Tegobuvir   中文名称: 5-[[6-[2,4-双(三氟甲基)苯基]-3-哒嗪基]甲基]-2-(2-氟苯基)-5H-咪唑并[4,5-C]吡啶

Tegobuvir (GS-9190) targets the HCV NS5B polymerase (genotype 1). [2][3]
The Y448H mutation in NS5B has been selected by GS-9190 as well as several benzothiadiazine HCV polymerase inhibitors in vitro and in vivo. [1]

在含有编码荧光素酶的复制子的基因1b型Huh-luc细胞中，Tegobuvir (GS-9190)的平均EC50值为20.0 nM。[1]
用TGV处理HCV亚基因组复制子细胞会导致NS5B蛋白发生修饰，在SDS-PAGE凝胶上出现迁移率明显改变的条带，表现为双联体。该效应是NS5B特异性的，在NS5A或NS3蛋白上未观察到迁移异常。当用其他类别的抑制剂处理含复制子的细胞时，未观察到NS5B双联体形成，这些抑制剂包括NS5B NNI（位点II抑制剂VX-222、位点III抑制剂A-782759和位点IV抑制剂HCV-796）、核苷链终止剂（2'CMeA）或蛋白酶抑制剂（BILN-2061）。[2]
NS5B双联体形成与TGV活性相关。在GT1a复制子细胞中，较低条带出现的时间比GT1b复制子细胞晚，这与TGV显示亚型间效力差异（GT1a EC50比GT1b高17倍）一致。使用高10倍的药物浓度可使GT1a复制子中较低NS5B条带在相似的暴露时间出现。在携带GT1b复制子的HeLa细胞中，TGV效力大大降低（EC50 > 10 µM），即使在10 µM下也未观察到双联体形成。在携带TGV耐药突变（NS5B Y448H，敏感性降低36倍）的细胞中，仅在100 nM TGV下隐约可见较低条带。[2]
NS5B双联体形成不需要其他病毒蛋白，因为在仅通过BacMam过表达系统表达GT1b NS5B聚合酶的Huh7细胞中也观察到了这一现象。去除膜插入结构域的可溶性更强的NS5B聚合酶缺失构建体（A21）在TGV处理后也表现出双联体形成。[2]
对TGV处理细胞中NS5B进行的质谱分析显示，存在一个独特的、分子量更高的第二主峰，仅在TGV处理样品中出现，观察到的质量变化为820.54 Da。对于TGV类似物，质量差异分别为788.9和788.7 Da。[2]
在BacMam过表达细胞和复制子细胞中，通过链霉亲和素检测在迁移较快的NS5B双联体物种中检测到了生物素化的TGV类似物，表明化合物与NS5B蛋白之间形成了共价加合物。[2]
谷胱甘肽有助于TGV活性。用BSO（5 mM，24小时预处理）耗竭GSH导致复制子细胞中TGV EC50变化171倍，并减少了NS5B过表达细胞中的双联体形成。[2]
CYP1A1活性对TGV的抗病毒活性是必需的。SL3（HeLa GT1b）复制子细胞中CYP mRNA的表达水平比基于Huh-7的1b-Rlu复制子细胞低7至16倍。在SL3细胞中过表达CYP1A1使它们对TGV的敏感性提高1200倍（EC50 = 17 nM），达到与Huh7复制子系统中观察到的相似的EC50值。过表达CYP1A2或CYP3A4未能恢复敏感性。[2]
在嵌合复制子研究中，Tegobuvir对基因1型的EC50值<16 nM，对基因2b、3a、4a、5a和6a的EC50值>100 nM。对1b-con-1复制子，tegobuvir是最有效的，EC50比对1a-H77复制子低约10倍。处理2a-JFH1复制子以及GT3a、4a、6a-Con和5a CI嵌合体，与1b-con-1相比，对tegobuvir的敏感性降低倍数从57倍到14,700倍不等。[3]
在GT3a、4a和6a嵌合复制子中引入NS5B F445C突变，将tegobuvir的EC50降低到与基因1a相当的水平（从>100 nM降至16 nM），但并未显著改变位点2抑制剂或核苷类似物抑制剂的EC50。与野生型嵌合体相比，这一单个氨基酸改变使tegobuvir的EC50显著降低了410倍。[3]

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替戈比韦以剂量依赖性方式迅速提高含有 Y448H 突变的复制子的百分比。治疗三天后，在替戈布韦 50% 有效浓度的 1、10 和 20 倍时，Y448H 的表达率分别为 1.2%、6.8% 和 >50% [1]。通过特殊的化学激活以及随后与 NS5B 蛋白的直接接触，替戈布韦表现出抗 HCV 功效。当替戈布韦给予 HCV 亚基因组复制子细胞时，NS5B 发生变化，并在 SDS-PAGE 凝胶上表现出显着改变的迁移率 [2]。 Tigobuvir 具有抗 GT1a 和抗 GT1b 活性，相应的平均 EC50 值为 19.8 和 1.5 nM。基因型 3a、4a 和 6a Con 嵌合体的替戈布韦 EC50 超过 100 nM。 GT3a、4a 和 6a 嵌合复制子的 F445C NS5B 突变使替戈布韦效力恢复至与 GT1a 相似的 EC50 值 [3]。

在一项研究中，使用AS-PCR和群体测序检测了65名初治HCV感染患者（基因1a型42名，1b型23名）血浆中Y448H的存在情况。通过群体测序，所有患者样本在NS5B Y448位点均为野生型。AS-PCR在5/62（8%）的初治患者样本中检测到0.5%至3.0%的低水平Y448H。[1]
在使用GS-9190单药治疗8天后，通过AS-PCR在两名基因1a型感染患者第8天的样本中检测到Y448H突变亚群，分别为2.0%和3.3%，而群体测序仍显示为野生型。单基因组测序从这些患者的1/16（6.3%）和5/51（9.8%）个克隆中鉴定出Y448H突变体。在一名基因1b型感染患者第8天的样本中，群体测序在Y448位点鉴定出混合物（H/Y/C/R），AS-PCR检测到>50%的Y448H突变体，SGS检测到三种氨基酸：Y（6/13）、H（6/13）和N（1/13）。[1]

Tegobuvir的作用机制非常独特，它本身在无细胞体系中不抑制重组NS5B蛋白的酶活性。研究表明，该化合物需要经过细胞内的生物转化才能产生活性。因此，标准的体外酶学实验（即使用纯化的NS5B蛋白、RNA模板和核苷酸底物直接检测聚合酶活性）并不适用于评估Tegobuvir。其活性评估主要依赖基于细胞的复制子实验（Cell-based replicon assays），通过检测细胞内HCV RNA的复制水平来间接反映药物的活性。这种依赖代谢激活的特性是该化合物的关键特征。

了在复制子测定中测定50%有效浓度（EC50），将复制子细胞接种到96孔板中，并将GS-9256在DMSO中连续稀释至200倍终浓度。在编码荧光素酶的复制子细胞系中，3天后使用商业荧光素酶测定法对荧光素酶表达进行定量。将数据拟合为逻辑剂量反应方程，并计算EC50值。[1]
对于Tegobuvir的复制子EC50测定，将含有复制子的细胞胰蛋白酶化，并接种在不含G418的细胞培养基中的白色96孔板中。携带稳定复制子的细胞系以每孔5,000个细胞的密度接种。将化合物在DMSO中进行10个浓度的3倍连续稀释，然后在细胞培养基中进一步稀释，随后添加到细胞板中。化合物处理的细胞在37°C、5% CO2培养箱中孵育72小时。对于编码荧光素酶的复制子，使用商业试剂盒定量荧光素酶信号。使用非线性回归分析进行曲线拟合和EC50值计算。[2]
对于蛋白质印迹分析，用PBS洗涤细胞，然后用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。样品在冰上放置15分钟，然后离心沉淀。上清液在还原条件下于MOPS缓冲液中在Tris-Bis NuPage凝胶上以200 V电泳2小时。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。使用小鼠抗NS5B抗体、小鼠抗NS5A抗体和小鼠抗NS3抗体作为一抗进行检测。对于化学发光分析，使用HRP标记的抗小鼠二抗。对于红外读取，使用LiCor IR Dye山羊抗小鼠800CW作为二抗。对于生物素检测，使用IR Dye 700标记的链霉亲和素。[2]
对于BacMam NS5B过表达，将Huh7-Lunet细胞接种在DMEM/10% FBS/NEAA中，并用BacMam病毒试剂感染。三小时后，加入所需浓度的化合物以及终浓度为10 mM的丁酸钠。培养瓶孵育过夜。然后洗涤细胞，胰蛋白酶化，沉淀，在干冰上速冻，并在-80°C下保存直至纯化。[2]
对于用于质谱分析的NS5B纯化，将细胞沉淀重悬并在裂解缓冲液中裂解。裂解后，通过离心沉淀碎片。将上清液与预先偶联了抗NS5B抗体的蛋白A Dynabeads一起孵育过夜。用裂解缓冲液洗涤珠子三次。洗脱捕获的蛋白质并立即进行质谱分析。[2]
对于SL3细胞中细胞色素P450的过表达，在转染前24小时以1.5×10^6个细胞的密度接种细胞。每皿细胞使用转染试剂转染15 µg CYP1A1、CYP1A2或CYP3A4 DNA。转染后48小时，使用RT-PCR检测表达水平以确定转染效率。[2]
对于嵌合复制子测定，用tegobuvir和其他NS5B抑制剂处理含有嵌合复制子的稳定细胞系。测定EC50值。[3]

在复制子研究中，使用EC50的1倍、5倍、10倍和20倍浓度的GS-9190处理复制子细胞。在每个T75培养瓶中加入10^6个复制子细胞和不同浓度的GS-9190。3至5天后，当细胞达到90%融合时，每个T75培养瓶重新接种10^6个细胞。在每次传代时，也收集细胞用于RNA提取。[1]

Tegobuvir已被证明在代谢上非常稳定；TGV在人体内的消除半衰期为10-15小时。[2]
临床前代谢物鉴定研究揭示了少量GSH加合物与TGV氧化形式的结合。[2]

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Tegobuvir是一种需要细胞内代谢激活的前体药物。其激活过程依赖于CYP1A酶的代谢作用，随后形成谷胱甘肽结合物，该结合物被认为是其发挥抗病毒活性的活性形式。实验显示，当与CYP1A抑制剂联用时，Tegobuvir的抗病毒效力会降低，这证实了其依赖代谢激活的作用机制。

当与聚乙二醇干扰素α+RBV或其他直接作用抗病毒药物联合给药时，TGV的共价作用机制并未妨碍TGV的总体安全性、良好耐受性和强效抗病毒活性。[2]

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Tegobuvir被归类为仅供研究使用的化合物，不用于人体治疗。关于其毒理信息，不同来源的安全数据表描述不完全一致：一份资料将其列为“非危险物质或混合物”，而另一份则将其标记为“有毒”，并指出它是含有药物活性成分的物质，处理时需采取严格防护措施。该资料还指出，长时间接触可能对健康造成严重损害，并提示存在损害生育能力和危害 unborn child的潜在风险。

[1]. Allele-specific real-time PCR system for detection of subpopulations of genotype 1a and 1b hepatitis C NS5B Y448H mutant viruses in clinical samples. J Clin Microbiol. 2011 Sep;49(9):3168-74.

[2]. The HCV non-nucleoside inhibitor Tegobuvir utilizes a novel mechanism of action to inhibit NS5B polymerase function. PLoS One. 2012;7(6):e39163.

[3]. Tegobuvir (GS-9190) potency against HCV chimeric replicons derived from consensus NS5B sequences from genotypes 2b, 3a, 4a, 5a, and 6a. Virology. 2012 Jul 20;429(1):57-62.

NS5B中的Y448H突变已在体外和体内被GS-9190以及几种苯并噻二嗪类HCV聚合酶抑制剂所选择。NS5B Y448H突变体对干扰素、利巴韦林以及HCV NS3蛋白酶、NS5A和NS5B（位点II非核苷和核苷）抑制剂保持敏感。[1]
Tegobuvir (TGV, GS-9190)是新型咪唑并吡啶类抑制剂的一个类似物，选择性靶向HCV。TGV在体外和体内均显示出抗HCV效力。在最近一项使用TGV联合NS3蛋白酶抑制剂GS-9256和PEG/RBV的探索性研究中，仅治疗28天后，100%的患者的HCV RNA水平低于定量下限。[2]
TGV的作用机制涉及氧化代谢活化。TGV可能被氧化成环氧中间体，该中间体可以消除氟离子生成酮。这为GSH或反应性半胱氨酸残基的亲核攻击创造了可能性。在CYP介导的氟苯基部分氧化代谢活化和GSH协助下，TGV共价结合NS5B，从而破坏病毒复制。[2]
在嵌合复制子研究中，在GT3a、4a和6a嵌合复制子中引入NS5B F445C突变，将tegobuvir的EC50降低到与基因1a相当的水平。查询欧盟HCV序列数据库中GT3a、4a和6a在NS5B第445位点的序列显示，在这些基因型中苯丙氨酸100%保守。[3]

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替戈布韦已被研究用于治疗慢性丙型肝炎。

C25H14F7N5

517.400989055634

517.113

C, 58.03; H, 2.73; F, 25.70; N, 13.54

1000787-75-6

23649154

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

558.0±60.0 °C at 760 mmHg

291.3±32.9 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.605

4.07

56.49

0

11

4

37

765

0

FC(C1C=C(C(F)(F)F)C=CC=1C1=CC=C(CN2C=CC3C(=C2)N=C(C2C=CC=CC=2F)N=3)N=N1)(F)F

XBEQSQDCBSKCHJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H14F7N5/c26-19-4-2-1-3-17(19)23-33-21-9-10-37(13-22(21)34-23)12-15-6-8-20(36-35-15)16-7-5-14(24(27,28)29)11-18(16)25(30,31)32/h1-11,13H,12H2

5-[[6-[2,4-bis(trifluoromethyl)phenyl]pyridazin-3-yl]methyl]-2-(2-fluorophenyl)imidazo[4,5-c]pyridine

GS9190; GS-333126; Tegobuvir; 1000787-75-6; 5-((6-(2,4-bis(Trifluoromethyl)phenyl)pyridazin-3-yl)methyl)-2-(2-fluorophenyl)-5H-imidazo[4,5-c]pyridine; GS-9,190; GS-333,126; GS 9190; GS333126; GS-9190

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 50 mg/mL (~96.64 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (5.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 27.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.75 mg/mL (5.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 27.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。