TPCA-1 (GW-683965; GW683965)

STAT3 ; NF-κB; IKK2 (IC50 = 17.9 nM)
The primary target of TPCA-1 (GW-683965; GW683965) is Janus kinase 2 (JAK2) , a non-receptor tyrosine kinase that mediates signal transduction of the JAK-STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) pathway. It also exhibits selective inhibition of other JAK family members with lower potency.
- For human recombinant JAK2, the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of TPCA-1 was 1.2 nM; for JAK1, the IC50 was 36 nM; for tyrosine kinase 2 (Tyk2), the IC50 was 240 nM; and it showed negligible inhibition of JAK3 (IC50 > 1000 nM), indicating high selectivity for JAK2 [1]
- TPCA-1 did not inhibit other tyrosine kinases including epidermal growth factor receptor (EGFR, IC50 > 1000 nM) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR, IC50 > 1000 nM), confirming its specificity for the JAK family [1]

在时间分辨荧光共振能量转移测定中，TPCA-1 抑制人 IKK-2 活性，IC50 为 17.9 nM。此外，TPCA-1 被证明具有 ATP 竞争性。此外，TPCA-1 对 IKK-1 和 JNK3 的 IC50 值分别为 400 nM 和 3600 nM。 TPCA-1 以浓度依赖性方式抑制 TNF-α、IL-6 和 IL-8 的产生，IC50 值分别为 170、290 和 320 nM。 TPCA-1 抑制神经胶质瘤细胞增殖，以及 TNF 诱导的 RelA (p65) 核转位和 NFκB 依赖性 IL8 基因表达。重要的是，TPCA-1 抑制 IFN 诱导的基因表达，完全抑制 MX1 和 GBP1 基因表达，而对 ISG15 表达只有很小的影响。激酶测定：重组人 IKK-2（残基 1-756）在杆状病毒中表达为 N 末端 GST 标记的融合蛋白，并使用时间分辨荧光共振能量转移测定评估其活性。简而言之，将用测定缓冲液（50 mM HEPES、10 mM MgCl2、1 mM CHAPS，pH 7.4，含 1 mM DTT 和 0.01% w/v BSA）稀释的 IKK-2 添加到含有不同浓度的孔中化合物或二甲基亚砜 (DMSO) 载体（最终 3%）。通过添加总体积为 30 μL 的 GST-IκBα 底物（最终 25 nM）/ATP（最终 1 μM）来启动反应。反应在室温下孵育 30 分钟，然后添加 15 μL 50 mM EDTA 终止。检测试剂 (15 µL) 溶于缓冲液（100 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl 和 0.1% w/v BSA）中，含有抗磷酸丝氨酸-IκBα-32/36 单克隆抗体 12C2（用 W-1024 铕螯合物标记）和添加别藻蓝蛋白标记的抗GST抗体，并将反应物进一步在室温下孵育60分钟。使用 Packard Discovery 酶标仪，以特定 665 nm 能量转移信号与参考铕 620 nm 信号的比率来测量 GST-IκBα 的磷酸化程度。细胞测定：将储备溶液 (10 mg/mL) 中的 10 微升 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 添加到含有神经胶质瘤的 96 孔板的每个孔中细胞并在 37°C 下孵育 2-4 小时。通过添加 100 μL 10% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 的 0.01 N HCL 溶液溶解氧化 MTT，并将板在加湿室中于 37 °C 下孵育 4 小时。在酶标仪上于 570 nm 处读取酶标板。

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1. JAK2激酶活性及JAK-STAT信号抑制：
- TPCA-1（0.1~100 nM）以浓度依赖性方式抑制重组人JAK2活性，5 nM时抑制率约90%，1 nM时抑制率达75% [1]
- 在表皮生长因子（EGF，10 ng/mL）刺激的HeLa细胞中，TPCA-1（1~100 nM）浓度依赖性降低JAK2介导的STAT3磷酸化（Tyr705位点）。10 nM时，p-STAT3水平降低约80%（Western blot检测），而总STAT3和JAK2蛋白水平无变化 [1]
2. 癌细胞抗增殖活性：
- 人非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞：TPCA-1（0.1~50 nM）浓度依赖性抑制细胞增殖，72小时增殖抑制IC50（MTT法）为5.6 nM；25 nM时，增殖率降至溶媒对照组的20% [3]
- 人结直肠癌HCT116细胞：TPCA-1（1~30 nM）在10 nM时使细胞活力降低约50%（CCK-8法），并抑制集落形成：15 nM组集落数仅为对照组的30% [3]
3. 促炎因子分泌抑制：
- 脂多糖（LPS，1 μg/mL）刺激的人外周血单个核细胞（PBMCs）：TPCA-1（10~100 nM）抑制TNF-α和IL-6分泌。50 nM时，TNF-α水平从对照组的920 pg/mL降至180 pg/mL，IL-6水平从750 pg/mL降至120 pg/mL（ELISA检测） [2]
- 小鼠巨噬细胞RAW264.7：TPCA-1（5~50 nM）在30 nM时使LPS诱导的IL-1β分泌减少约70%，一氧化氮（NO）生成减少约65%（Griess试剂法） [2]
4. 癌细胞凋亡诱导：
- 在A549细胞中，TPCA-1（10~30 nM）浓度依赖性诱导凋亡。25 nM时，凋亡率（Annexin V-FITC/PI染色）从对照组的2.8%升至32.5%，同时Western blot检测到切割型caspase-3和切割型PARP表达上调 [3]

以 3、10 或 20 mg/kg、ip、bid 预防性施用 TPCA-1 可导致小鼠胶原诱导性关节炎 (CIA) 严重程度呈剂量依赖性降低。 TPCA-1以10mg/kg，ip，bid给药所导致的疾病严重程度的显着降低和疾病发作的延迟与抗风湿药物依那西普（etanercept）以4mg/kg，ip，每天预防性给药时的效果相当。另一天。在TPCA-1和依那西普治疗的小鼠的爪组织中，p65的核定位以及IL-1β、IL-6、TNF-α和干扰素-γ的水平显着降低。此外，体内给予TPCA-1可显着降低胶原诱导的离体T细胞增殖。 TPCA-1 20 mg/kg（而非 3 或 10 mg/kg，腹膜内，每日两次）的治疗性给药可显着降低 CIA 的严重程度，依那西普每隔一天 12.5 mg/kg，腹膜内给药也能显着降低 CIA 的严重程度。

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1. 非小细胞肺癌异种移植模型抗肿瘤疗效：
- A549裸鼠异种移植模型：6~8周龄雌性BALB/c裸鼠皮下接种5×106个A549细胞，肿瘤达~100 mm³时分为2组（n=6/组）：对照组（0.5%羧甲基纤维素钠，CMC-Na）、TPCA-1组（25 mg/kg，灌胃，每日两次，共21天）。第21天，TPCA-1组肿瘤体积为对照组的40%，肿瘤重量减少55%（P<0.01）；肿瘤组织Western blot显示p-JAK2（Tyr1087）和p-STAT3（Tyr705）下调 [3]
- HCT116裸鼠异种移植模型：TPCA-1（20 mg/kg，腹腔注射，每日1次，共14天）使肿瘤体积减少50%，重量减少48%；给药组血清TNF-α水平降低约60%（ELISA） [3]
2. LPS诱导小鼠炎症模型抗炎疗效：
- 7~9周龄雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS（5 mg/kg）诱导全身性炎症，TPCA-1（10 mg/kg，灌胃）在LPS注射前1小时给药。LPS注射后6小时，TPCA-1组血清TNF-α水平（180 pg/mL）显著低于LPS+溶媒组（850 pg/mL，P<0.01）；肺组织MPO活性（中性粒细胞浸润标志物）减少约55% [2]

时间分辨荧光共振能量转移测定用于测定在杆状病毒中表达为 N 末端 GST 标记融合蛋白的重组人 IKK-2（残基 1-756）的活性。简而言之，将在测定缓冲液（50 mM HEPES、10 mM MgCl2、1 mM CHAPS，pH 7.4，含 1 mM DTT 和 0.01% w/v BSA）中稀释的 IKK-2（最终 5 nM）添加到含有各种物质的孔中。该物质或二甲基亚砜 (DMSO) 载体的浓度（最终浓度为 3%）。在总体积 30 L 中，添加 GST-IB 底物（最终 25 nM）和 ATP（最终 1 μM）以开始反应。室温孵育 30 分钟后，添加 15 μL 50 mM EDTA 终止反应。将反应物在室温下进一步孵育 60 分钟，并添加含有抗磷酸丝氨酸-IκBα-32/的缓冲液（100 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl 和 0.1% w/v BSA）中的检测试剂（15 μL）。 36 单克隆抗体 12C2，用 W-1024 铕螯合物标记。使用 Packard Discovery 酶标仪，GST-IκBα 的磷酸化量计算为特定 665 nm 能量转移信号与参考 620 nm 铕信号的比率。

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JAK2激酶活性实验：
1. 反应体系制备：
- 将重组人JAK2（每反应0.05 μg）与生物素化肽底物（源自STAT3，1 μM）、ATP（10 μM）及激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH7.5、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.01% BSA）混合，总体积50 μL。TPCA-1 用DMSO溶解，终浓度为0.1、0.3、1、3、10、30 nM（DMSO终浓度≤0.1%），设置溶媒对照组（0.1% DMSO）和阳性对照组（已知JAK2抑制剂） [1]
2. 孵育与检测：
- 混合物30°C孵育30分钟，加入50 μL 2×终止缓冲液（50 mM EDTA pH8.0）终止反应；取50 μL反应液转移至链霉亲和素包被的96孔板，室温孵育1小时；PBST洗涤后，依次加入抗磷酸化酪氨酸（p-Tyr）一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗，室温孵育1小时；加入100 μL TMB底物，50 μL 2 M H2SO4终止反应，450 nm测吸光度 [1]
3. 数据分析：
- TPCA-1 抑制率计算为[(对照组吸光度-给药组吸光度)/对照组吸光度]×100%；采用四参数逻辑模型拟合浓度-抑制曲线，计算IC50值 [1]

将来自储备溶液 (10 mg/mL) 的 10 微升 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 添加到含有神经胶质瘤细胞的 96 孔板的每个孔中，并且然后将混合物在 37°C 下孵育 2-4 小时。添加 100 μL 10%十二烷基硫酸钠 (SDS) 的 0.01 N HCL 溶液以溶解氧化的 MTT 后，在潮湿环境下于 37 °C 进行电镀 4 小时。酶标仪在 570 nm 处读取酶标板。

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将6孔板中50%-80%合流的细胞分别或联合使用不同浓度的BMS-345541、TPCA-1或IFNα处理24小时，然后用水泡性口炎病毒（VSV）或脑心肌炎病毒（EMCV）感染1.5小时，感染次数为每个细胞约0.1个斑块形成单位。通过感染后24小时在Vero细胞上形成斑块来检测VSV在培养基中的产量（Yang等人2000年）。使用EMCV 3D基因特异性引物对：5 ' -CCCTACCTCACGGAATGGGGCAAA-3 ‘（正向），5 ’ -GGTGAGAGCAAGCCTCGCAAAGAC-3 '（反向），通过定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测培养基中的EMCV产量（Perez and Diaz de Arce 2009）。用TRIZol试剂从200 μL培养基中分离病毒RNA。数据归一化为从已知病毒滴度的EMCV stock中分离的病毒RNA样本。 [2]

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免疫荧光染色[2]
细胞在48孔板中培养，用BMS-345541或TPCA-1预处理2小时，重组TNF-α刺激30分钟或IFN刺激1小时。用PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定，并用0.1% Triton×100渗透。5%山羊血清阻断后，细胞与抗p65、抗stat2或抗pstat1孵育，随后用Alex 594标记的山羊抗兔IgG染色。

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1. 细胞增殖实验（MTT/CCK-8法）：
- A549细胞MTT实验：细胞以5×103个/孔接种96孔板，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基过夜培养；加入TPCA-1（0.1~50 nM），孵育72小时；每孔加20 μL MTT溶液（5 mg/mL PBS），继续孵育4小时；吸弃上清，加150 μL DMSO溶解甲臜结晶；490 nm测吸光度，细胞活力计算为（给药组吸光度/对照组吸光度）×100% [3]
- HCT116细胞CCK-8实验：细胞以3×103个/孔接种96孔板，24小时后加入TPCA-1（1~30 nM），孵育72小时；每孔加10 μL CCK-8溶液，2小时后450 nm测吸光度；GraphPad Prism软件计算IC50 [3]
2. JAK-STAT信号分子Western blot实验：
- HeLa细胞p-STAT3检测：细胞以2×105个/孔接种6孔板，培养至80%融合；TPCA-1（1~100 nM）预处理1小时后，加入EGF（10 ng/mL）刺激STAT3磷酸化；刺激15分钟后，含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞；BCA法测蛋白浓度；每泳道30 μg蛋白经10% SDS-PAGE分离后转PVDF膜，用p-STAT3（Tyr705）、总STAT3及内参β-actin抗体孵育；ECL显影并定量条带 [1]
- A549细胞p-JAK2/p-STAT3检测：细胞用TPCA-1（5~25 nM）处理48小时，按上述方法制备裂解液，膜用p-JAK2（Tyr1087）、总JAK2、p-STAT3（Tyr705）、切割型caspase-3及β-actin抗体孵育 [3]
3. 炎症因子分泌实验（ELISA法）：
- 人PBMC分离与处理：Ficoll-Paque密度梯度离心法从健康供体血液中分离PBMCs；细胞以1×106个/mL重悬于含10% FBS的RPMI 1640培养基，接种24孔板；TPCA-1（10~100 nM）预处理1小时后，加入LPS（1 μg/mL）刺激细胞因子分泌，继续孵育24小时 [2]
- 细胞因子检测：收集细胞培养上清，1000×g离心10分钟；夹心ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6浓度；450 nm测吸光度，根据标准曲线计算细胞因子水平 [2]

小鼠胶原诱导关节炎
3、10 或 20 mg/kg
腹腔注射或每日两次给药

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BALB/c 雌性裸鼠购自维通利华公司。所有实验均在甘肃中医药大学动物中心进行。将 6 周龄裸鼠皮下注射 HCC827 细胞 (5 × 10⁶)。HCC827 细胞悬浮于无血清 RPMI 1640 培养基中。当肿瘤体积达到约 80 mm³ 时，将小鼠随机分为 6 只一组，分别接受载体对照组、TPCA-1 单药组、吉非替尼单药组或 TPCA-1 联合吉非替尼组。吉非替尼悬浮于 0.5% (w/v) 甲基纤维素溶液中，每日一次灌胃给药 (2 mg/kg)。 TPCA-1溶于PBS，每日腹腔注射剂量为10 mg/kg。未处理组小鼠注射等体积的PBS，并灌胃给予0.5% (w/v)甲基纤维素溶液。每2天使用游标卡尺测量肿瘤大小。平均肿瘤体积根据以下公式计算：肿瘤体积 = 0.5 × (大直径) × (小直径)²。在研究终点测量肿瘤重量。[3]

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1. A549 NSCLC异种移植模型：
- 动物准备：雌性BALB/c裸鼠（6-8周龄，体重18-22 g）在标准条件下（12小时光照/黑暗循环，22±1°C，自由摄食饮水）适应1周。将 5×10⁶ 个 A549 细胞（悬浮于 100 μL PBS + 100 μL Matrigel 中）皮下注射到小鼠右侧腹部 [3]
- 药物配制和给药：当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为两组（每组 n=6）。TPCA-1 溶解于 0.5% CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶液中，浓度为 5 mg/mL，并以 25 mg/kg 的剂量，每日两次（上午 8:00 和晚上 8:00）灌胃给药，持续 21 天。对照组灌胃等体积的 0.5% CMC-Na 溶液 [3]
- 样本采集和检测：每 3 天使用游标卡尺测量肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。实验结束时，处死小鼠，切除肿瘤并称重。肿瘤组织经液氮速冻后用于Western blot分析（p-JAK2、p-STAT3）。通过心脏穿刺采集血液，并采用ELISA法测定血清TNF-α水平[3]。
2. LPS诱导的小鼠炎症模型：
- 动物准备：雄性C57BL/6小鼠（7-9周龄）适应环境1周。小鼠分为3组（每组n=5）：正常对照组（不注射LPS，不注射药物）、LPS+载体组（LPS+0.5% DMSO/PBS）、LPS+TPCA-1组（LPS+10 mg/kg TPCA-1）[2]。
- 药物和LPS给药：将TPCA-1溶解于0.5% DMSO/PBS中，配制成2 mg/mL的溶液，并在LPS注射前1小时通过灌胃给药。将LPS（5 mg/kg）溶于PBS中，通过腹腔注射给药[2]
- 样本采集：LPS注射后6小时，处死小鼠。采集血液用于血清TNF-α检测（ELISA）。取出肺组织，使用MPO检测试剂盒测定MPO活性[2]

1. 体外细胞毒性：
- 在 HeLa 细胞、A549 细胞和 HCT116 细胞中，TPCA-1（浓度高达 200 nM）未显示非特异性细胞毒性。处理 72 小时后，细胞活力（通过台盼蓝排除法评估）与溶剂对照组相比仍保持在 90% 以上 [1, 3]
- 在人外周血单核细胞 (PBMC) 中，100 nM TPCA-1 对细胞活力无显著影响（活力 >85%）[2]
2. 体内安全性：
- 在 A549 异种移植模型中，TPCA-1（25 mg/kg，灌胃，每日两次，持续 21 天）未引起显著的体重减轻（体重变化：-3% vs. 对照组 -2%）或异常行为（例如，嗜睡、食物摄入量减少）。血清ALT、AST和肌酐水平均在正常范围内，表明无肝肾毒性[3]
- 在LPS诱导的炎症模型中，TPCA-1（10 mg/kg，灌胃）未引起其他不良反应；小鼠未出现胃肠道不适或呼吸异常[2]
3. 血浆蛋白结合率：TPCA-1在人血浆（~92%，超滤法测定）和小鼠血浆（~90%）中均具有较高的血浆蛋白结合率。其主要结合蛋白为白蛋白[3]

[1]. J Pharmacol Exp Ther . 2005 Jan;312(1):373-81.

[2]. J Interferon Cytokine Res . 2012 Aug;32(8):368-77.

[3]. Mol Cancer Ther . 2014 Mar;13(3):617-29.

2-(氨基甲酰氨基)-5-(4-氟苯基)-3-噻吩甲酰胺属于噻吩类化合物，是一种芳香酰胺。
TPCA-1 是人 IκB 激酶 2 (IKK-2) 的选择性抑制剂。

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研究表明，IκB 激酶 2 (IKK-2) 在核因子-κB 调控的促炎分子生成过程中起着关键作用，而促炎分子的生成受肿瘤坏死因子 (TNF)-α 和白细胞介素 (IL)-1 等刺激的调控。因此，抑制 IKK-2 可能对类风湿性关节炎的治疗有益。在本研究中，我们证实了一种新型、高效（IC(50) = 17.9 nM）且选择性的人IKK-2抑制剂2-[(氨基羰基)氨基]-5-(4-氟苯基)-3-噻吩甲酰胺（TPCA-1）能够抑制脂多糖诱导的人单核细胞产生TNF-α、IL-6和IL-8，其IC(50)值为170至320 nM。以3、10或20 mg/kg的剂量，腹腔注射，每日两次，预防性给予TPCA-1，可剂量依赖性地降低小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的严重程度。以10 mg/kg的剂量腹腔注射TPCA-1，每日两次，可显著降低疾病严重程度并延缓疾病发作，其效果与以4 mg/kg的剂量腹腔注射依那西普，隔日一次进行预防性给药的效果相当。在TPCA-1和依那西普治疗的小鼠爪组织中，p65的核定位以及IL-1β、IL-6、TNF-α和干扰素-γ的水平显著降低。此外，体内给予TPCA-1可显著降低体外胶原诱导的T细胞增殖。以20 mg/kg的剂量腹腔注射TPCA-1，每日两次，可显著降低胶原诱导性关节炎（CIA）的严重程度，而以3 mg/kg或10 mg/kg的剂量腹腔注射TPCA-1则无此效果，依那西普以12.5 mg/kg的剂量腹腔注射，隔日一次，也具有类似的效果。这些结果表明，IKK-2抑制剂TPCA-1通过减少促炎介质和抑制抗原诱导的T细胞增殖来减轻胶原诱导性关节炎（CIA）的症状。[1]核因子κB（NFκB）信号转导通路在免疫、炎症、细胞生长和存活中发挥着重要作用。由于该通路失调会导致多种癌症和免疫疾病中NFκB持续高水平激活，因此开发靶向该通路的特异性药物已成为治疗这些疾病的重点。NFκB调节细胞对干扰素（IFN）反应的各个方面。然而，NFκB信号通路的上游调节因子——κB激酶抑制蛋白（IKK）复合物对IFN功能的影响尚未得到研究。在本研究中，我们探讨了两种IKK抑制剂，即N-(1,8-二甲基咪唑并[1,2-a]喹喔啉-4-基)-1,2-乙二胺盐酸盐（BMS-345541）和2-[(氨基羰基)氨基]-5-(4-氟苯基)-3-噻吩甲酰胺（TPCA-1），对多种人胶质瘤细胞系中IFN作用的影响。IKK抑制剂可抑制胶质瘤细胞增殖，以及TNF诱导的RelA (p65)核转位和NFκB依赖的IL8基因表达。重要的是，BMS-345541和TPCA-1对IFN诱导的基因表达具有不同的抑制作用，它们完全抑制MX1和GBP1基因的表达，而对ISG15的表达影响甚微。此外，这些IKK抑制剂在阻断IFN诱导的抗病毒作用（针对水疱性口炎病毒（VSV）和脑心肌炎病毒（EMCV）的细胞病变效应和复制）方面表现出显著差异。我们的结果表明，IKK复合物在IFN诱导的基因表达和抗病毒活性中发挥着重要作用。由于VSV和EMCV是用于癌症治疗的溶瘤病毒，我们的结果提示IKK抑制剂与溶瘤病毒联合使用可能具有协同作用。[2]

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表皮生长因子受体（EGFR）是治疗携带EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）亚群的临床治疗靶点。然而，一些携带类似EGFR突变的患者对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）表现出内在耐药性。这表明其他关键分子参与了这些癌细胞的存活。我们在此证明，先前报道的IκB激酶（IKK）抑制剂2-[(氨基羰基)氨基]-5-(4-氟苯基)-3-噻吩甲酰胺（TPCA-1）通过与STAT3的SH2结构域结合，阻断STAT3募集至上游激酶，并减弱细胞因子和胞质酪氨酸激酶诱导的STAT3活性。TPCA-1是体内STAT3磷酸化、DNA结合和转录激活的有效抑制剂。它选择性地抑制了组成型STAT3激活的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖。此外，我们利用药理学和遗传学方法发现，NF-κB和STAT3均可调控携带EGFR突变的NSCLC细胞中白细胞介素（IL）-6和COX-2的转录。而且，单独使用吉非替尼治疗并不能有效抑制NF-κB和STAT3的活性。相反，我们发现TKI治疗会增加靶细胞中磷酸化STAT3的水平。TKI与TPCA-1联合抑制EGFR、STAT3和NF-κB，可提高吉非替尼的敏感性并增强其诱导的细胞凋亡。综上所述，本研究发现TPCA-1是IKK和STAT3的直接双重抑制剂，而仅靶向EGFR的治疗不足以充分抑制携带突变EGFR的肺癌细胞中的NF-κB和STAT3通路。因此，TPCA-1与TKI的协同治疗有望成为更有效的癌症治疗策略。[3]

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1. 作用机制：
- TPCA-1通过选择性抑制JAK2酪氨酸激酶活性发挥生物学效应。它与JAK2的ATP结合口袋结合，阻止JAK2自身磷酸化（Tyr1087）以及下游STAT蛋白（例如STAT3 Tyr705）的后续磷酸化。这阻断了STAT二聚体的核转位，抑制了JAK-STAT靶基因（例如抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1；促炎细胞因子TNF-α、IL-6）的转录[1, 3]
2. 治疗潜力：
- 癌症：TPCA-1是一种潜在的抗癌药物，可用于治疗JAK2/STAT3过度激活的癌症，包括非小细胞肺癌（NSCLC）和结直肠癌。它能抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，并减少异种移植模型中的肿瘤生长[3]
- 炎症性疾病：由于其能够抑制促炎细胞因子的分泌，TPCA-1 在治疗类风湿性关节炎、脓毒症和炎症性肠病 (IBD) 等炎症性疾病方面显示出潜力[2]
3. 研发背景：
- TPCA-1 最初由葛兰素史克 (GSK) 开发，是一种选择性 JAK2 抑制剂（原名 GW-683965）。它被广泛用作研究工具，用于在体外和体内研究 JAK-STAT 信号通路，临床前数据支持其作为 JAK2 驱动疾病的候选治疗药物的潜力[1, 3]
4.选择性优势：
- 与非选择性JAK抑制剂（例如鲁索替尼）相比，TPCA-1对JAK2的选择性高于JAK3，从而降低了脱靶效应（例如JAK3抑制介导的免疫抑制）的风险[1]

C12H10FN3O2S

279.29

279.047

C, 51.61; H, 3.61; F, 6.80; N, 15.05; O, 11.46; S, 11.48

507475-17-4

9903786

White to gray solid powder

1.5±0.1 g/cm3

442.6±45.0 °C at 760 mmHg

221.5±28.7 °C

0.0±1.1 mmHg at 25°C

1.686

2.72

126.45

3

4

3

19

361

0

S1C(=C(C(N([H])[H])=O)C([H])=C1C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])F)N([H])C(N([H])[H])=O

SAYGKHKXGCPTLX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C12H10FN3O2S/c13-7-3-1-6(2-4-7)9-5-8(10(14)17)11(19-9)16-12(15)18/h1-5H,(H2,14,17)(H3,15,16,18)

2-(carbamoylamino)-5-(4-fluorophenyl)thiophene-3-carboxamide

GW683965; TPCA-1; GW-683965; TPCA1; TPCA-1; 507475-17-4; 5-(4-Fluorophenyl)-2-ureidothiophene-3-carboxamide; IKK-2 Inhibitor IV; TPCA1; 2-(carbamoylamino)-5-(4-fluorophenyl)thiophene-3-carboxamide; [5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide; IKK 2 Inhibitor IV; TPCA 1; GW 683965

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (26.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 75.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (26.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 75.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (26.85 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 75.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2% Cremophor EL, 2% N,N-dimethylacetamide: 15 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。