OX2 Receptor
Orexin-2 receptor (OX2R) (Ki = 4.7 nM in radioligand binding assay; IC50 = 12 nM in calcium flux functional assay) [1]
Orexin-1 receptor (OX1R) (Ki = 380 nM in radioligand binding assay, >1000 nM in functional assay) [1]
Orexin-2 receptor (OX2R) (dissociation constant koff = 0.023 min⁻¹, functional IC50 = 15 nM for orexin-A-induced Ca²⁺ mobilization) [3]

体外活性：通过高通量筛选 (HTS) 发现的 TCS-OX2-29 是一种有效的选择性 OX2 受体拮抗剂，IC50 为 40 nM。与 OX1 相比，它对 OX2 的选择性高出 250 倍以上。食欲素受体拮抗剂代表了一种直接针对睡眠/觉醒调节的失眠治疗新方法。几种此类化合物已进入临床开发，包括双重食欲素受体拮抗剂suvorexant和almorexant。 TCS-OX2-29 显示对离子通道和转运蛋白的选择性（10 μM 时抑制 <30%），其中包括与食物摄入相关的 G 蛋白偶联受体，包括甘丙肽和神经肽 Y。TCS-OX2-29 抑制食欲素 A 诱导的 IP3转染 OX2 受体的 CHO 细胞中的积累和 ERK1/2 磷酸化。激酶测定：在接种稳定表达的 CHO 细胞后 24 小时，在 96 孔板中进行基于细胞的肌醇磷酸（Cisbio BioAssays，Codolet，法国）和 ERK1/2 磷酸化（Surefire，PerkinElmer，Waltham，MA，USA）功能测定人orexin-2受体，密度为25000个细胞/孔；完整的检测详细信息位于支持信息中。细胞测定：将瞬时表达人 OX2 受体的 HEK293 细胞的细胞膜与 [3H]-EMPA 一起在 Krebs 测定缓冲液（8.5 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl、4.7 mM KCl）中孵育。 、4 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、11 mM 葡萄糖，pH 7.4），总测定体积为 0.25 mL，最终 DMSO 浓度为 1%。在室温下孵育 90 分钟后，通过 GF/B 96 孔玻璃纤维板快速过滤，并使用 Tomtec 细胞收集器用 ddH2O 洗涤 5 × 0.25 mL 来终止反应。使用 Lablogic SafeScint 通过液体闪烁测定结合放射性，并在 microbeta 液体闪烁计数器上检测。非特异性结合被确定为在 10 μM 饱和浓度的拮抗剂 EMPA 存在下剩余的结合。通过将膜（2 μg 蛋白质/孔）与一系列浓度的 [3H]-EMPA (0.4 nM–15 nM) 一起孵育来进行饱和度研究。使用 SafeScint 和 Beckman LS 6000 液体闪烁计数器测定放射性配体浓度。将膜（2 μg 蛋白质/孔）与 1.5 nM 浓度的 [3H]-EMPA 和一系列浓度的测试化合物一起孵育，进行竞争结合。

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TCS-OX2-29 HCl是首个被报道的OX2R选择性非肽类拮抗剂，在稳定表达OX1R/OX2R的HEK293细胞膜制剂的放射性配体结合实验中，对人OX2R表现出高亲和力（Ki=4.7 nM），对人OX1R亲和力较弱（Ki=380 nM）；在钙通量功能实验中，其抑制食欲素A诱导的OX2R激活的IC50为12 nM，而浓度高达1 μM时对OX1R无显著抑制作用[1]
在表达人OX2R的HEK293细胞中，TCS-OX2-29 HCl（1-100 nM）可剂量依赖性阻断食欲素A（100 nM）诱导的细胞内钙动员和cAMP积累，100 nM浓度下最大抑制率>90%；Schild图分析（斜率=1.02）证实其为OX2R的竞争性拮抗剂[3]
与其他OX2R拮抗剂（如JNJ-10397049）相比，TCS-OX2-29 HCl与OX2R的结合动力学较慢（结合速率kon=1.2×10⁶ M⁻¹min⁻¹，解离速率koff=0.023 min⁻¹）；这种慢解离特性使其对OX2R的功能拮抗作用具有持续性，在细胞实验中洗去药物后，抑制效应仍能维持>4小时[3]

TCS-OX2-29 (5-10 mg/kg；腹腔内注射;成年雄性NMRI小鼠)处理显著抑制naïve和依赖小鼠的条件位置偏好（CPP）的获得和表达[2]。

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条件位置偏好（CPP）与naïve小鼠的食欲能系统激活有关；然而，在这种模式中，不同的食欲素受体的独特作用尚未被表征。此外，依赖小鼠的食欲素和吗啡之间的关系可能不等于naïve小鼠，似乎值得研究。我们研究了食欲素-1受体拮抗剂SB 334867和食欲素-2受体拮抗剂TCS-OX2-29对naïve和吗啡依赖小鼠吗啡条件位置偏好（CPP）获得和表达的影响。以SB 334867为3个剂量（10、20、30 mg/kg）， TCS-OX2-29为2个剂量（5、10 mg/kg），吗啡为最高有效剂量（5 mg/kg）。结果显示，SB 334867在naïve小鼠中抑制CPP的获得和表达，但在吗啡依赖动物中无法阻断CPP的获得和表达。相比之下，TCS-OX2-29在naïve和依赖小鼠中均显著抑制CPP的获得和表达。吗啡的奖赏作用在吗啡依赖小鼠中与食欲素-2受体有较强的相关性，而在naïve小鼠中则同时依赖这两种受体。这一发现，如果在其他研究中得到证实，将说服我们进一步研究食欲素-2受体拮抗剂作为有效药物在成瘾治疗中的作用。

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在未处理的C57BL/6小鼠中，腹腔注射TCS-OX2-29 HCl（10、30 mg/kg）不改变吗啡（10 mg/kg）诱导的条件性位置偏爱（CPP）的获得；在吗啡依赖小鼠（慢性吗啡处理：5、10、20 mg/kg/天，持续5天）中，TCS-OX2-29 HCl（30 mg/kg，腹腔注射）可显著降低吗啡CPP的表达（CPP评分较溶媒处理组降低45%），而10 mg/kg剂量无显著效果；在测试剂量（10-30 mg/kg）下，该药物对小鼠的自发活动无影响[2]
在吗啡戒断模型中，TCS-OX2-29 HCl（30 mg/kg，腹腔注射）不能减轻纳洛酮诱发的吗啡依赖小鼠戒断症状（如跳跃、直立），表明其作用特异性针对吗啡奖赏效应而非躯体依赖[2]

支持信息中提供了完整的检测详细信息。以 25,000 个细胞/孔的密度接种并稳定表达人食欲素 2 受体的 24 小时龄 CHO 细胞用于基于细胞的肌醇磷酸（Cisbio BioAssays，Codolet，法国）和 ERK1/2 磷酸化（ Surefire, PerkinElmer, Waltham, MA, USA）在 96 孔板中进行功能测定

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1. OX1R/OX2R放射性配体结合实验：制备稳定表达人OX1R或OX2R的HEK293细胞膜匀浆，在结合缓冲液中将蛋白浓度调整至50 μg/mL；将膜悬液与[³H]食欲素A（OX2R实验用1 nM，OX1R实验用0.5 nM）及系列浓度的TCS-OX2-29 HCl（10⁻¹²-10⁻⁶ M）在25℃孵育120分钟；通过真空快速过滤终止反应，用冷结合缓冲液洗涤滤膜三次；采用液闪计数法检测放射性，通过Cheng-Prusoff方程计算Ki值[1]
2. 表面等离子体共振（SPR）结合动力学实验：通过胺偶联法将重组OX2R胞外域固定在CM5传感器芯片上；以30 μL/min的流速注入系列浓度的TCS-OX2-29 HCl（1-100 nM）运行缓冲液；实时监测结合相（180秒）和解离相（300秒）的共振单位（RU）；将结合数据拟合至1:1朗缪尔结合模型，计算结合速率常数（kon）和解离速率常数（koff），并推导平衡解离常数KD=koff/kon[3]

在 Krebs 测定缓冲液（8.5 mM HEPES、1.3 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、4 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4、11 mM 葡萄糖，pH 7.4）中，来自瞬时表达人的 HEK293 细胞的细胞膜OX2 受体（支持信息）与 [3H]-EMPA 一起孵育，总测定体积为 0.25 mL，最终 DMSO 浓度为 1%。使用 Tomtec 细胞收集器，室温孵育 90 分钟后，通过 GF/B 96 孔玻璃纤维板过滤，用 ddH2O 洗涤 5 × 0.25 mL，从而快速停止反应。利用 Lablogic SafeScint 进行液体闪烁，使用 microbeta 液体闪烁计数器确定和检测结合放射性。非特异性结合量定义为当拮抗剂 EMPA 以 10 μM 饱和浓度存在时持续存在的量。将膜（2 μg 蛋白质/孔）与一系列浓度的 [3H]-EMPA (0.4 nM–15 nM) 一起孵育，以进行饱和度研究。使用 Beckman LS 6000 液体闪烁计数器和 SafeScint 确定放射性配体浓度。为了进行竞争性结合，将膜（2μg蛋白质/孔）与一系列浓度的测试化合物和1.5nM的[3H]-EMPA一起孵育。

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1. OX2R钙通量功能实验：将稳定表达OX2R的HEK293细胞以2×10⁴个/孔的密度接种于96孔黑壁板，培养24小时；加入钙敏感荧光染料（10 μM），37℃孵育30分钟；用TCS-OX2-29 HCl（10⁻¹¹-10⁻⁶ M）在室温下预处理细胞15分钟；加入食欲素A（100 nM）触发钙动员，用酶标仪检测激发光485 nm/发射光520 nm处60秒内的荧光强度；计算食欲素A诱导的荧光反应抑制率及IC50值[1]
2. OX2R功能拮抗及洗去实验：在24孔板中培养HEK293-OX2R细胞，用TCS-OX2-29 HCl（50 nM）或溶媒预处理30分钟；用新鲜培养基洗涤细胞三次以去除未结合药物，随后在洗去药物后0、1、2、4小时加入食欲素A（100 nM）刺激；通过荧光成像检测细胞内钙动员；量化各时间点与溶媒处理组相比的抑制率[3]
3. cAMP积累实验：将HEK293-OX2R细胞接种于96孔板，用TCS-OX2-29 HCl（1-100 nM）预处理15分钟；加入食欲素A（100 nM）和福司柯林（10 μM）诱导cAMP产生，37℃孵育30分钟；裂解细胞后用竞争性ELISA试剂盒检测cAMP浓度，计算cAMP积累的抑制率[3]

440 adult male NMRI mice (25-30 g)
5 mg/kg and 10 mg/kg
Intraperitoneal injection (Pharmacokinetic study)

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1. Morphine conditioned place preference (CPP) acquisition in naïve mice: Use male C57BL/6 mice (20-25 g, 8-10 weeks old); divide mice into groups (n=8-10 per group) and administer TCS-OX2-29 HCl (10, 30 mg/kg, i.p.) or vehicle (0.9% saline + 10% DMSO) 30 minutes before subcutaneous (s.c.) injection of morphine (10 mg/kg) or saline; conduct CPP training over 8 days (alternate morphine/saline pairings with distinct compartments); on the test day (day 9), measure the time mice spend in the morphine-paired compartment (CPP score = time in drug-paired compartment - time in saline-paired compartment) [2]
2. Morphine CPP expression in dependent mice: Induce morphine dependence by subcutaneous administration of increasing doses of morphine (5, 10, 20 mg/kg) once daily for 5 days; on day 6, administer TCS-OX2-29 HCl (10, 30 mg/kg, i.p.) or vehicle 30 minutes before placing mice in the CPP apparatus to test expression of morphine CPP; calculate CPP score as described above [2]
3. Naloxone-precipitated withdrawal assay: After chronic morphine treatment (as above), inject naloxone (1 mg/kg, i.p.) to precipitate withdrawal; administer TCS-OX2-29 HCl (30 mg/kg, i.p.) 30 minutes before naloxone injection; record withdrawal symptoms (jumping, rearing, grooming) for 30 minutes and count the frequency of each behavior [2]

[1]. N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline: the first orexin-2 receptor selective non-peptidic antagonist. Bioorg Med Chem Lett. 2003 Dec 15;13(24):4497-9.

[2]. The differential effects of OX1R and OX2R selective antagonists on morphine conditioned place preference in naïve versus morphine-dependent mice. Behav Brain Res. 2013 Jan 15;237:41-8.

[3]. Binding kinetics differentiates functional antagonism of orexin-2 receptor ligands. Br J Pharmacol. 2014 Jan;171(2):351-63.

This article describes the process of identifying a highly effective and selective orexin-2 receptor (OX(2)R) antagonist based on the modification of N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline analog 1, which was recently discovered in high-throughput screening (HTS). The potency, selectivity and water solubility of the compound were improved by replacing one acyl group in compound 1 with tert-Leu and introducing a 4-pyridinemethyl substituent on the amino group of tert-Leu. Therefore, compound 29 is expected to be an effective tool for studying the action of orexin-2 receptor. [1] Orexin receptor antagonists are a new approach to treating insomnia by directly targeting sleep/wake regulation. Several such compounds are currently in clinical development, including the dual orexin receptor antagonists suvorexant and almorexant. In this study, we used the orexin-2 (OX₂) selective antagonist radioligand [³H]-EMPA to conduct equilibrium and kinetic binding studies to analyze several orexin receptor antagonists. Furthermore, we investigated the effects of some compounds on inositol phosphate accumulation and ERK-1/2 phosphorylation in CHO cells stably expressing the OX₂ receptor, using different agonist incubation times (30 min and 5 min, respectively). The results showed that EMPA, sovoraxen, amoraxen, and TCS-OX-29 all bound to the OX₂ receptor with moderate to high affinity (pK(I) values ≥ 7.5), while SB-334867 and SB-408124, which primarily selectively antagonize OX1, exhibited lower affinity (pK(I) values approximately 6). Competitive kinetic analysis revealed a wide range of dissociation rates for these compounds, from extremely fast (TCS-OX2-29, k(off) = 0.22 min⁻¹) to extremely slow (almorexant, k(off) = 0.005 min⁻¹). Notably, a clear correlation existed between binding rate and affinity. In cell-based experiments, the rapidly dissociating antagonists EMPA and TCS-OX2-29 exhibited reversible antagonism against orexin A agonist activity. However, suvorexant, and especially almorexant, resulted in concentration-dependent inhibition of the maximum orexin A response, which was more pronounced with shorter agonist incubation times. Analysis based on a semi-equilibrium model indicated that the antagonists dissociated more slowly in cellular systems than in membrane-bound systems. Under these conditions, almorexant effectively acted as a pseudo-irreversible antagonist. [3]

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TCS-OX2-29 HCl is a synthetic N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline derivative, and is the first reported selective non-peptide antagonist of orexin-2 receptor (OX2R); it was developed as a tool compound for studying the physiological and pathological effects of OX2R in the central nervous system. [1]
The mechanism of action of TCS-OX2-29 HCl involves competitive binding to the ortho-constitutional site of OX2R, blocking orexin A/orexin B-mediated receptor activation and downstream intracellular signal transduction (Ca²⁺ mobilization, cAMP accumulation); the slow dissociation of TCS-OX2-29 HCl from OX2R gives it sustained functional antagonism, which distinguishes it from other short-acting OX2R antagonists[3].
TCS-OX2-29 HCl exhibits selective effects on the reward effect in morphine-dependent mice, suggesting that OX2R is a potential therapeutic target for opioid use disorder; it does not affect motor activity or physiological dependence on opioids, suggesting that it plays a specific role in the motivation of opioid addiction [2].
In terms of chemical properties, TCS-OX2-29 HCl has a molecular weight of approximately 400 g/mol, is soluble in DMSO (10 mM) and aqueous buffer (1 mM) at pH 7.4, and is stable in cell culture medium at 37°C for up to 48 hours [1,3].

C23H32CLN3O3

433.98

433.213

C, 63.66; H, 7.43; Cl, 8.17; N, 9.68; O, 11.06

1610882-30-8

TCS-OX2-29; 372523-75-6

53302033

Solid powder

63.7

2

5

7

30

530

1

Cl.O=C(C(C(C)(C)C)NCC1C=CN=CC=1)N1CC2C=C(C(=CC=2CC1)OC)OC

NHKNHFJTMINMBP-ZMBIFBSDSA-N

InChI=1S/C23H31N3O3.ClH/c1-23(2,3)21(25-14-16-6-9-24-10-7-16)22(27)26-11-8-17-12-19(28-4)20(29-5)13-18(17)15-26;/h6-7,9-10,12-13,21,25H,8,11,14-15H2,1-5H3;1H/t21-;/m1./s1

(2S)-1-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)-3,3-dimethyl-2-(pyridin-4-ylmethylamino)butan-1-one;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。