OX₂ Receptor; orexin-2 receptor (OX2R) (IC50 = 40 nM)

体外活性：通过高通量筛选 (HTS) 发现的 TCS-OX2-29 是一种有效的选择性 OX2 受体拮抗剂，IC50 为 40 nM。与 OX1 相比，它对 OX2 的选择性高出 250 倍以上。食欲素受体拮抗剂代表了一种直接针对睡眠/觉醒调节的失眠治疗新方法。几种此类化合物已进入临床开发，包括双重食欲素受体拮抗剂suvorexant和almorexant。 TCS-OX2-29 显示对离子通道和转运蛋白的选择性（10 μM 时抑制 <30%），其中包括与食物摄入相关的 G 蛋白偶联受体，包括甘丙肽和神经肽 Y。TCS-OX2-29 抑制食欲素 A 诱导的 IP3转染 OX2 受体的 CHO 细胞中的积累和 ERK1/2 磷酸化。激酶测定：在接种稳定表达的 CHO 细胞后 24 小时，在 96 孔板中进行基于细胞的肌醇磷酸（Cisbio BioAssays，Codolet，法国）和 ERK1/2 磷酸化（Surefire，PerkinElmer，Waltham，MA，USA）功能测定人orexin-2受体，密度为25000个细胞/孔；完整的检测详细信息位于支持信息中。细胞测定：将瞬时表达人 OX2 受体的 HEK293 细胞的细胞膜与含 [3H]-EMPA 的 Krebs 测定缓冲液（8.5 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、4 mM NaHCO3）一起孵育、1.2 mM KH2PO4、11 mM 葡萄糖、pH 7.4），总测定体积为 0.25 mL，最终 DMSO 浓度为 1%。在室温下孵育 90 分钟后，通过 GF/B 96 孔玻璃纤维板快速过滤，并使用 Tomtec 细胞收集器用 ddH2O 洗涤 5 × 0.25 mL 来终止反应。使用 Lablogic SafeScint 通过液体闪烁测定结合放射性，并在 microbeta 液体闪烁计数器上检测。非特异性结合被确定为在 10 μM 饱和浓度的拮抗剂 EMPA 存在下剩余的结合。通过将膜（2 μg 蛋白质/孔）与一系列浓度的 [3H]-EMPA (0.4 nM–15 nM) 一起孵育来进行饱和度研究。使用 SafeScint 和 Beckman LS 6000 液体闪烁计数器测定放射性配体浓度。将膜（2 μg 蛋白质/孔）与 1.5 nM 浓度的 [3H]-EMPA 和一系列浓度的测试化合物一起孵育，进行竞争结合。

TCS-OX2-29（5-10 mg/kg；腹腔注射；成年雄性 NMRI 小鼠）治疗显着抑制初始小鼠和依赖性小鼠条件性位置偏好 (CPP) 的获得和表达[2]。

支持信息中提供了完整的检测详细信息。以 25,000 个细胞/孔的密度接种并稳定表达人食欲素 2 受体的 24 小时龄 CHO 细胞用于基于细胞的肌醇磷酸 和 ERK1/2 磷酸化 在 96 孔板中进行功能测定。

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放射性配体结合[2]
将瞬时表达人OX2受体（支持信息）的HEK293细胞的细胞膜与[3H]-EMPA在Krebs测定缓冲液（8.5 mM HEPES，1.3 mM氯化钙，1.2 mM硫酸镁，118 mM氯化钠，4.7 mM氯化钾，4 mM碳酸氢钠，1.2 mM磷酸二氢钾，11 mM葡萄糖，pH 7.4) 总分析体积为0.25 mL，DMSO终浓度为1%。90后 在室温下孵育分钟后，通过GF/B 96孔玻璃纤维板（5×0.25 使用Tomtec细胞采集器用ddH2O洗涤mL。使用Lablogic SafeScint通过液体闪烁测定结合放射性，并在微珠液体闪烁计数器上检测。非特异性结合被确定为在10 μM饱和浓度的拮抗剂EMPA。通过将膜（2μg蛋白质/孔）与不同浓度的[3H]-EMPA（0.4 nM-15 nM).使用SafeScint和Beckman LS 6000液体闪烁计数器测定放射性配体浓度。竞争结合是在用1.5μg蛋白质/孔孵育膜时进行的 nM浓度的[3H]-EMPA和一系列浓度的测试化合物。
通过向含有1%DMSO和1.5 nM放射性配体在不同时间点最多3个 h.通过预平衡膜和[3H]-EMPA 90℃测定解离动力学 min;然后在不同时间点加入饱和浓度的冷EMPA（100μM），以防止放射性配体与受体解离时重新结合。
使用Motulsky和Mahan（1984）的方法测定了未标记化合物的结合动力学。简而言之，在没有或存在三种浓度的竞争性拮抗剂（通常为0.3、1和3 x KI值）的情况下，[3H]-EMPA的结合曲线。如前所述，通过对缔合数据集的全局分析确定了未标记化合物的缔合和离解速率常数（Dowling和Charlton，2006）；[3H]-EMPA的缔合和离解速率常数是固定的，使模型能够为测试化合物提供kon和koff的估计值。配体受体半衰期计算为0.693/koff。

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功能性肌醇磷酸和ERK1/2磷酸化测定[2]
在96孔板24中进行了基于细胞的肌醇磷酸和ERK1/2磷酸化功能测定 用密度为25的稳定表达人食欲素-2受体的CHO细胞接种后h 000 细胞/孔；完整的化验细节见支持信息。

在 Krebs 测定缓冲液（8.5 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、4 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、11 mM 葡萄糖，pH 7.4）中，来自瞬时表达人的 HEK293 细胞的细胞膜OX2 受体与 [3H]-EMPA 一起孵育，总测定体积为 0.25 mL，最终 DMSO 浓度为 1%。使用 Tomtec 细胞收集器，室温孵育 90 分钟后，通过 GF/B 96 孔玻璃纤维板过滤，用 ddH2O 洗涤 5 × 0.25 mL，从而快速停止反应。使用 Lablogic SafeScint 进行液体闪烁，在 microbeta 液体闪烁计数器上确定并检测结合放射性。非特异性结合量定义为当拮抗剂 EMPA 以 10 μM 饱和浓度存在时持续存在的量。将膜（2 μg 蛋白质/孔）与一系列浓度的 [3H]-EMPA (0.4 nM–15 nM) 一起孵育，以进行饱和度研究。使用 Beckman LS 6000 液体闪烁计数器和 SafeScint 确定放射性配体浓度。为了进行竞争性结合，将膜（2μg蛋白质/孔）与一系列浓度的测试化合物和1.5nM的[3H]-EMPA一起孵育。

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简要筛选方案：将稳定表达hOX1R或hOX2R的CHO-K1细胞接种到96孔板中，并与细胞质钙指示剂Fluo-3 AM一起孵育。细胞洗涤四次后，通过FLIPR监测0.3 nM食欲素-a引起的细胞内Ca2+动员，作为细胞荧光强度的变化。在加入食欲素-A前5分钟，将不同浓度的食欲素拮抗剂加入平板中。拮抗活性以IC50值计算[1]。[1]

440 adult male NMRI mice (25-30 g)
5 mg/kg and 10 mg/kg
Intraperitoneal injection (Pharmacokinetic study)

[1]. N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline: the first orexin-2 receptor selective non-peptidicantagonist. Bioorg Med Chem Lett, 2003 Dec 15, 13(24):4497-9.

[2]. Binding kinetics differentiates functional antagonism of orexin-2 receptor ligands. Br J Pharmacol. 2014 Jan; 171(2): 351-363.

The identification of potent and selective orexin-2 receptor (OX(2)R) antagonists is described based on the modification of N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline analogue 1, recently discovered during high throughput screening (HTS). Substitution of an acyl group in 1 with tert-Leucine (tert-Leu), and introduction of a 4-pyridylmethyl substituent onto the amino function of tert-Leu improved compound potency, selectivity, and water solubility. Thus, compound 29 is a promising tool to investigate the role of orexin-2 receptors.[1]

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Orexin receptor antagonism represents a novel approach for the treatment of insomnia that directly targets sleep/wake regulation. Several such compounds have entered into clinical development, including the dual orexin receptor antagonists, suvorexant and almorexant. In this study, we have used equilibrium and kinetic binding studies with the orexin-2 (OX₂) selective antagonist radioligand, [³H]-EMPA, to profile several orexin receptor antagonists. Furthermore, selected compounds were studied in cell-based assays of inositol phosphate accumulation and ERK-1/2 phosphorylation in CHO cells stably expressing the OX2 receptor that employ different agonist incubation times (30 and 5 min, respectively). EMPA, suvorexant, almorexant and TCS-OX-29 all bind to the OX₂ receptor with moderate to high affinity (pk(I) values ≥ 7.5), whereas the primarily OX1 selective antagonists SB-334867 and SB-408124 displayed low affinity (pK(I) values ca. 6). Competition kinetic analysis showed that the compounds displayed a range of dissociation rates from very fast (TCS-OX2-29, k(off) = 0.22 min⁻¹) to very slow (almorexant, k(off) = 0.005 min⁻¹). Notably, there was a clear correlation between association rate and affinity. In the cell-based assays, fast-offset antagonists EMPA and TCS-OX2-29 displayed surmountable antagonism of orexin-A agonist activity. However, both suvorexant and particularly almorexant cause concentration-dependent depression in the maximal orexin-A response, a profile that is more evident with a shorter agonist incubation time. Analysis according to a hemi-equilibrium model suggests that antagonist dissociation is slower in a cellular system than in membrane binding; under these conditions, almorexant effectively acts as a pseudo-irreversible antagonist.[2]

C₂₃H₃₁N₃O₃

397.51

397.24

C, 69.49; H, 7.86; N, 10.57; O, 12.07

372523-75-6

TCS-OX2-29 hydrochloride; 1610882-30-8

10408514

White to off-white solid powder

4.318

63.69

1

5

7

29

530

1

O=C([C@]([H])(C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N([H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])N=C([H])C=1[H])N1C([H])([H])C2=C([H])C(=C(C([H])=C2C([H])([H])C1([H])[H])OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H]

COFVZFLCAOUMJT-OAQYLSRUSA-N

InChI=1S/C23H31N3O3/c1-23(2,3)21(25-14-16-6-9-24-10-7-16)22(27)26-11-8-17-12-19(28-4)20(29-5)13-18(17)15-26/h6-7,9-10,12-13,21,25H,8,11,14-15H2,1-5H3/t21-/m1/s1

(2S)-1-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-3,3-dimethyl-2-(pyridin-4-ylmethylamino)butan-1-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。