TFEB activator 1

Flag-TFEB nuclear translocation (EC50 = 2167 nM)
curcumin analog C1 directly binds to TFEB (transcription factor EB) at the N-terminal Gly and Ala-rich domain. The binding affinity (K_D) of C1 to full-length recombinant TFEB is 2.53 ± 0.33 μM (determined by isothermal titration calorimetry). C1 also binds to TFEB truncations Δ(121-330) (K_D = 2.17 μM), ΔC150 (K_D = 1.12 μM), and ΔC461 (K_D = 1.81 μM). No binding was detected for TFEB truncations 221-320, ΔN220, or ΔN44. [1]

TFEB 激活剂 1（化合物 C1）直接与调节因子 EB (TFEB) 结合，促进其进入细胞核，而不影响 TFEB 磷酸化或阻断 MTOR 和 MAPK1/ERK2-MAPK3/ERK1 活性 [1]。1（1 μM；12 小时）显著提高 LC3B-II 的水平，LC3B-II 是 MAP1LC3B/LC3B（微管相关蛋白 1 轻链 3β）的一种脂化且与自噬体相关或具有细胞杀伤作用的形式。 N2a 细胞 TFEB 激活剂 1 (0.2-1 μM) 呈剂量依赖性地提高 N2a 细胞中 SQSTM1/p62（隔离体 1）和 LC3-II 的水平 [1]。姜黄素类似物 C1 (1 μM，12 小时) 与溶剂对照组相比，显著提高了小鼠神经母细胞瘤 N2a 细胞中 LC3B-II 的水平；在氯喹 (20 μM) 存在下，这种效应进一步增强，表明自噬通量增强而非溶酶体降解受阻。C1 不抑制 MTOR 通路；相反，它促进了 RPS6KB1 和 MTOR 的磷酸化。 C1 处理（1 μM，12 小时）可诱导超过 80% 的 N2a 细胞中 TFEB 发生核转位；在稳定表达 3xFlag-TFEB 的 HeLa 细胞中，C1 促进 TFEB 核转位，EC50 值为 2167 nM。C1 不影响 TFEB 的总磷酸丝氨酸水平，也不影响 S142 和 S211 位点的磷酸化，且不抑制 MAPK1/3 的活性。C1 可直接与重组 TFEB 结合（K_D = 2.53 μM）。共免疫沉淀实验表明，C1 可降低 TFEB 与 YWHA/14-3-3 的相互作用。C1（0.5-1 μM，12 小时）可增加 N2a 和 HeLa 细胞中 LC3B-II、TFEB、LAMP1 和 CTSD（包括 46 kDa 前体和 28 kDa 成熟形式）的蛋白水平。 C1（1 μM，12 小时）上调 HeLa 和 SH-SY5Y 细胞中 TFEB 靶基因（例如 LC3B、LAMP1、CTSD、SQSTM1）的转录。在环己酰亚胺追踪实验中，C1 增强了 SQSTM1 的自噬降解，并降解了外源性 Flag-SQSTM1，而氯喹可阻断这一降解作用。在转染串联荧光 mRFP-GFP-LC3 的 N2a 细胞中，C1 显著增加了仅表达红色荧光的斑点（自溶酶体）的数量。C1 促进了与 LC3B 斑点共定位的 DQ-BSA 红色斑点的形成，表明溶酶体蛋白水解活性增强。敲低 Tfeb 或 Becn1 可消除 C1 诱导的 LC3B-II 增加，而敲低 Atg5 可部分降低但不能完全阻断该效应。[1]

在急性毒性研究（单剂量，尾静脉注射）中，TFEB 激活剂 1（化合物 C1）的半数致死量 (LD50) 为 175 mg/kg [1]。短期作用于心肌壁的 TFEB 激活剂 1（低剂量 10 mg/kg 和高剂量 25 mg/kg；24 小时）可促进心脏、额叶心肌和脑纹状体中 LC3B-II 和 TFEB 的表达升高 [1]。长期灌胃给予 TFEB 激活剂 1（10 mg/kg/天）可激活 TFEB 并增加脑中枢的自噬[1]。

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口服给予姜黄素类似物 C1（10 mg/kg 和 25 mg/kg，持续 24 小时，并在处死前 6 小时追加一次）可剂量依赖性地增加大鼠额叶皮层、纹状体和肝脏中 LC3B-II 和 TFEB 的蛋白水平。C1 处理（25 mg/kg）显著增加额叶皮层中 MTOR 和 RPS6KB1 的磷酸化水平，证实 C1 可促进 MTOR 的活性。C1 剂量依赖性地促进脑内 TFEB 的核转位。C1（25 mg/kg）抑制额叶皮层中内源性 TFEB 与 MTOR 的相互作用。长期口服C1（10 mg/kg/天，连续21天，处死前6小时追加一次）可提高大鼠额叶皮层和纹状体中TFEB和LC3B-II的水平，并显著降低内源性SQSTM1的水平，表明自噬介导的降解作用增强。长期治疗期间未观察到体重变化或行为异常。组织学评估显示主要器官（肝脏、肺脏、肾脏、胰腺）未见形态学异常。[1]

高内涵 TFEB 核转位分析[1]
为了定量 TFEB 的亚细胞定位，我们根据之前的实验方案，使用稳定过表达 3xFlag-TFEB 的 HeLa 细胞进行了高内涵分析。

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等温滴定量热法 (ITC) 结合分析[1]
在 VP-ITC 微量热仪中进行了 ITC 实验，包括 C1 与 FL-TFEB、C1 与 ΔC150、C1 与 ΔC461、C1 与 Δ(121 至 330)、姜黄素与 FL-TFEB、B1 与 FL-TFEB 以及 E4 与 FL-TFEB 的结合实验。蛋白质和配体溶液均用含有 6% DMSO 的相应蛋白质储存缓冲液稀释至所需浓度。所有溶液在使用前均在真空下轻柔搅拌 5 分钟进行彻底脱气。通常，将浓度为 100 至 200 μM 的配体溶液（置于 250 μL 注射器中）分别滴定到样品池中浓度为 10 至 20 μM 的 1.4 mL 蛋白质溶液中。滴定实验在 25°C 下进行，参比池功率为 9。在 307 rpm 的搅拌下，以 120 至 150 秒的间隔向蛋白质溶液中注入 10 至 14 μL 的配体溶液。使用 MicroCal-ITC 200 进行 C1 与其他截短体的滴定实验。分别用 200 μM 的配体溶液和 10 至 20 μM 的蛋白质溶液填充 40 μL 注射器和 200 μL 样品池。实验在 25°C 下进行。初始注射 0.1 μl 的数据不纳入数据分析，随后进行 16 次注射，每次 2 μl，每次注射间隔 120 秒。原始数据使用 MicroCal ORIGIN 软件中的单结合位点模型进行处理。分析前，通过扣除配体的稀释热对数据进行校正。

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固相结合实验： 将重组 His 标签 TFEB 与 C1 或姜黄素孵育。离心后，仅在 C1 沉淀中观察到一条约 55 kDa 的特异性 His-TFEB 条带，表明 C1 与 TFEB 直接结合。 [1]
等温滴定量热法 (ITC) 结合实验： ITC 实验在 VP-ITC 微量热仪或 MicroCal-ITC 200 上进行。蛋白质和配体溶液用含 6% DMSO 的蛋白质储存缓冲液稀释，并在真空下脱气 5 分钟。通常，将 100-200 μM 的配体溶液用注射器滴定到样品池中 1.4 mL 浓度为 10-20 μM 的蛋白质溶液中。滴定在 25°C 下进行，参比池功率为 9。以 307 rpm 的搅拌速度，每隔 120-150 秒注入 10-14 μL 的配体溶液。对于 MicroCal-ITC 200，使用 200 μL 配体（200 μM）和 200 μL 蛋白质（10-20 μM），初始注入 0.1 μL 后，以 120 秒的间隔进行 16 次 2 μL 的注入。原始数据使用 MicroCal ORIGIN 软件中的单一位点结合模型进行处理，并通过扣除配体稀释热进行校正。C1 与全长 TFEB 的解离常数 (K_D) 为 2.53 ± 0.33 μM，n = 0.99 ± 0.03，ΔH = 5.09 ± 0.24 kcal/mol，ΔS = 42.7 cal/mol/K。 C1 也与 TFEB 截短体 Δ(121-330) (K_D = 2.17 μM)、ΔC150 (K_D = 1.12 μM) 和 ΔC461 (K_D = 1.81 μM) 结合，但不与 221-320、ΔN220 或 ΔN44 结合。姜黄素、维生素 B1 和维生素 E4 的结合较弱或无结合。[1]
TFEB-YWHA/MTOR 相互作用的共免疫沉淀 (Co-IP)： 用 C1 (1 μM, 12 h) 处理稳定表达 3xFlag-TFEB 的 HeLa 细胞。向全细胞裂解液中加入抗 Flag 抗体，并使用 Dynabeads Protein G 进行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白质经SDS-PAGE分离后，用抗MTOR或抗YWHA抗体进行免疫印迹分析。与对照组相比，C1处理显著降低了与Flag-TFEB共免疫沉淀的YWHA和MTOR的水平，表明TFEB-YWHA和TFEB-MTOR相互作用减弱。[1]

Western Blot 分析[1]
细胞类型： N2a 细胞
测试浓度： 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1 μM
孵育时间： 12 小时
实验结果： 处理剂量依赖性地增加了 LC3-II 和 SQSTM1/p62（dotosome 1）的水平。

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细胞培养和药物处理： N2a 和 HeLa 细胞培养于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中；SH-SY5Y 细胞培养于含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基中。稳定表达 3xFlag-TFEB 的 HeLa 细胞培养于含 10% FBS 和 G418 的 DMEM 培养基中。药物处理时，将培养基更换为含有化合物（溶于0.1% DMSO）的新鲜Opti-MEM I培养基，并持续指定时间。[1]
LDH细胞毒性测定： 细胞毒性通过LDH试剂盒测定受损细胞释放的LDH来确定，操作步骤按照制造商提供的方案进行。测试化合物在1 μM浓度下无毒性。[1]
高通量TFEB核转位测定： 使用稳定过表达3xFlag-TFEB的HeLa细胞。用化合物处理细胞，固定、染色并成像。定量核转位以计算EC₅₀值（C1的EC₅₀值为2167 nM）。[1]
蛋白质印迹： 细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1×裂解缓冲液中裂解。为了检测SQSTM1，在裂解缓冲液中添加1% SDS。蛋白质经10-15% SDS-PAGE分离后，转移至膜上，并用指定的抗体进行免疫印迹。蛋白质信号通过ECL法检测，并使用ImageJ软件进行定量。[1]
免疫沉淀：向全细胞裂解液中加入抗Flag或抗TFEB抗体，并使用Dynabeads Protein G磁珠进行免疫沉淀。使用Clean-Blot IP检测试剂进行二抗检测。[1]
定量实时PCR：使用RNeasy Plus Mini试剂盒提取总RNA。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒进行逆转录。使用Fast SYBR Green Master Mix和ViiA 7实时PCR系统进行实时PCR。倍数变化采用ΔΔCT法计算，并以GAPDH或ACTB进行标准化。 [1]
基因敲低实验： 将 N2a 细胞用 Lipofectamine RNAi-MAX 转染小鼠 Atg5、Becn1 或 Tfeb siRNA（25 nM 或 50 nM）和非靶向 siRNA，转染 48 小时，然后用 C1 处理 12 小时。为了稳定敲低 TFEB，将 HeLa 细胞用表达非靶向 shRNA 或 TFEB shRNA 的慢病毒感染 48 小时，然后用嘌呤霉素筛选。[1]
自噬通量实验（串联荧光 mRFP-GFP-LC3）： 将 N2a 细胞用 tflC3 质粒转染 24 小时，然后用 C1（1 μM，12 小时）、氯喹（50 μM，12 小时）或 torin1（0.5 μM，3 小时）处理。细胞经固定、DAPI染色后成像。定量分析每个细胞中仅呈现红色斑点的数量（n=20，随机选取自3个独立实验的细胞）。与对照组相比，C1显著增加了仅呈现红色斑点的数量。[1]
溶酶体降解实验（DQ-BSA）： 将N2a细胞与DQ-BSA-Red（10 μg/mL）预孵育1小时，洗涤后，分别用C1（1 μM，12小时）、氯喹（50 μM，12小时）或torin1（0.5 μM，3小时）处理。细胞经固定后，用LC3B抗体染色。定量分析每个细胞中DQ-BSA红色斑点的数量及其与LC3B斑点的共定位情况（Pearson相关系数）。C1促进了与LC3B共定位的DQ-BSA红色斑点的形成。 [1]
免疫细胞化学： 将盖玻片上的细胞用 3.7% 多聚甲醛固定，用 0.2% Triton X-100 透化，用 5% BSA 封闭，然后在 4°C 下与抗 TFEB、抗 Flag 或抗 LC3B 抗体孵育过夜，随后在室温下与 Alexa Fluor 二抗孵育 1 小时。细胞核用 DAPI 染色。使用荧光显微镜或反卷积显微镜观察细胞。[1]

动物/疾病模型：成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重350至400克[1]
剂量：10毫克/千克
给药途径：慢性口服给药；每日一次；持续21天
实验结果：大鼠脑内TFEB被激活，自噬增强。

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所有动物护理和实验程序均已获得香港浸会大学人类及动物教学与研究委员会的批准。体重350至400克的成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠在受控环境中自由摄食饮水，并保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。每组6只大鼠（n = 6）分别灌胃给予C1（10 mg/kg和25 mg/kg/天）或赋形剂（1%羰基甲基纤维素钠[CMC-Na]），持续24小时。治疗结束后，在处死大鼠前6小时再次给予C1。根据先前的方案解剖肝脏和主要脑区，并用液氮速冻。

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急性毒性研究：大鼠经尾静脉单次注射C1，以确定半数致死量（LD₅₀ = 175 mg/kg）。 [1]
短期口服给药（24 小时）： 成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠（350-400 克，每组 n=6）通过灌胃法口服给予 C1（10 mg/kg 和 25 mg/kg/天）或赋形剂（1% 羧甲基纤维素钠，CMC-Na），持续 24 小时。处死前 6 小时再次给予 C1。解剖肝脏和脑组织（额叶皮层、纹状体），并立即置于液氮中速冻。[1]
长期口服给药（21 天）： 大鼠（每组 n=6）通过灌胃法口服给予 C1（10 mg/kg/天）或赋形剂（1% CMC-Na），持续 21 天。处死前 6 小时再次给予 C1。收集脑组织进行蛋白质印迹和组织学分析。 [1]
用于蛋白质印迹和免疫组织化学的组织处理： 将动物组织在9倍体积的冰冷PBS（含蛋白酶抑制剂）中匀浆。使用标准方案分离胞质和核组分。为测定SQSTM1水平，在裂解缓冲液中加入1% SDS。[1]
脑组织实时PCR： 从脑组织裂解液中提取总RNA，进行逆转录，并使用针对TFEB、LC3B、LAMP1、CTSD和其他自噬/溶酶体基因的特异性引物进行分析。[1]

血脑屏障 (BBB) 通透性： 姜黄素类似物 C1 可以穿过血脑屏障。口服 C1 (10 mg/kg) 6 小时后，采用高效液相色谱法 (HPLC) 测定脑组织中的平均浓度为 0.26 ± 0.063 μg/g（相当于 0.885 ± 0.213 μM）。[1]
长期给药后的脑组织浓度： 口服 C1 (10 mg/kg/天) 21 天后，并在处死前 6 小时追加一次剂量，脑组织中的平均浓度为 0.849 ± 0.302 μg/g（相当于 2.884 ± 1.028 μM）。[1]

急性毒性（LD₅₀）：大鼠单次尾静脉注射姜黄素类似物C1，半数致死剂量（LD₅₀）为175 mg/kg。[1]
亚慢性毒性：大鼠连续21天每日口服10 mg/kg C1，未观察到体重变化和行为异常。组织学评估显示肝脏、肺、肾脏和胰腺等主要器官未见形态学异常。[1]

[1]. A novel curcumin analog binds to and activates TFEB in vitro and in vivo independent of MTOR inhibition. Autophagy. 2016 Aug 2;12(8):1372-89.

自噬功能障碍是神经退行性疾病的常见特征，其特点是毒性蛋白聚集体的积累。越来越多的证据表明，转录因子EB（TFEB）是自噬和溶酶体生物合成的关键调节因子，其激活可以改善神经毒性并挽救动物模型中的神经退行性变。目前已知的TFEB激活剂主要为mTOR（雷帕霉素靶蛋白[丝氨酸/苏氨酸激酶]）抑制剂，而mTOR是细胞生长和代谢的关键调节因子，参与多种生物学功能。因此，寻找不抑制mTOR通路、作用于TFEB且可能对细胞损伤更小的调节剂将更具优势。本研究鉴定了一种合成的姜黄素衍生物C1，它是一种新型的mTOR非依赖性TFEB激活剂。化合物C1特异性结合TFEB的N端，促进TFEB入核，且不抑制mTOR活性。 C1 通过激活 TFEB，在体外和体内增强自噬和溶酶体生物合成。总之，化合物 C1 是一种口服有效的 TFEB 激活剂，也是治疗神经退行性疾病的潜在药物。[1]

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姜黄素类似物 C1 在之前的研究中也被称为 B63 (Xiao et al., 2012)。它是姜黄素的单羰基类似物，缺少 β-二酮部分，与姜黄素相比，具有更高的稳定性和更优的药代动力学特性。C1 比姜黄素具有更好的细胞摄取和更延缓的降解。C1 处理可提高 TFEB 蛋白水平，这可能是通过核转位后的正向自调节转录实现的。C1 与 TFEB 的结合是吸热的、熵驱动的相互作用（ΔS 和 ΔH 值均为正值），表明存在疏水相互作用并释放结合水。结合位点位于N端富含甘氨酸和丙氨酸的结构域（前44个氨基酸）内。C1是一种口服有效的TFEB激活剂，具有良好的脑渗透性和低毒性，使其成为治疗帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经退行性疾病的潜在治疗药物。[1]

C19H18O3

294.35

294.126

C, 77.53; H, 6.16; O, 16.31

39777-61-2

830608

Light yellow to yellow solid

3.999

35.53

0

3

6

22

364

0

COC1=CC=CC=C1/C=C/C(=O)/C=C/C2=CC=CC=C2OC

RCZMPCUUTSDNAJ-PHEQNACWSA-N

InChI=1S/C19H18O3/c1-21-18-9-5-3-7-15(18)11-13-17(20)14-12-16-8-4-6-10-19(16)22-2/h3-14H,1-2H3/b13-11+,14-12+

(1E,4E)-1,5-Bis(2-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one

TFEB activator 1; (1E,4E)-1,5-Bis(2-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one; 39777-61-2; TFEB activator 1; 41973-42-6; Go-Y019; CHEMBL477053; RPN77612; 1,5-bis(2-methoxyphenyl)-1,4-pentadien-3-one;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~424.68 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 6.25 mg/mL (21.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 62.5 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: 4 mg/mL (13.59 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。