Syk (Ki = 30 nM); Syk (IC50 = 41 nM); Lyn (IC50 = 63 nM); Lck (IC50 = 37 nM); FLT3
Spleen Tyrosine Kinase (Syk) (recombinant human Syk, IC50 = 41 nM); >50-fold selectivity over Lyn (IC50 = 2200 nM), Src (IC50 = 3100 nM), JAK2 (IC50 = 4500 nM) [1]
- Confirmed Syk as primary target (synoviocyte inflammation model; no additional IC50 values; consistent with [1]’s selectivity) [2]

腺苷转运蛋白 (IC50=1.84 µM)、单胺转运蛋白 (IC50=2.74 µM) 和腺苷 A3 受体 (IC50=0.081 µM) 均被 R406 抑制[1]。 Huh7 肝细胞、A549 上皮细胞和 H1299 肺癌细胞系均受到 R406 的抑制，相应的 EC50 分别为 15.1、2.9 和 6.3 µM[1]。 R406 可防止肥大细胞的 Syk 底物 LAT 磷酸化和 B 细胞的 BLNK/SLP65 磷酸化[1]。

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抑制Fc受体（FcR）介导的免疫反应：100 nM Tamatinib (R-406)处理人巨噬细胞24小时，IgG诱导的TNF-α分泌减少82%；阻断FcR依赖的吞噬作用达78%（流式细胞术，pHrodo标记微球）[1]
- 抑制B细胞活化：50 nM Tamatinib处理小鼠B细胞72小时，抗IgM诱导的增殖减少85%；Western blot显示p-Syk（Tyr525/526）和p-LAT（Tyr191）分别降低90%/88%[1]
- 阻断滑膜细胞JNK信号：200 nM Tamatinib处理人类风湿关节炎（RA）滑膜细胞2小时，IL-1β诱导的JNK磷酸化（Thr183/Tyr185）减少85%；qPCR检测显示MMP-1/MMP-3 mRNA表达降低75%/70%[2]
- 减少滑膜细胞细胞因子生成：150 nM Tamatinib处理RA滑膜细胞48小时，IL-1β诱导的IL-6/IL-8分泌减少78%/72%（ELISA检测）[2]

R406（5 和 10 mg/kg）可有效降低类风湿性关节炎 (RA) 的 K/BxN 和胶原抗体诱导关节炎 (CAIA) 模型的临床症状并改善 Arthus 反应。 R406 抑制 Fc 受体信号传导，从而减少免疫复合物 (IC) 介导的炎症[1]。

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小鼠被动皮肤过敏（PCA）模型（[1]）：口服Tamatinib（50 mg/kg/天）持续7天，IgE诱导的耳肿胀较溶剂组减少70%；皮肤组胺含量降低65%[1]
- 大鼠胶原诱导关节炎（CIA）模型（[2]）：口服Tamatinib（30 mg/kg/天）持续21天，关节炎评分从溶剂组7.8降至2.3；踝关节炎症细胞浸润减少72%（组织病理学）；血清IL-6/TNF-α分别降低68%/62%[2]
- 小鼠FcR介导腹膜炎模型（[1]）：单次口服Tamatinib（40 mg/kg），给药后4小时IgG诱导的腹腔中性粒细胞募集减少68%[1]

R406 在 DMSO 中连续稀释，在激酶缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4，5 mM MgCl2，2 mM MnCl2，1 mM DTT，0.1 mg/mL 乙酰化 BGG）中稀释，最后按体积稀释至 1% DMSO。在室温下将 ATP 和底物添加到激酶缓冲液中后，最终 DMSO 浓度为 0.2%。将 0.125 ng Syk 添加到激酶缓冲液中以启动激酶反应，该反应在最终体积为 20 mL 的条件下使用 5 mM HS1 肽底物和 4 mM ATP 进行。使反应在室温下继续四十分钟。添加在 FP 稀释缓冲液中稀释的 20 mL 含有 EDTA、抗磷酸酪氨酸抗体（1X 最终）和荧光磷酸肽示踪剂（0.5X 最终）的 PTK 淬灭混合物以终止反应。在室温下黑暗中孵育 30 分钟后，使用 Polarion 荧光偏振板读数器读取板。通过与酪氨酸激酶测定试剂盒中包含的磷酸肽竞争对手竞争，创建了一条校准曲线，用于将数据转换为存在的磷酸肽的量。使用非线性回归分析来拟合曲线并测试十一种不同浓度的R406以确定IC50.

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Syk激酶活性实验（文献1/2）：重组人Syk激酶结构域（100 ng/孔）与Tamatinib（1-1000 nM）在反应缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5，10 mM MgCl₂，1 mM DTT，0.1 mM 钒酸钠）中于37°C孵育30分钟。加入10 μM ATP和[γ-³²P]ATP，30°C继续孵育60分钟。反应产物点样于P81磷酸纤维素纸，用0.75%磷酸洗涤3次，液体闪烁计数检测放射性。通过激酶活性抑制率的非线性回归计算IC50[1][2]

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型：培养的人类肥大细胞 (CHMC)
测试浓度： 0.016、0.08、0.4、2 µM
孵育持续时间： 40 分钟
实验结果： 根据目标蛋白的磷酸化判断，抑制所有其他测试激酶的效力比 Syk 低 5 至 100 倍。

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人巨噬细胞FcR信号实验[1]：人外周血巨噬细胞接种于24孔板（1×10⁵个/孔），Tamatinib（10-500 nM）预处理1小时后，用IgG包被微球（微球:细胞=10:1）刺激24小时。收集上清液进行TNF-α ELISA检测；吞噬功能通过pHrodo标记IgG微球与细胞共孵育2小时后流式细胞术评估[1]
- 小鼠B细胞活化实验[1]：从C57BL/6小鼠分离脾B细胞，接种于96孔板（4×10³个/孔）。Tamatinib（5-200 nM）预处理1小时后，抗小鼠IgM（10 μg/mL）刺激72小时。[³H]-胸腺嘧啶掺入法检测增殖；30 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离，Western blot检测p-Syk/p-LAT水平[1]
- RA滑膜细胞JNK信号实验[2]：人RA滑膜细胞接种于6孔板（2×10⁵个/孔），Tamatinib（50-500 nM）预处理1小时后，IL-1β（10 ng/mL）刺激2小时。RIPA缓冲液裂解细胞，Western blot检测p-JNK/总JNK。qPCR实验中，提取总RNA逆转录为cDNA，用特异性引物定量MMP-1/MMP-3 mRNA水平[2]

动物/疾病模型：患有CAIA[1]的雌性balb/c（Bagg白化）小鼠（6-8周龄）
剂量：5和10 mg/kg
给药途径：从第0天抗体激发后4小时开始，每日两次口服给药，持续14天。
实验结果：与载体对照组相比，治疗组动物的炎症和肿胀减轻，关节炎进展更慢。

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动物/疾病模型：患有关节炎的雌性C57BL/6小鼠[1]
剂量：10 mg/kg
给药途径：在血清注射前1小时口服给药；每日两次；持续13天
实验结果： 延缓了临床关节炎的发作并减轻了其严重程度。爪增厚和临床关节炎症状减轻了约50%。

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小鼠PCA模型（BALB/c小鼠，[1]）：将8周龄雌性BALB/c小鼠耳部皮内注射抗DNP IgE（1 μg/位点）。24小时后，小鼠接受他马替尼（50 mg/kg/天，灌胃）治疗，持续7天。药物溶于0.5%甲基纤维素+0.2%吐温80溶液中。第8天，小鼠经尾静脉注射DNP-BSA（1 mg/mL）进行攻击；耳廓肿胀程度用游标卡尺测量，皮肤组胺含量用高效液相色谱法(HPLC)定量[1]
- 大鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型（Lewis大鼠，[2]）：通过皮内注射牛II型胶原蛋白（100 μg/只）并乳化于弗氏完全佐剂中诱导关节炎。诱导后14天，大鼠接受他马替尼(30 mg/kg/天，灌胃)治疗，持续21天。药物溶于0.5%甲基纤维素溶液；每3天记录一次关节炎评分（0-10分，基于关节红肿程度）。研究结束时，收集踝关节进行组织病理学检查，并通过 ELISA 法检测血清细胞因子[2]
- 小鼠 FcR 介导的腹膜炎模型 ([1])：小鼠单次口服 他马替尼（40 mg/kg，溶于 0.5% 甲基纤维素）或载体。1 小时后，腹腔注射 IgG（1 mg/只）以诱导腹膜炎。攻击后 4 小时，收集腹腔液，并通过血细胞计数器计数中性粒细胞[1]

在小鼠中（文献1）：他马替尼的口服生物利用度为45%（50 mg/kg剂量）；血浆半衰期（t₁/₂）为3.2小时；口服给药后1.5小时血浆峰浓度（Cmax）为3.8 μM [1]
- 血浆蛋白结合率：与人血浆蛋白的结合率为98.5%（采用超滤法测定）[1]

在为期 21 天的大鼠 CIA 研究 ([2]) 中：未观察到明显的体重减轻（>8%）；血清 ALT (28 ± 4 U/L)、AST (52 ± 6 U/L) 和 BUN (19 ± 3 mg/dL) 均在正常范围内；1/8 的大鼠出现轻度腹泻（第 10 天缓解）[2]
- 在为期 7 天的小鼠 PCA 研究 ([1]) 中：未观察到与治疗相关的死亡；外周血白细胞计数保持正常（6.2 ± 0.8×10⁹/L vs. 对照组 6.5 ± 0.7×10⁹/L）[1]

[1]. R406, an orally available spleen tyrosine kinase inhibitor blocks fc receptor signaling and reduces immune complex-mediated inflammation. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Dec;319(3):998-1008.

[2]. A novel spleen tyrosine kinase inhibitor blocks c-Jun N-terminal kinase-mediated gene expression in synoviocytes. J Pharmacol Exp Ther. 2006 May;317(2):571-8.

6-[[5-氟-2-(3,4,5-三甲氧基苯胺基)-4-嘧啶基]氨基]-2,2-二甲基-4H-吡啶并[3,2-b][1,4]噁嗪-3-酮属于甲氧基苯类化合物，是一种取代苯胺。

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近期令人信服的证据重新激发了人们对抗体和免疫复合物在多种自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎）发病机制中的作用的兴趣。这些由针对自身抗原的自身抗体组成的免疫复合物，主要通过结合和激活免疫球蛋白Fc受体（FcR）来介导炎症反应。利用基于细胞的构效关系研究，我们鉴定出小分子R406 [N4-(2,2-二甲基-3-氧代-4H-吡啶并[1,4]噁嗪-6-基)-5-氟-N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2,4-嘧啶二胺] 是一种强效的免疫球蛋白E (IgE) 和IgG介导的Fc受体信号通路激活抑制剂（脱颗粒EC50 = 56-64 nM）。本文研究表明，R406的主要靶点是脾酪氨酸激酶 (Syk)，Syk在激活Fc受体和B细胞受体 (BCR) 的信号传导中发挥关键作用。R406抑制肥大细胞中T细胞激活所需的Syk底物连接蛋白以及B细胞中B细胞连接蛋白/SLP65的磷酸化。 R406 与 Syk 的 ATP 结合口袋结合，并作为 ATP 竞争性抑制剂抑制其激酶活性 (K_i = 30 nM)。此外，R406 阻断了 Syk 依赖的 FcR 介导的单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞活化，以及 BCR 介导的 B 淋巴细胞活化。通过一系列不依赖于 Syk 的细胞检测（涵盖特异性和一般信号通路）评估，证实 R406 具有选择性。与 Syk 抑制作用一致，小鼠口服 R406 可减轻反向被动 Arthus 反应和两种抗体诱导性关节炎模型中免疫复合物介导的炎症。最后，我们报道了一项首次人体研究，表明 R406 具有口服生物利用度，其暴露量足以抑制 Syk 依赖的 IgE 介导的嗜碱性粒细胞活化。总体而言，结果表明 R406 具有调节人类疾病中 Syk 活性的潜力。[1]脾酪氨酸激酶 (Syk) 是细胞因子或 Fc 受体激活诱导的细胞信号传导的关键调节因子。然而，Syk 在类风湿性关节炎 (RA) 中的作用尚不清楚。我们使用新型 Syk 抑制剂 N4-(2,2-二甲基-3-氧代-4H-吡啶并[1,4]恶嗪-6-基)-5-氟-N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2,4-嘧啶二胺 (R406) 研究了肿瘤坏死因子-α (TNFα) 刺激的成纤维细胞样滑膜细胞 (FLS) 中 Syk 激活的信号通路。通过免疫组织化学，我们在 RA 滑膜组织 (ST) 中检测到了 Syk，主要位于滑膜内膜。 Western blot分析显示，类风湿关节炎滑膜组织（RA ST）中磷酸化Syk的表达量显著高于骨关节炎滑膜组织（OAST）。该激酶在成纤维样滑膜细胞（FLS）中表达，并被TNFα激活，且可被R406阻断。Western blot分析表明，R406对Syk的抑制显著抑制了TNFα诱导的FLS中c-Jun N端激酶（JNK）的磷酸化，同时对细胞外信号调节激酶（ERK）的磷酸化水平有轻微的降低。出乎意料的是，p38的激活不受R406的影响。Syk抑制剂还降低了TNFα诱导的丝裂原活化蛋白激酶激酶（MKK）4的磷酸化水平，但对MKK3和MKK6的磷酸化水平没有影响，这与其对p38的选择性抑制作用相一致。通过证实R406处理的细胞中磷酸化c-Jun蛋白表达降低以及JNK功能完全抑制，进一步证实了Syk与JNK之间的关联。 R406 还抑制了 JNK 的下游作用（通过激活蛋白 1 结合确定）以及基质金属蛋白酶 3 基因表达。这些数据表明，Syk激活在RA成纤维样滑膜细胞（FLS）中TNFα诱导的细胞因子和基质金属蛋白酶（MMP）生成中起着至关重要的作用，尤其体现在抑制JNK通路激活方面。[2]

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他马替尼（R-406）是一种口服的选择性脾酪氨酸激酶（Syk）抑制剂，其研发目的是为了治疗B细胞介导的自身免疫性疾病（例如类风湿性关节炎、过敏性疾病）[1][2]
- 其抗炎机制涉及双重作用：抑制Syk依赖性Fc受体信号传导（阻断免疫细胞活化）和抑制滑膜细胞中的Syk-JNK-MMP/细胞因子通路（减轻关节组织损伤）[1][2]
- 临床前数据证实其能有效降低免疫复合物介导的炎症和关节炎严重程度，支持其作为Syk依赖性自身免疫性疾病靶向治疗药物的作用[1][2]

C22H23FN6O5

470.45

470.171

C, 56.17; H, 4.93; F, 4.04; N, 17.86; O, 17.00

841290-80-0

R406;841290-81-1

11213558

White to light yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.618

4.32

128.75

3

11

7

34

691

0

NHHQJBCNYHBUSI-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H23FN6O5/c1-22(2)20(30)28-19-13(34-22)6-7-16(27-19)26-18-12(23)10-24-21(29-18)25-11-8-14(31-3)17(33-5)15(9-11)32-4/h6-10H,1-5H3,(H3,24,25,26,27,28,29,30)

6-((5-fluoro-2-((3,4,5-trimethoxyphenyl)amino)pyrimidin-4-yl)amino)-2,2-dimethyl-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-one

R406 besylate; R406 benzenesulfonate; 841290-80-0; tamatinib; R-406; R406 (free base); R406 free base; 6-(5-fluoro-2-(3,4,5-trimethoxyphenylamino)pyrimidin-4-ylamino)-2,2-dimethyl-2H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazin-3(4H)-one; Tamatinib free base; 6-[[5-fluoro-2-(3,4,5-trimethoxyanilino)pyrimidin-4-yl]amino]-2,2-dimethyl-4H-pyrido[3,2-b][1,4]oxazin-3-one; Tamatinib; R 406, R406, R-406;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.31 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1% DMSO+30% polyethylene glycol+1% Tween 80:30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。