙酮（7:2）溶剂体系中分离。细胞测定：在猴肾上腺细胞中，orteronel 抑制 ACTH 刺激的 DHEA 和雄烯二酮的产生，IC50 分别为 110 nM 和 130 nM。此外，Orteronel 还有效抑制人肾上腺皮质肿瘤系 H295R 细胞中 DHEA 的产生，IC50 为 37 nM。在体外，orteronel 对大鼠和人类固醇 17,20-裂合酶显示出有效的抑制活性，IC50 分别为 54 nM 和 38 nM。而其他 CYP 亚型，包括 11-羟化酶和 CYP3A4，则不受 Orteronel 的显着影响。在表达人 CYP 同工型的微粒体中，与其他 CYP 同工型相比，Orteronel 对 17,20-裂解酶表现出更大的抑制作用，IC50 为 19 nM。

在食蟹猴中，口服 1 mg/kg 剂量的 TAK-700 可显着降低血清睾酮和脱氢表雄酮 (DHEA) 水平。以 1 mg/kg 剂量口服 TAK-700 可产生良好的药代动力学参数，Tmax、Cmax、t1/2 和 AUC0-24 小时分别为 1.7 小时、0.147 μg/mL、3.8 小时和 0.727 μg·h/mL，分别。

猴17,20-裂合酶/17-羟化酶抑制活性测定[1]
17,20-裂合酶抑制活性如所述进行了一些修改。从两只完整的5岁雄性食蟹猴身上切下的肾上腺在10 mmol/L HEPES缓冲液（pH 7.4）中均质化，该缓冲液含有250 mmol/L蔗糖、25 mmol/L KCl、0.5 mM EDTA 2 K、1 mmol/L二硫苏糖醇、0.02 mg/mL苯甲基磺酰氟和20%（v/v）甘油。然后通过离心分离肾上腺微粒体，并将其悬浮在含有5 mmol/L MgCl2和25%（v/v）甘油的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒（Hercules，CA，USA）测定微粒体部分的蛋白质浓度。为了评估类固醇生物合成，反应混合物含有50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、5μmol/L 17-α-羟基孕烯醇酮，包括相当于0.05μL/管17-α羟基-[1,2（n）-3H]-孕烯醇酮（1 mCi/mL，41.9 Ci/mmol）、NADPH生成系统（0.6 mmol/Lβ-NADP+，10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，5 mmol/L氯化镁，1.5单位/mL G-6-P脱氢酶）、2.5%（v/v）丙二醇、微粒体蛋白（50μG/mL，终浓度）和总体积为使用200μL。将反应混合物在37°C下孵育120分钟。在己烷：四氢呋喃（4:1）溶剂体系中，通过薄层色谱（TLC，Whatman LHPK）分离反应底物和产物（DHEA、雄烯二酮）。使用BAS 2000 II生物图像分析仪对TLC板上的适当区域进行鉴定并测量放射性，酶活性表示为nmol/h/mg蛋白质。 17-羟化酶活性的测定与上述类似。5μmol/L孕烯醇酮（ICN Biomedicals），包括相当于0.05μL/管[7-3H（N）]孕烯醇酮的当量（1 mCi/mL，17.5 Ci/mmol），取代17-α-羟基雷公藤酮作为底物，将反应混合物温育5分钟。在环己烷：乙酸乙酯（3:2）溶剂系统中，通过TLC分离底物和产物（17-α-Hydrophenolone，17α-羟基孕酮（17-OHP），DHEA，雄烯二酮，脱氧皮质醇），并如上所述测定和表示活性。

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11-羟化酶活性测定[1]
根据其他地方描述的方法，经过一些修改后，测定了对猴11-羟化酶的抑制活性。如上所述切除肾上腺。通过离心制备肾上腺线粒体，并将其悬浮在含有5 mmol/L MgCl2的50 mmol/L Tris·Cl缓冲液（pH 7.4）中。使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒（Hercules，CA，USA）测定线粒体部分的蛋白质浓度。反应混合物含有50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、2μmol/L 11-脱氧皮质醇（美国康涅狄格州普法尔茨和鲍尔公司），包括相当于0.05μL/管羟基-11-脱氧皮质酮、[1,2-3H（N）]（NEN，56.8 Ci/mmol）、NADPH生成系统（0.6 mmol/Lβ-NADP+，10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，5 mmol/L氯化镁，1.5单位/mL G-6-P脱氢酶）、10 mmol/L氯化钙、5%（v/v）丙二醇、线粒体蛋白（50μG/mL，终浓度）和总体积为200μL。将反应混合物在37°C下孵育120分钟。底物和产物（3H-皮质醇）在甲苯-丙酮（3.5:1）溶剂体系中分离。所有其他程序均如上所述进行，活性以nmol/h/mg蛋白质表示。

控制性腺雄激素生物合成的手术或药物方法是治疗各种非肿瘤性和肿瘤性疾病的有效途径。例如，雄激素消融及其导致的循环睾酮水平的降低是晚期前列腺癌的有效治疗方法。不幸的是，这种方法的治疗效果往往是暂时的，因为疾病进展到“去势抵抗”(CRPC)状态，这种情况下的治疗选择有限。一种被认为是导致CRPC发生的机制是生殖腺外雄激素的合成以及这些残留的生殖腺外雄激素对前列腺肿瘤细胞增殖的影响。负责合成性腺外雄激素的一个重要酶是CYP17A1，它具有17,20-裂解酶和17-羟化酶的催化活性，其中17,20-裂解酶的活性是雄激素生物合成过程的关键。Orteronel (TAK-700)是一种新型的，选择性的，有效的17,20-裂解酶抑制剂，作为一种抑制雄激素合成的药物正在开发中。在本研究中，我们通过评估其对阉割和完整雄性食环猴口服给药后对CYP17A1酶活性、猴肾上腺细胞和人肾上腺肿瘤细胞中类固醇生成以及血清脱氢表雄酮(DHEA)、皮质醇和睾酮水平的影响，量化了orteronel对睾丸和肾上腺雄激素产生的抑制活性和特异性。我们报道，奥特龙能有效抑制猴子肾上腺细胞雄激素的产生，但仅微弱地抑制皮质酮和醛固酮的产生;奥特罗内酯对皮质醇的IC(50)值比对DHEA的IC(50)值高3倍。单次口服给药后，完整食蟹猴的血清脱氢表雄酮、皮质醇和睾酮水平迅速被抑制。在被阉割的猴子中，每天用奥特罗奈治疗两次，在整个治疗期间，DHEA和睾酮的抑制持续存在。在体内模型和与我们的体外数据一致，口服给药后血清皮质醇水平的抑制低于DHEA。在人CYP17A1和人肾上腺肿瘤细胞中，在无细胞酶测定中，orteronel抑制17,20-裂解酶活性的效力是17-羟化酶活性的5.4倍，在人肾上腺肿瘤细胞中，DHEA产生的效力是皮质醇产生的27倍，这表明在人与猴子中，17,20-裂解酶和17-羟化酶活性的抑制具有更大的特异性。综上所述，奥特罗内酯能有效抑制猴和人体内CYP17A1的17,20裂解酶活性，降低猴体内血清雄激素水平。这些发现表明，对于雄激素抑制至关重要的疾病，如雄激素敏感和CRPC，奥特罗奈可能是一种有效的治疗选择。[1]

\n\n\n药代动力学研究[1]
\n\n[14C]orteronel 悬浮于 0.5% 甲基纤维素溶液中，以 1 mg (183 μCi)/kg 的剂量灌胃给予喂食的猴子。静脉注射时，将[14C]orteronel溶解于二甲基乙酰胺和生理盐水（体积比1:4）的混合溶液中，注射剂量为0.5 mg (91 μCi)/kg（体重2.38–3.08 kg）。分别于给药后5、10（仅限静脉注射）、15、30分钟以及1、2、3、4、6、8和24小时，从股静脉抽取血液，离心后获得血浆，并将血浆冷冻于−20 °C直至分析。为定量血浆中的[14C]orteronel，用甲醇（5倍体积）提取血浆，然后在室温下用氮气吹干。将残余物溶解于80%（体积比）甲醇水溶液中。使用预涂有硅胶 60F254（厚度 0.25 mm）的薄层色谱板分离溶液组分，展开剂为氯仿-甲醇-28% 氨水（体积比 10:4:0.2）。展开后，使用生物成像分析仪（BAS-2000 或 BAS-2000II）和成像板（BAS III；富士胶片株式会社）通过放射自显影法定位板上的放射性区域，或通过向测试样品中添加奥特罗内作为内标物进行紫外吸收定位，或两者结合使用。刮取与奥特罗内对应的硅胶层，通过液体闪烁计数法测定各层的放射性，并根据比放射性计算奥特罗内的浓度。最大血浆浓度 (Cmax) 和达峰时间 (Tmax) 的值直接从数据中计算得出。使用 Microsoft Excel 95，分别采用线性回归分析和梯形法则计算血浆半衰期 (t1/2) 和血浆浓度-时间曲线下面积 (AUC)。生物利用度 (BA) 在剂量标准化后测定。除非另有说明，血浆中 [14C]orteronel 的药代动力学参数以三只动物结果的平均值或平均值±标准差 (SD) 表示。[1]

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\n\n药效学研究中的给药和血液采样[1]
\n\n在所有口服给药实验中，给药前均采用放射免疫分析法 (RIA)（如上所述）测定血清 DHEA 和睾酮水平，以建立基线值。[1]
\n\n在单剂量实验中，20 只猴子随机分为 5 组 (n = 4)。每组分别接受不同剂量的 orteronel 或赋形剂（0.5% 甲基纤维素，3 mL/kg）。口服给药时，将奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，于上午10点以0.3、1、3或10 mg/kg的剂量给药。分别于给药后48小时、24小时、给药前以及给药后2、5、10、24和48小时采集血样，并将血清储存于−30 °C。[1]
\n\n在多剂量实验中，20只猴子被随机分为4组（n = 5）。每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以3、7.5和15 mg/kg的剂量，每日两次口服给药，持续7天。前6天，给药时间约为上午10点和晚上10点；最后一天，给药时间约为上午10点；另一组仅接受赋形剂（0.5%甲基纤维素溶液，3 mL/kg）。从给药前3天至末次给药后9小时，每天两次（大约下午2点和晚上7点，以补偿昼夜节律变化）采集血样。采集后，血清储存于−30 °C。[1]
\n\n此外，还对去势雄性猴子进行了多次给药研究。该研究中，6只去势猴子被分为2组（n = 3），每组接受不同剂量的奥特罗内尔。奥特罗内尔悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，以7.5或15 mg/kg的剂量，每日两次（大约上午8点和晚上8点）口服给药（3 mL/kg），持续7天。前6天每日两次给药（大约上午8点和晚上8点），最后一天上午8点左右给药一次。从给药前3天至末次给药后9小时，每天两次（大约中午12点和下午5点）采集血样。在最后一次给予奥特罗内（orteronel）后约1个月，6只去势猴中的5只接受了与奥特罗内相同的给药方案，仅给予赋形剂（0.5% (w/v) 甲基纤维素溶液，3 mL/kg）。随后采集全血，并按照奥特罗内给药期间所述方法处理血清。因此，在奥特罗内给药后1个月收集基线数据，以避免单独口服给药对激素昼夜节律模式的影响。所有血清样本中的类固醇浓度均采用放射免疫分析法（RIA）测定，方法如前所述。

溶于 0.5% 甲基纤维素；≤1 mg/kg；灌胃

成年雄性食蟹猴。

将[14C]奥特罗内口服给予完整猴子进行药代动力学分析。当给药剂量为1 mg/kg时，观察到Tmax、Cmax、t1/2和AUC0–24 h分别为1.7 h、0.147 μg/mL、3.8 h和0.727 μg·h/mL（表2）。总的来说，奥特罗内表现出较高的生物利用度（BA）和合理的t1/2，这些都是口服给药的重要参数。考虑到在猴肾上腺细胞体外抑制DHEA生成所需的浓度>300 nmol/L（>0.1 μg/mL）（图2A），预计每日两次口服5–15 mg/kg的剂量可使奥特罗内达到维持17,20-裂解酶抑制所需的最低谷浓度，并显著降低血清DHEA水平（假设药代动力学呈线性特征）[1]。

[1]. J Steroid Biochem Mol Biol.2012 Apr;129(3-5):115-28.
[2]. Bioorg Med Chem.2011 Nov 1;19(21):6383-99;

6-(7-羟基-5,6-二氢吡咯并[1,2-c]咪唑-7-基)-N-甲基-2-萘甲酰胺是一种萘甲酰胺。

C18H17N3O2

307.35

307.132

C, 70.34; H, 5.58; N, 13.67; O, 10.41

426219-18-3

426219-18-3 (racemic);566939-85-3 (s-isomer);

9883029

Solid powder

1.4±0.1 g/cm3

685.1±45.0 °C at 760 mmHg

368.2±28.7 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.695

-0.13

67.15

2

3

2

23

471

0

O=C(NC)C1=CC=C2C=C(C3(O)CCN4C=NC=C43)C=CC2=C1

OZPFIJIOIVJZMN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H17N3O2/c1-19-17(22)14-3-2-13-9-15(5-4-12(13)8-14)18(23)6-7-21-11-20-10-16(18)21/h2-5,8-11,23H,6-7H2,1H3,(H,19,22)

6-(7-hydroxy-5,6-dihydropyrrolo[1,2-c]imidazol-7-yl)-N-methylnaphthalene-2-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)