Tegobuvir   中文名称: 5-[[6-[2,4-双(三氟甲基)苯基]-3-哒嗪基]甲基]-2-(2-氟苯基)-5H-咪唑并[4,5-C]吡啶

Tegobuvir (GS-9190) targets the HCV NS5B polymerase (genotype 1). [2][3]
The Y448H mutation in NS5B has been selected by GS-9190 as well as several benzothiadiazine HCV polymerase inhibitors in vitro and in vivo. [1]
Tegobuvir targets the HCV NS5B polymerase, an RNA-dependent RNA polymerase essential for viral replication. It exerts anti-HCV activity through a unique chemical activation and subsequent direct interaction with the NS5B protein. Treatment of HCV subgenomic replicon cells with tegobuvir results in a modified form of NS5B with a distinctly altered mobility on SDS-PAGE gel.

在含有编码荧光素酶复制子的1b基因型Huh-luc细胞中，替戈布韦（GS-9190）的平均EC50值为20.0 nM。[1]用替戈布韦（TGV）处理HCV亚基因组复制子细胞会导致NS5B发生修饰，其在SDS-PAGE凝胶上的迁移率明显改变，呈现为双条带。这种效应是NS5B特有的，因为NS5A或NS3的蛋白质迁移率未观察到异常。当用其他类型的抑制剂处理含有复制子的细胞时，未观察到NS5B双峰的形成，这些抑制剂包括NS5B NNI（II位点抑制剂VX-222、III位点抑制剂A-782759和IV位点抑制剂HCV-796）、核苷链终止剂（2'CMeA）或蛋白酶抑制剂（BILN-2061）。[2] NS5B双峰的形成与TGV的效力相关。在GT1a复制子细胞中，下条带的出现时间比GT1b复制子细胞延迟，这与TGV的效力存在亚基因型差异相一致（GT1a的EC50值比GT1b高17倍）。在与GT1b相似的暴露时间下，使用浓度高10倍的药物可使GT1a复制子中出现NS5B下条带。在携带 GT1b 复制子的 HeLa 细胞中，TGV 的效力显著降低（EC50 > 10 µM），即使在 10 µM 的浓度下也未观察到双峰形成。在携带 TGV 抗性突变（NS5B Y448H，敏感性降低 36 倍）的细胞中，即使在 100 nM TGV 浓度下，也只能勉强观察到较低的条带。[2] NS5B 双峰的形成不需要其他病毒蛋白，因为在仅通过 BacMam 过表达系统表达 GT1b NS5B 聚合酶的 Huh7 细胞中也观察到了双峰的形成。去除膜插入结构域的 NS5B 聚合酶的更易溶解的缺失构建体（A21）在 TGV 处理后也表现出双峰的形成。[2] 对 TGV 处理细胞中的 NS5B 进行质谱分析，发现第二个分子量更高的主要峰，该峰是 TGV 处理样品所特有的，观察到的质量变化为 820.54 Da。对于 TGV 类似物，质量差分别为 788.9 和 788.7 Da。[2]
在 BacMam 过表达细胞和复制子细胞中，通过链霉亲和素检测，在迁移速度较快的 NS5B 双条带中检测到了生物素标记的 TGV 类似物，表明该化合物与 NS5B 蛋白之间形成了共价加合物。[2]
谷胱甘肽有助于 TGV 的活性。用 BSO（5 mM，预处理 24 小时）耗竭 GSH 后，复制子细胞中 TGV 的 EC50 值增加了 171 倍，并且 NS5B 过表达细胞中双条带的形成减少。[2]
CYP1A1 活性是 TGV 发挥抗病毒活性所必需的。与基于 Huh-7 的 1b-Rlu 复制子细胞相比，SL3 (HeLa GT1b) 复制子细胞中 CYP mRNA 的表达量降低了 7 至 16 倍。在 SL3 细胞中过表达 CYP1A1 使其对 TGV 的敏感性提高了 1200 倍（EC50 = 17 nM），达到与 Huh7 复制子系统中观察到的相似的 EC50 值。过表达 CYP1A2 或 CYP3A4 并不能恢复敏感性。[2] 在嵌合复制子研究中，替戈布韦 (Tegobuvir) 对基因型 1 的 EC50 值 <16 nM，对基因型 2b、3a、4a、5a 和 6a 的 EC50 值 >100 nM。针对 1b-con-1 复制子，替戈布韦的效力最强，其 EC50 值比针对 1a-H77 复制子低约 10 倍。对 2a-JFH1 复制子以及 GT3a、4a、6a-Con 和 5a CI 嵌合体进行治疗后，其对替戈布韦的敏感性较 1b-con-1 降低了 57 至 14,700 倍。[3] 在 GT3a、4a 和 6a 嵌合复制子中引入 NS5B F445C 突变后，替戈布韦的 EC50 值降低至与基因型 1a 相当的水平（从 >100 nM 降至 16 nM），但并未显著改变位点 2 抑制剂或核苷类似物抑制剂的 EC50 值。与野生型嵌合体相比，这种单一氨基酸的改变显著降低了替戈布韦的EC50值，降低了410倍。[3]

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替戈布韦以剂量依赖的方式迅速提高了含有Y448H突变的复制子的比例。在替戈布韦浓度分别为50%有效浓度的1倍、10倍和20倍时，治疗三天后，复制子群体中Y448H的表达率分别为1.2%、6.8%和>50%[1]。替戈布韦通过特殊的化学活化以及随后与NS5B蛋白的直接接触，展现出抗HCV的活性。当替戈布韦应用于HCV亚基因组复制子细胞时，NS5B发生改变，并在SDS-PAGE凝胶上表现出显著的迁移率变化[2]。替戈布韦对GT1a和GT1b均表现出活性，其平均EC50值分别为19.8 nM和1.5 nM。替戈布韦对基因型3a、4a和6a Con嵌合体的EC50值均大于100 nM。GT3a、4a和6a嵌合复制子的NS5B F445C突变使替戈布韦的效力恢复至与GT1a相似的EC50值[3]。
体外实验表明，替戈布韦可抑制HCV NS5B聚合酶活性。用替戈布韦处理HCV亚基因组复制子细胞后，NS5B发生修饰，在SDS-PAGE凝胶上的迁移率明显改变。该化合物的活性可通过体外聚合酶活性测定和基于HCV复制子细胞的测定进行评估。替戈布韦是一种非核苷类抑制剂，它与聚合酶活性位点不同的位点结合。

在一项研究中，研究人员采用AS-PCR和群体测序方法检测了65例初治丙型肝炎病毒（HCV）感染患者（42例为基因1a型，23例为基因1b型）血浆中是否存在Y448H突变。群体测序结果显示，所有患者样本的NS5B Y448位点均为野生型。AS-PCR在62例初治患者样本中的5例（8%）中检测到低水平的Y448H突变，范围为0.5%至3.0%。[1]
在接受GS-9190单药治疗8天后，AS-PCR在两例基因1a型感染患者中检测到Y448H突变亚群，其比例分别为2.0%和3.3%，而群体测序结果仍显示为野生型。单基因组测序从这些患者的 16 个克隆中鉴定出 1 个（6.3%），51 个克隆中鉴定出 5 个（9.8%）Y448H 突变体。在一名基因型 1b 感染患者感染后第 8 天，群体测序在 Y448 位点鉴定出混合氨基酸（H/Y/C/R），AS-PCR 检测到 >50% 的 Y448H 突变体，SGS 检测到 3 种氨基酸：Y (6/13)、H (6/13) 和 N (1/13)。[1]
体内研究表明，替戈布韦对 HCV 感染患者具有抗病毒活性。作为一种非核苷类 NS5B 聚合酶抑制剂，它能阻断 HCV RNA 复制，降低感染者体内的病毒载量。该化合物已在治疗慢性丙型肝炎的临床试验中进行评估。其独特的作用机制为核苷类抑制剂提供了一种替代方案。

替戈布韦的作用机制独特，因为它在无细胞体系中并不抑制重组NS5B蛋白的酶活性。研究表明，该化合物需要细胞内生物转化才能发挥活性。因此，标准的体外酶活性测定（使用纯化的NS5B蛋白、RNA模板和核苷酸底物）不适用于评估替戈布韦。其活性主要通过基于细胞的复制子测定进行评估，该方法通过测量细胞内HCV RNA复制水平间接反映化合物的抗病毒效力。这种对代谢活化的依赖性是该化合物的一个关键特征。
替戈布韦的体外酶活性测定测量其对HCV NS5B聚合酶活性的抑制作用。将酶与RNA模板、核苷酸和不同浓度的化合物一起孵育。通过放射性标记核苷酸的掺入或基于荧光的方法测量RNA合成。IC50值由剂量反应曲线计算得出。该化合物的独特作用机制通过其对 NS5B 蛋白流动性的独特影响得到证实。

为了测定复制子检测中的半数有效浓度 (EC50)，将复制子细胞接种于 96 孔板中，并用 DMSO 将 GS-9256 进行 200 倍系列稀释。3 天后，使用商业化的荧光素酶检测试剂盒定量荧光素酶编码复制子细胞系中的荧光素酶表达。将数据拟合到逻辑剂量反应方程，并计算 EC50 值。[1] 为了测定替戈布韦 (Tegobuvir) 的复制子 EC50，将含有复制子的细胞用胰蛋白酶消化，并接种于不含 G418 的细胞培养基中，置于白色 96 孔板中。将稳定携带复制子的细胞系以每孔 5,000 个细胞的密度接种。将化合物在 DMSO 中进行三倍系列稀释（10 个浓度），然后在细胞培养基中进一步稀释，最后加入细胞板中。化合物处理后的细胞在 5% CO2 培养箱中于 37°C 培养 72 小时。对于编码荧光素酶的复制子，使用市售的检测系统对荧光素酶信号进行定量。曲线拟合和 EC50 值通过非线性回归分析获得。[2]
对于蛋白质印迹分析，细胞用 PBS 洗涤后，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液裂解。样品置于冰上 15 分钟，然后离心沉淀。上清液在还原条件下，于 200 V 电压下，在 MOPS 缓冲液中，以 Tris-Bis NuPage 凝胶电泳 2 小时。凝胶转移至硝酸纤维素膜。使用小鼠抗 NS5B 抗体、小鼠抗 NS5A 抗体和小鼠抗 NS3 抗体作为一抗进行检测。化学发光分析使用 HRP 标记的小鼠二抗。对于红外光谱读数，使用LiCor IR Dye Goat-anti-mouse-800CW作为二抗。对于生物素的检测，使用IR Dye 700标记的链霉亲和素。[2]
对于BacMam NS5B过表达，将Huh7-Lunet细胞接种于DMEM/10% FBS/NEAA培养基中，并用BacMam病毒试剂感染。三小时后，加入化合物至所需浓度，并加入丁酸钠至终浓度为10 mM。培养瓶过夜培养。然后洗涤细胞，用胰蛋白酶消化，离心沉淀，用干冰速冻，并储存于-80°C直至纯化。[2]
对于用于质谱分析的NS5B纯化，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中并裂解。裂解后，通过离心去除细胞碎片。将上清液与预先偶联抗NS5B抗体的蛋白A Dynabeads磁珠在4℃下孵育过夜。磁珠用裂解缓冲液洗涤三次。收集的蛋白被洗脱后立即进行质谱分析。[2]
对于SL3细胞中细胞色素P450的过表达，在转染前24小时，将细胞以1.5×10^6个细胞的密度接种。每皿细胞用转染试剂转染15 µg CYP1A1、CYP1A2或CYP3A4 DNA。转染48小时后，使用RT-PCR检测表达水平以确定转染效率。[2]
对于嵌合复制子分析，用替戈布韦和其他NS5B抑制剂处理含有嵌合复制子的稳定细胞系。测定EC50值。 [3]
替戈布韦的体外细胞活性检测采用HCV亚基因组复制子细胞。将细胞用化合物进行系列稀释处理，并通过qPCR或报告基因活性检测HCV RNA复制情况。根据剂量反应曲线确定抑制HCV复制的EC50值。通过Western印迹或SDS-PAGE凝胶迁移率分析评估化合物对NS5B蛋白的影响。

在复制子研究中，使用浓度分别为 EC50 的 1×、5×、10× 和 20× 的 GS-9190 处理复制子细胞。将 10^6 个复制子细胞接种到含有不同浓度 GS-9190 的 T75 培养瓶中。3 至 5 天后，当细胞达到 90% 汇合度时，将 10^6 个细胞重新接种到每个 T75 培养瓶中。每次传代时，收集细胞用于 RNA 提取。[1] 替戈布韦的体内动物模型包括 HCV 感染小鼠模型或具有人源化肝脏的嵌合小鼠模型。该化合物经口服给药，并评估其对病毒载量和肝脏病理的影响。药代动力学研究测量药物暴露量和组织分布。在这些临床前模型中评估该化合物的抗病毒疗效和安全性。

替戈布韦已被证实代谢非常稳定；TGV在人体内的消除半衰期为10-15小时。[2]
临床前代谢物鉴定研究显示，TGV的氧化形式与少量GSH形成加合物。[2]

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替戈布韦是一种前药，需要细胞内代谢活化。其活化依赖于CYP1A酶的代谢作用，随后形成谷胱甘肽结合物，该结合物被认为是活性抗病毒物质。实验表明，替戈布韦与CYP1A抑制剂联用时，其抗病毒效力降低，证实了其活化依赖性作用机制。
替戈布韦的分子式为C25H14F7N5，分子量为517.41。该化合物具有咪唑并吡啶核心结构。它以粉末形式储存于-20°C。该化合物可溶于二甲基亚砜和其他有机溶剂。其药代动力学参数，包括半衰期、生物利用度和组织分布，已在研究文献中有所记载。

当与聚乙二醇干扰素α+利巴韦林（RBV）联合使用，或与其他直接抗病毒药物联合使用时，替戈布韦（TGV）的共价作用机制并未影响其安全性、耐受性和强效抗病毒活性。[2] 替戈布韦被归类为仅供研究使用的化合物，不用于人类治疗。不同安全数据表中的毒理学信息有所不同：有的资料将其归类为“非危险物质或混合物”，而有的资料则将其标记为“有毒”且为需要严格处理预防措施的药物活性成分。该资料还指出，长期接触可能对健康造成严重损害，潜在风险包括生育能力受损和对胎儿造成伤害。替戈布韦的毒性特征已在临床前和临床研究中得到证实。作为一种抗病毒药物，常见的不良反应可能包括胃肠道不适和头痛。该化合物仅供研究使用，不用于人类。操作过程中应采取适当的安全预防措施。安全范围由毒理学研究确定。

[1]. Allele-specific real-time PCR system for detection of subpopulations of genotype 1a and 1b hepatitis C NS5B Y448H mutant viruses in clinical samples. J Clin Microbiol. 2011 Sep;49(9):3168-74.

[2]. The HCV non-nucleoside inhibitor Tegobuvir utilizes a novel mechanism of action to inhibit NS5B polymerase function. PLoS One. 2012;7(6):e39163.

[3]. Tegobuvir (GS-9190) potency against HCV chimeric replicons derived from consensus NS5B sequences from genotypes 2b, 3a, 4a, 5a, and 6a. Virology. 2012 Jul 20;429(1):57-62.

NS5B 中的 Y448H 突变已被 GS-9190 以及多种苯并噻二嗪类 HCV 聚合酶抑制剂在体外和体内筛选出来。NS5B Y448H 突变体对干扰素、利巴韦林以及 HCV NS3 蛋白酶、NS5A 和 NS5B（II 位点非核苷类和核苷类）抑制剂仍然敏感。[1] 替戈布韦 (TGV，GS-9190) 是一种新型咪唑并吡啶类抑制剂的类似物，可选择性靶向 HCV。TGV 在体外和体内均显示出抗 HCV 活性。在最近一项探索性研究中，TGV 与 NS3 蛋白酶抑制剂 GS-9256 和聚乙二醇/利巴韦林联合使用，仅治疗 28 天后，所有患者的 HCV RNA 水平均低于定量下限。 [2]
替戈布韦 (TGV) 的作用机制涉及氧化代谢活化。TGV 可能被氧化成环氧化物中间体，该中间体可以消除氟离子生成酮。这为谷胱甘肽 (GSH) 或活性半胱氨酸残基的亲核攻击创造了条件。在 CYP 介导的氟苯基部分氧化代谢活化和 GSH 的辅助下，TGV 与 NS5B 共价结合，从而破坏病毒复制。[2]
在嵌合复制子研究中，将 NS5B F445C 突变引入 GT3a、4a 和 6a 嵌合复制子中，可使替戈布韦的 EC50 值降低至与 1a 基因型相当的水平。对欧盟HCV序列数据库进行查询，发现NS5B 445位点的GT3a、4a和6a基因型中苯丙氨酸的保守性为100%。[3]

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替戈布韦已被研究用于治疗慢性丙型肝炎。
替戈布韦是一种非核苷类NS5B聚合酶抑制剂，用于治疗HCV感染。它也被称为GS-9190和IDX-375。该化合物通过独特的化学活化作用以及随后与NS5B蛋白的直接相互作用发挥抗HCV活性。它已在治疗慢性丙型肝炎的临床试验中进行评估。替戈布韦仅用于研究目的。

C25H14F7N5

517.400989055634

517.113

C, 58.03; H, 2.73; F, 25.70; N, 13.54

1000787-75-6

23649154

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

558.0±60.0 °C at 760 mmHg

291.3±32.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.605

4.07

56.49

0

11

4

37

765

0

FC(C1C=C(C(F)(F)F)C=CC=1C1=CC=C(CN2C=CC3C(=C2)N=C(C2C=CC=CC=2F)N=3)N=N1)(F)F

XBEQSQDCBSKCHJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H14F7N5/c26-19-4-2-1-3-17(19)23-33-21-9-10-37(13-22(21)34-23)12-15-6-8-20(36-35-15)16-7-5-14(24(27,28)29)11-18(16)25(30,31)32/h1-11,13H,12H2

5-[[6-[2,4-bis(trifluoromethyl)phenyl]pyridazin-3-yl]methyl]-2-(2-fluorophenyl)imidazo[4,5-c]pyridine

GS9190; GS-333126; Tegobuvir; 1000787-75-6; 5-((6-(2,4-bis(Trifluoromethyl)phenyl)pyridazin-3-yl)methyl)-2-(2-fluorophenyl)-5H-imidazo[4,5-c]pyridine; GS-9,190; GS-333,126; GS 9190; GS333126; GS-9190

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 50 mg/mL (~96.64 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (5.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 27.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (5.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。