EZH2 (Ki = 2.5 nM); EZH2 (IC50s = 11 nM, 16 nM)

体外活性：EPZ-6438 浓度依赖性地降低野生型或 SMARCB1 突变细胞中的整体 H3K27Me3 水平，并在 SMARCB1 缺失的 MRT 细胞系中诱导强烈的抗增殖作用，IC50 范围为 32 nM 至 1000 nM。 EPZ-6438 诱导神经元分化和细胞周期抑制的基因表达，同时抑制 Hedgehog 通路基因 MYC 和 EZH2 的表达。在几种 EZH2 突变淋巴瘤细胞系中，泼尼松龙或地塞米松可增强 EPZ-6438 的抗增殖作用。激酶测定：EPZ-6438 在 1X 测定缓冲液（20 mM Bicine [pH 7.6]、0.002% Tween-20、每孔 40 μL 5 nM PRC2（50 μL 中的最终测定浓度为 4 nM）中孵育 30 分钟， 0.005% 牛皮明胶和 0.5 mM DTT）。每孔添加 10 μL 底物混合物，其中包含测定缓冲液 3 H-SAM、未标记的 SAM 和代表组蛋白 H3 残基 21-44 的肽（含有 C 端生物素（附加到 C 端酰胺封端的赖氨酸））以启动反应（两种底物以其各自的 Km 值存在于最终反应混合物中，这种测定形式称为“平衡条件”。针对每种酶指示了底物的最终浓度和底物肽的甲基化状态。反应孵育室温下 90 分钟，每孔加入 10 μL 600 μM 未标记 SAM，然后转移至 384 孔 flashplate，30 分钟后清洗。 细胞测定：对于贴壁细胞系增殖测定，每个细胞系的铺板密度为根据生长曲线（通过 ATP 含量测量）和 7 天时间过程中的密度确定。在化合物处理前一天，将细胞一式三份接种在 96 孔板中（第 0-7 天的时间过程）或6 孔板（用于在第 7 天重新接种以完成剩余的时间过程）。第 0 天，细胞未经处理、DMSO 处理或用 EPZ-6438 处理（从 10 µM 开始并以三倍或四倍稀释度逐渐减少）。使用 Cell Titer Glo 在第 0 天、第 4 天和第 7 天对板进行读数，并在第 4 天补充化合物/培养基。在第 7 天，将六孔板用胰蛋白酶消化、离心并重悬于新鲜培养基中，以便通过以下方法进行计数： Vi-细胞。将每次处理的细胞以原始密度重新接种到 96 孔板中，一式三份。让细胞在平板上粘附过夜，并按第 0 天处理细胞。在第 7、11 和 14 天，使用 Cell Titer Glo 读取平板，并在第 11 天补充化合物/培养基。一式三份的平均值为用于绘制随时间变化的增殖曲线，并计算 IC50 值。对于细胞周期和细胞凋亡，将 G401 和 RD 细胞以每板 1 × 106 个细胞的密度一式两份铺在 15 cm 培养皿中。将细胞与 1 µM 的 EPZ-6438（总共 25 mL）一起孵育 14 天，并在第 4、7 和 11 天将细胞分裂回原始铺板密度。细胞周期分析和 TUNEL 测定使用番石榴流式细胞仪按照制造商的方案进行。

在携带 sc G401 异种移植物的 SCID 小鼠中，Tazemetostat (EPZ6438)在给药期间诱导肿瘤停滞，并产生显着的肿瘤生长延迟，而对体重的影响最小。

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Tazemetostat (EPZ6438)导致SMARCB1突变体MRT异种移植物完全和持续的退化 在移植了s.c G401异种移植物的SCID小鼠中进行了一项研究，动物口服EPZ-6438 21 d。每组一半的小鼠在第21天被安乐死以收集血液和组织，而其余的动物被额外治疗7天，然后不给药32天。EPZ-6438在所有剂量下都具有良好的耐受性，对体重的影响最小（图S4A）。口服剂量为250或500 mg/kg，每日两次（BID），持续21-28天，几乎消除了快速生长的G401肿瘤（图S4 B和C以及图4A）。停药后32 d未见再生。以125 mg/kg剂量给药的EPZ-6438在给药期间诱导肿瘤停滞，给药后肿瘤生长明显延迟。在第21天给药前5分钟或给药后3小时测量EPZ-6438血浆水平显示出明显的剂量依赖性全身暴露增加（图S4D）。在第21天，从各组小鼠亚群中收获的肿瘤显示出对H3K27Me3的强烈抑制，与抗肿瘤活性相关(在250 mg/kg时达到最大效果；图4 b)。此外，在G401异种移植肿瘤中检测到CD133、PTPRK、DOCK4和GLI1表达的剂量依赖性变化。

生化酶测定[2]
重组纯化的人PRC2复合物含有WT EZH2、Y641 EZH2突变体、A677G EZH2或WT EZH1，如前所述1,2。鸡红细胞寡核小体按照前面描述的方法纯化。生物素化组蛋白肽由21世纪生物化学公司合成，高效液相色谱纯化纯度为95%。384孔闪片和Microscint 0闪烁液购自商业公司，96孔Multiscreen HTS滤网结合板购自Millipore公司。3H标记的S-腺苷蛋氨酸（3H- SAM）经市售获得，比活性为80 Ci/mmol。未标记的SAM和S-‐腺苷型同型半胱氨酸（SAH）在商业上获得。闪光板在Biotek ELx- 405中用0.1%的Tween洗涤。384孔闪光板和96孔滤镜结合板在TopCount微孔板读取仪上读取。在Freedom EVO上进行化合物系列稀释，并使用Thermo Scientific Matrix PlateMate将其标记到分析板上。

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酶抑制IC50值测定[2]
EPZ005687在DMSO中连续稀释3倍，从2.5 mM开始（化合物的最终最高浓度为50 μM， DMSO为2%），绘制10点曲线。在384孔微滴板上检测1 μL抑制剂稀释系列。100%抑制对照为1mm终浓度的产物抑制剂S—‐腺苷型同型半胱氨酸（SAH）。化合物在1X缓冲液（20 mM比辛[pH 7.6]， 0.002%吐温20,0.005%牛皮明胶和0.5 mM DTT）中以每孔40 μL 5 nM PRC2 （50 μL最终测定浓度为4 nM）孵育30 min。每孔加入10 μL的底物混合物，包括实验缓冲液3H- SAM，未标记的SAM和代表组蛋白H3残基21 - 44的肽，其中含有C-末端生物素（附加在C-末端酰胺覆盖的赖氨酸上），以启动反应(两种底物都以各自的Km值存在于最终的反应混合物中，实验格式称为“平衡条件”4。底物的最终浓度和底物肽的甲基化状态在补充表7中显示。反应在室温下孵育90分钟，用每孔10 μL的600 μM未标记的SAM淬灭，然后转移到384孔的Flashplate上，30分钟后清洗。

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EPZ005687——底物竞争[2]
384孔中50 μL总容积的SAM竞赛实验条件与IC50实验相似，但有以下不同。EPZ005687在DMSO（终浓度2%）中连续稀释2倍，得到10点曲线。在0.012 ~ 15 μM范围内对SAM进行滴定。为了监测反应，在每个反应中使用放射性示踪剂3H—‐SAM，相当于高达250 nM（占总SAM浓度）。当SAM浓度小于250 nM时，反应中只含有3H—‐SAM。每个SAM浓度都有对应的孔，反应中不存在酶作为阴性对照，以减去3H—‐SAM对背景信号的贡献。反应孵育90 min后，以每孔10 μL的600 μM SAM溶液淬灭。寡核小体竞争在与IC50测定中描述的相同的实验缓冲液中以96孔格式进行，只是补充了100 mM KCl。EPZ005687在DMSO（终浓度2%）中连续稀释2倍，得到10点曲线。寡核小体用2倍稀释方案滴定8个点，最高浓度为500 nM，最终酶反应体积为50 μL。反应通过加入SAM和3H-‐SAM的混合物开始，最终浓度分别为450和150 nM。加入10 μL的SAM （600 μM）淬灭反应，并将30 μL的反应加入96孔过滤结合板中。用200 μL 10%三羧酸洗涤3次，再用95%乙醇洗涤1次。将膜风干，加入30 μL Microscint 0，然后在TopCount中读取。

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磁下拉EZH2以确定EPZ005687对PRC2复合物内蛋白-蛋白相互作用的影响[2]
Anti- FLAG M2磁珠的50%悬浮液在1X实验缓冲液中洗涤3次，缓冲液由20 mM比辛（pH = 7.6）和0.002% Tween20组成。含有FLAG标记EED的PRC2复合物（500 nM）与10 μM EPZ005687在1X实验缓冲液中孵育。添加的化合物对DMSO的贡献为1%，因此还包括1% DMSO的车辆对照。然后将孵育液加入50 μL洗涤珠中，在96孔聚丙烯微孔板的孔中重悬于50 μL 1X实验缓冲液中，室温孵育1小时。用微孔板磁铁拉下微珠，取50 μL上清。用100 μL 1X缓冲液洗涤3次，用50 μL 1X缓冲液重悬。然后将上清液和微球与等体积的2X SDS-‐PAGE凝胶上样缓冲液混合，煮沸10分钟。样品在8% Tris -- -甘氨酸SDS -- - PAGE凝胶上在125V下运行90分钟，然后用GelCode Blue染色。

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Yonetani—theorll分析法测定SAH与EPZ005687的互斥结合[2]
SAH和EPZ005687被连续稀释，并在384孔的微孔板上以网格模式进行标记，这样就可以获得SAH和EPZ005687的所有浓度组合。为此，40 μL含有PRC2 （4 nM）和生物素的混合物在1X实验缓冲液中（20 mM比辛[pH 7.6]， 0.002%吐温20,0.005%牛皮明胶和0.5 mM DTT）。每孔加入10 μL底物混合物，包括实验缓冲液3H- SAM （150 nM）、未标记的SAM （1800 nM）和代表组蛋白H3残基21 - 44(含C-末端生物素（附加在C-末端酰胺覆盖的赖氨酸上）的肽段（185 nM），以启动反应(两种底物都以各自的Km值存在于最终的反应混合物中，实验格式称为“平衡条件”4。反应在室温下孵育90分钟，用每孔10 μL的600 μM未标记的SAM淬灭，然后转移到384孔的Flashplate上，30分钟后清洗。在几种不同浓度的EPZ005687下，反应速度的反比作为SAH浓度的函数绘制，得到Yonetani—‐theorll图。

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EPZ005687对77个人体离子通道和gpcr的选择性研究[2]
EPZ005687在Cerep提供的标准面板上进行了放射性标记配体的位移测试，已知这些配体可以结合77个人体离子通道和gpcr。EPZ005687在10 μM的浓度下进行了重复测试，并将受体的特异性配体结合定义为在过量未标记配体存在的情况下确定的总结合和非特异性结合之间的差异。补充表1中的结果表示为特异性结合控制的百分比（（测量的特异性控制/特异性控制结合）× 100）。补充表1还显示了参考放射配体的身份及其结合亲和力。

体外细胞测定。[1]
对于贴壁细胞系增殖试验[除KYM-1外的所有细胞系，KYM-1按照先前描述的悬浮细胞系进行分析]，每个细胞系的镀密度是根据生长曲线（通过ATP含量测量）和密度在7 d时间过程中确定的。在复合处理前一天，将细胞分别镀于96孔板（0-7天）或6孔板（第7天重复，其余时间）。在第0天，细胞分别未经处理、dmso处理或用<强> <强>的Tazemetostat （EPZ6438）处理，从10µM开始，以三倍或四倍的稀释度递减。在第0天、第4天和第7天使用Cell Titer Glo读取培养皿，第4天补充化合物/培养基。第7天，将六孔板胰蛋白酶化，离心，在新鲜培养基中重悬，用Vi-Cell计数。每个处理的细胞按原始密度在96孔板上复制三份。细胞贴壁过夜，细胞处理与第0天一样。在第7、11和14天，使用细胞滴度荧光仪（Cell Titer Glo）读取培养皿，并在第11天补充化合物/培养基。使用三个重复的平均值来绘制随时间过程的增殖情况，并计算IC50值。G401和RD细胞以1 × 106个细胞/板的密度，在15 cm培养皿中一式两份进行细胞周期和凋亡检测。将细胞与的Tazemetostat (EPZ6438)在1µM中孵育，共25 mL，持续14 d，在第4,7和11天将细胞分裂回原始镀密度。使用Guava流式细胞仪进行细胞周期分析和TUNEL测定，遵循制造商的方案。

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基因表达分析。[1]
G401细胞和RD细胞分别以175,000个/瓶和117,000个/瓶的速度在T-75烧瓶中镀，并允许粘附过夜。第0天，用DMSO或1µM Tazemetostat (EPZ6438)处理细胞。在第2、4和7天收获细胞并成球，第4天补充培养基和化合物。使用剂量为21 d的G401异种移植动物肿瘤组织[对照、125 mg/kg、250 mg/kg（各6只）和500 mg/kg（4只）<强>他泽美他汀(EPZ6438)<强>剂量组]进行基因表达分析。使用RNeasy Mini Kit从细胞颗粒和肿瘤组织中提取总mRNA，并使用High Capacity cDNA逆转录Kit进行逆转录。RT-PCR采用ViiA 7 Real-Time PCR系统（AB），使用TaqMan Fast Advanced Master Mix (AB；4444964)和TaqMan引物/探针组。基因表达归一化为18S (AB)；Hs99999901_s1)，折线变化采用ΔΔCt方法计算。对体内样品，取各给药组的平均Ct值±SD，并采用ΔΔCt方法计算与载药组比较的倍数变化。

在体内研究中，将G401肿瘤细胞（每只小鼠5 × 10⁶个细胞）接种于小鼠右侧腹部皮下，接种液为0.2 mL基础培养基和Matrigel（McCoy's 5A/Matrigel，1:1）的混合物，用于肿瘤生长。当肿瘤体积达到约157 mm³时开始治疗，以进行肿瘤疗效研究（每组n = 16只小鼠）。 Tazemetostat (EPZ6438) 或赋形剂（0.5% NaCMC 加 0.1% Tween 80 水溶液）以 10 µL/g 的剂量体积，每日两次口服给药，持续 21 天或 28 天。在第一周每天测量动物体重，之后每周测量两次。使用游标卡尺每周两次测量肿瘤大小（二维），并以立方毫米表示体积。为了进行药代动力学-药效学分析，在给药 21 天后，处死 8 只肿瘤负荷最大的小鼠，采集肿瘤和血液样本。其余小鼠继续给药 1 周，从第 29 天开始停止治疗，并将小鼠纳入肿瘤生长延迟研究。对小鼠进行个体观察，直至肿瘤重量达到终点（2,000 mm³）或至第 60 天（以先到者为准）。[1]

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溶于含 0.5% NaCMC 和 0.1% Tween 80 的水中；500 mg/kg;口服给药

SCID小鼠携带皮下G401异种移植瘤。

吸收、分布和排泄
每日两次服用800毫克他泽美司他，血药浓度峰值(Cmax)为829纳克/毫升，达峰时间(Tmax)为1-2小时，曲线下面积(AUC)为3340纳克·小时/毫升。高脂肪、高热量膳食对吸收无显著影响。 Tazemetostat 的生物利用度为 33%。
Tazemetostat 15% 经尿液排出，79% 经粪便排出。
Tazemetostat 的分布容积为 1230 升。
Tazemetostat 的表观总清除率为 274 升/小时。

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代谢/代谢物
Tazemetostat 由 CYP3A4 代谢为一种无活性的去乙基代谢物和另一种未描述的无活性代谢物。

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生物半衰期
Tazemetostat 的末端消除半衰期为 3.1 小时。

肝毒性
在临床试验中，接受tazemetostat治疗的患者中，14%出现血清ALT升高，18%出现血清AST升高，其中3.5%的患者ALT升高至正常值上限的5倍以上。然而，在多项tazemetostat多中心开放标签试验中，未出现伴有症状或黄疸的临床明显肝损伤病例。尽管tazemetostat治疗期间不良事件发生率较高，但因不良事件而停药的情况并不常见。然而，tazemetostat的临床经验有限，且治疗期间新发血清酶升高的发生率引发了人们对其潜在肝毒性的担忧。
可能性评分：E（未经证实，但怀疑是罕见的临床明显肝损伤原因）。

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蛋白结合
Tazemetostat在血浆中的蛋白结合率为88%。

[1]. Durable tumor regression in genetically altered malignant rhabdoid tumors by inhibition of methyltransferaseEZH2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 May 7;110(19):7922-7.

[2]. A selective inhibitor of EZH2 blocks H3K27 methylation and kills mutant lymphoma cells. Nat Chem Biol . 2012 Nov;8(11):890-6.

Tazemetostat 是一种甲基转移酶抑制剂，用于治疗不适合完全切除的转移性或局部晚期上皮样肉瘤。Tazemetostat 最初在文献中被命名为 EPZ-6438。Tazemetostat 于 2020 年 1 月 23 日获得 FDA 批准。
Tazemetostat 是一种甲基转移酶抑制剂。其作用机制是作为甲基转移酶抑制剂、多药和毒素外排转运蛋白 1 抑制剂以及多药和毒素外排转运蛋白 2K 抑制剂。
Tazemetostat 是一种甲基转移酶抑制剂和抗肿瘤药物，用于治疗晚期上皮样肉瘤。 Tazemetostat治疗期间血清酶短暂升高的发生率中等，但尚未发现与临床上明显的急性肝损伤伴黄疸病例相关。
Tazemetostat是一种口服小分子选择性S-腺苷甲硫氨酸（SAM）竞争性抑制组蛋白甲基转移酶EZH2的抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，tazemetostat可选择性抑制EZH2野生型和突变型的活性。EZH2的抑制特异性地阻止了组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）的甲基化。组蛋白甲基化的降低会改变与癌症通路相关的基因表达模式，并导致EZH2突变癌细胞的增殖减少。 EZH2 属于组蛋白甲基转移酶 (HMT) 家族，在多种癌细胞中过度表达或发生突变，并在肿瘤细胞增殖中发挥关键作用。
另见：Tazemetostat 氢溴酸盐（活性成分）；Tazemetostat 盐酸盐（活性成分）；Tazemetostat 二氢溴酸盐（活性成分）……查看更多……

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药物适应症
Tazemetostat 适用于治疗 16 岁及以上成人和儿童患者，这些患者患有转移性或局部晚期上皮样肉瘤，且不适合完全切除。它也适用于治疗复发或难治性滤泡性淋巴瘤成人患者，这些患者的肿瘤 IZH2 突变阳性，且至少接受过 2 种既往全身治疗。此外，本品也适用于无其他满意治疗方案的复发或难治性滤泡性淋巴瘤成人患者。

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作用机制
EZH2 是多梳抑制复合物 2 (PRC2) 的甲基转移酶亚基，可催化组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸 (H3K27) 的多重甲基化。该赖氨酸的三甲基化可抑制与细胞周期阻滞相关的基因转录。PRC2 受开关/蔗糖非发酵 (SWI/SNF) 多蛋白复合物的拮抗。EZH2 的异常激活或 SWI/SNF 的功能缺失突变会导致 H3K27 的过度三甲基化。H3K27 的过度三甲基化会导致癌细胞去分化，获得类似癌症干细胞的特性。去分化可促进癌细胞增殖。 Tazemetostat 可抑制 EZH2，从而阻止 H3K27 的过度三甲基化和不受控制的细胞周期。

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药效学
Tazemetostat 是一种甲基转移酶抑制剂，可阻止组蛋白的过度三甲基化并抑制癌细胞去分化。由于每日两次给药，其作用持续时间较长。应告知患者继发性恶性肿瘤和胚胎-胎儿毒性的风险。

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开关/蔗糖非发酵复合物组分 SMARCB1 的失活在儿童恶性横纹肌样瘤 (MRT) 或非典型畸胎瘤样横纹肌样瘤中极为常见。这种改变被认为赋予了这些癌症对 EZH2 的致癌依赖性。
我们报道了一种高效、选择性强且口服生物利用度高的EZH2酶活性小分子抑制剂的发现，其化合物为(N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺)。该化合物能特异性地诱导SMARCB1缺失的MRT细胞凋亡和分化。用(N-((4,6-二甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-5-(乙基(四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)-4-甲基-4'-(吗啉甲基)-[1,1'-联苯]-3-甲酰胺)治疗携带异种移植瘤的小鼠，可导致MRTs剂量依赖性消退，并伴随肿瘤内组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化水平的相应降低，且停药后可防止肿瘤复发。这些数据表明SMARCB1突变型MRTs依赖于EZH2酶活性，并预示着靶向EZH2的药物在治疗这些基因明确的癌症方面的潜在应用价值。[1]

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EZH2催化组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)的三甲基化。在非霍奇金淋巴瘤的某些亚群中，EZH2基因的Tyr641和Ala677位点发生点突变，导致H3K27过度三甲基化。本文报道了EPZ005687的发现，它是一种强效的EZH2抑制剂（Ki值为24 nM）。EPZ005687对其他15种蛋白质甲基转移酶的选择性超过500倍，对与其密切相关的酶EZH1的选择性也高达50倍。该化合物可降低多种淋巴瘤细胞中的H3K27甲基化水平；这可导致Tyr641或Ala677杂合突变细胞凋亡，而对野生型细胞的增殖影响甚微。这些数据表明，EZH2 的基因改变（例如 Tyr641 或 Ala677 的突变）导致增殖对酶活性的严重依赖性（即相当于癌基因成瘾），因此预示着 EZH2 抑制剂可用于治疗 EZH2 发生基因改变的癌症。[2]

C34H44N4O4

572.74

572.336

C, 71.30; H, 7.74; N, 9.78; O, 11.17

1403254-99-8

1467052-84-1 (HCl);1467052-75-0 (HBr);1403254-99-8;

66558664

Off-white to light yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

750.8±60.0 °C at 760 mmHg

407.9±32.9 °C

0.0±2.5 mmHg at 25°C

1.589

0.98

90.65

2

6

9

42

992

0

NSQSAUGJQHDYNO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C34H44N4O4/c1-5-38(29-10-14-41-15-11-29)32-20-28(27-8-6-26(7-9-27)22-37-12-16-42-17-13-37)19-30(25(32)4)33(39)35-21-31-23(2)18-24(3)36-34(31)40/h6-9,18-20,29H,5,10-17,21-22H2,1-4H3,(H,35,39)(H,36,40)

N-((4,6-dimethyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-5-(ethyl(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)amino)-4-methyl-4'-(morpholinomethyl)-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide

Tazemetostat; E7-438; EPZ 6438; Tazemetostat; 1403254-99-8; N-((4,6-dimethyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-5-(ethyl(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)amino)-4-methyl-4'-(morpholinomethyl)-[1,1'-biphenyl]-3-carboxamide; Tazemetostat [INN]; E 7438; EPZ6438; tazerik; E7438; EPZ-6438;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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