OX2 Receptor

体外活性：通过高通量筛选 (HTS) 发现的 TCS-OX2-29 是一种有效的选择性 OX2 受体拮抗剂，IC50 为 40 nM。与 OX1 相比，它对 OX2 的选择性高出 250 倍以上。食欲素受体拮抗剂代表了一种直接针对睡眠/觉醒调节的失眠治疗新方法。几种此类化合物已进入临床开发，包括双重食欲素受体拮抗剂suvorexant和almorexant。 TCS-OX2-29 显示对离子通道和转运蛋白的选择性（10 μM 时抑制 <30%），其中包括与食物摄入相关的 G 蛋白偶联受体，包括甘丙肽和神经肽 Y。TCS-OX2-29 抑制食欲素 A 诱导的 IP3转染 OX2 受体的 CHO 细胞中的积累和 ERK1/2 磷酸化。激酶测定：在接种稳定表达的 CHO 细胞后 24 小时，在 96 孔板中进行基于细胞的肌醇磷酸（Cisbio BioAssays，Codolet，法国）和 ERK1/2 磷酸化（Surefire，PerkinElmer，Waltham，MA，USA）功能测定人orexin-2受体，密度为25000个细胞/孔；完整的检测详细信息位于支持信息中。细胞测定：将瞬时表达人 OX2 受体的 HEK293 细胞的细胞膜与 [3H]-EMPA 一起在 Krebs 测定缓冲液（8.5 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl、4.7 mM KCl）中孵育。 、4 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、11 mM 葡萄糖，pH 7.4），总测定体积为 0.25 mL，最终 DMSO 浓度为 1%。在室温下孵育 90 分钟后，通过 GF/B 96 孔玻璃纤维板快速过滤，并使用 Tomtec 细胞收集器用 ddH2O 洗涤 5 × 0.25 mL 来终止反应。使用 Lablogic SafeScint 通过液体闪烁测定结合放射性，并在 microbeta 液体闪烁计数器上检测。非特异性结合被确定为在 10 μM 饱和浓度的拮抗剂 EMPA 存在下剩余的结合。通过将膜（2 μg 蛋白质/孔）与一系列浓度的 [3H]-EMPA (0.4 nM–15 nM) 一起孵育来进行饱和度研究。使用 SafeScint 和 Beckman LS 6000 液体闪烁计数器测定放射性配体浓度。将膜（2 μg 蛋白质/孔）与 1.5 nM 浓度的 [3H]-EMPA 和一系列浓度的测试化合物一起孵育，进行竞争结合。

TCS-OX2-29 (5-10 mg/kg；腹腔内注射;成年雄性NMRI小鼠)处理显著抑制naïve和依赖小鼠的条件位置偏好（CPP）的获得和表达[2]。

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条件位置偏好（CPP）与naïve小鼠的食欲能系统激活有关；然而，在这种模式中，不同的食欲素受体的独特作用尚未被表征。此外，依赖小鼠的食欲素和吗啡之间的关系可能不等于naïve小鼠，似乎值得研究。我们研究了食欲素-1受体拮抗剂SB 334867和食欲素-2受体拮抗剂TCS-OX2-29对naïve和吗啡依赖小鼠吗啡条件位置偏好（CPP）获得和表达的影响。以SB 334867为3个剂量（10、20、30 mg/kg）， TCS-OX2-29为2个剂量（5、10 mg/kg），吗啡为最高有效剂量（5 mg/kg）。结果显示，SB 334867在naïve小鼠中抑制CPP的获得和表达，但在吗啡依赖动物中无法阻断CPP的获得和表达。相比之下，TCS-OX2-29在naïve和依赖小鼠中均显著抑制CPP的获得和表达。吗啡的奖赏作用在吗啡依赖小鼠中与食欲素-2受体有较强的相关性，而在naïve小鼠中则同时依赖这两种受体。这一发现，如果在其他研究中得到证实，将说服我们进一步研究食欲素-2受体拮抗剂作为有效药物在成瘾治疗中的作用。

支持信息中提供了完整的检测详细信息。以 25,000 个细胞/孔的密度接种并稳定表达人食欲素 2 受体的 24 小时龄 CHO 细胞用于基于细胞的肌醇磷酸（Cisbio BioAssays，Codolet，法国）和 ERK1/2 磷酸化（ Surefire, PerkinElmer, Waltham, MA, USA）在 96 孔板中进行功能测定

在 Krebs 测定缓冲液（8.5 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、4 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、11 mM 葡萄糖，pH 7.4）中，来自瞬时表达人的 HEK293 细胞的细胞膜OX2 受体（支持信息）与 [3H]-EMPA 一起孵育，总测定体积为 0.25 mL，最终 DMSO 浓度为 1%。使用 Tomtec 细胞收集器，室温孵育 90 分钟后，通过 GF/B 96 孔玻璃纤维板过滤，用 ddH2O 洗涤 5 × 0.25 mL，从而快速停止反应。利用 Lablogic SafeScint 进行液体闪烁，使用 microbeta 液体闪烁计数器确定和检测结合放射性。非特异性结合量定义为当拮抗剂 EMPA 以 10 μM 饱和浓度存在时持续存在的量。将膜（2 μg 蛋白质/孔）与一系列浓度的 [3H]-EMPA (0.4 nM–15 nM) 一起孵育，以进行饱和度研究。使用 Beckman LS 6000 液体闪烁计数器和 SafeScint 确定放射性配体浓度。为了进行竞争性结合，将膜（2μg蛋白质/孔）与一系列浓度的测试化合物和1.5nM的[3H]-EMPA一起孵育。

440 adult male NMRI mice (25-30 g)
5 mg/kg and 10 mg/kg
Intraperitoneal injection (Pharmacokinetic study)

[1]. N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline: the first orexin-2 receptor selective non-peptidic antagonist. Bioorg Med Chem Lett. 2003 Dec 15;13(24):4497-9.

[2]. The differential effects of OX1R and OX2R selective antagonists on morphine conditioned place preference in naïve versus morphine-dependent mice. Behav Brain Res. 2013 Jan 15;237:41-8.

[3]. Binding kinetics differentiates functional antagonism of orexin-2 receptor ligands. Br J Pharmacol. 2014 Jan;171(2):351-63.

The identification of potent and selective orexin-2 receptor (OX(2)R) antagonists is described based on the modification of N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline analogue 1, recently discovered during high throughput screening (HTS). Substitution of an acyl group in 1 with tert-Leucine (tert-Leu), and introduction of a 4-pyridylmethyl substituent onto the amino function of tert-Leu improved compound potency, selectivity, and water solubility. Thus, compound 29 is a promising tool to investigate the role of orexin-2 receptors.[1] Orexin receptor antagonism represents a novel approach for the treatment of insomnia that directly targets sleep/wake regulation. Several such compounds have entered into clinical development, including the dual orexin receptor antagonists, suvorexant and almorexant. In this study, we have used equilibrium and kinetic binding studies with the orexin-2 (OX₂) selective antagonist radioligand, [³H]-EMPA, to profile several orexin receptor antagonists. Furthermore, selected compounds were studied in cell-based assays of inositol phosphate accumulation and ERK-1/2 phosphorylation in CHO cells stably expressing the OX2 receptor that employ different agonist incubation times (30 and 5 min, respectively). EMPA, suvorexant, almorexant and TCS-OX-29 all bind to the OX₂ receptor with moderate to high affinity (pk(I) values ≥ 7.5), whereas the primarily OX1 selective antagonists SB-334867 and SB-408124 displayed low affinity (pK(I) values ca. 6). Competition kinetic analysis showed that the compounds displayed a range of dissociation rates from very fast (TCS-OX2-29, k(off) = 0.22 min⁻¹) to very slow (almorexant, k(off) = 0.005 min⁻¹). Notably, there was a clear correlation between association rate and affinity. In the cell-based assays, fast-offset antagonists EMPA and TCS-OX2-29 displayed surmountable antagonism of orexin-A agonist activity. However, both suvorexant and particularly almorexant cause concentration-dependent depression in the maximal orexin-A response, a profile that is more evident with a shorter agonist incubation time. Analysis according to a hemi-equilibrium model suggests that antagonist dissociation is slower in a cellular system than in membrane binding; under these conditions, almorexant effectively acts as a pseudo-irreversible antagonist.[3]

C23H32CLN3O3

433.98

433.213

C, 63.66; H, 7.43; Cl, 8.17; N, 9.68; O, 11.06

1610882-30-8

TCS-OX2-29; 372523-75-6

53302033

Solid powder

63.7

2

5

7

30

530

1

Cl.O=C(C(C(C)(C)C)NCC1C=CN=CC=1)N1CC2C=C(C(=CC=2CC1)OC)OC

NHKNHFJTMINMBP-ZMBIFBSDSA-N

InChI=1S/C23H31N3O3.ClH/c1-23(2,3)21(25-14-16-6-9-24-10-7-16)22(27)26-11-8-17-12-19(28-4)20(29-5)13-18(17)15-26;/h6-7,9-10,12-13,21,25H,8,11,14-15H2,1-5H3;1H/t21-;/m1./s1

(2S)-1-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-3,3-dimethyl-2-(pyridin-4-ylmethylamino)butan-1-one;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。