TX1-85-1

Her3 (ErbB3) (IC50 = 23 nM)

TX1-85-1 对 Ovcar8、HCC827 GR6 和 PC9 GR4 细胞的抗增殖 EC50 分别为 9.9、11.5 和 16.9 μM[1]。
在迭代合成和测定约100种吡唑并嘧啶丙烯酰胺后，我们开发了“先导”化合物TX1-85-1（4），其在结合试验中的IC50为23 nM（图1a，b）。TX1-85-1可以被视为KIN001-051铰链结合部分和KIN001-111溶解度增强尾部的分子汞合金，与丙烯酰胺臂结合到达Cys721（图1c）。正如共价抑制剂所预期的那样，与蛋白质孵育更长时间后，表观IC50会降低，并在约3小时时达到平稳状态（补充图2）。质谱用于确认TX1-85-1共价添加到重组Her3激酶结构域蛋白中，随后用胰蛋白酶对Her3进行蛋白水解，MS2分析揭示了Cys721的独特修饰（补充图3）。接下来，我们使用细胞竞争结合试验研究了TX1-85-1是否可以在细胞中与Her3形成共价键。为了实现这些实验，我们合成了一种生物素化衍生物（TX1-85-1-biotin）（5），该衍生物仍然保留了与Her3共价结合的能力（图1a，补充图4，IC50=50.7 nM）。将细胞与TX1-85-1一起孵育，然后用TX1-85-1-生物素标记裂解物，以量化在最初与TX1-855-1孵育时未标记的Her3的量。我们确定，将PC9 GR4细胞（EGFR E746_A750/T790M）与5μM TX1-85-1孵育8小时，可以完全保护Her3免受随后TX1-85-1-生物素的标记（图1d）。这一结果表明，TX1-85-1（分子量=580Da）可以穿过细胞膜，并能够在细胞内与Her3完全“靶向结合”。为了检查TX1-85-1修饰Her3的特异性，我们使用KiNativ®方法进行了活细胞化学蛋白质组学实验，该实验证明了与Her3以及Lyn、Her2和其他几种Src家族激酶的有效结合（补充表1）。预计会与Lyn、Her2和其他几种Src家族激酶结合，因为这些激酶被非丙烯酰胺筛选靶化合物KIN001-111等效结合，这表明与这些靶标的相互作用是非共价的。总的来说，这些结果表明TX1-85-1能够在体外和细胞内共价修饰Her3的Cys721。[1]

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TX1-85-1不会阻止Her3依赖性信号传导或生长[1]
接下来，我们评估了TX1-85-1抑制Her3依赖性信号传导和生长的能力。我们使用了两种已建立的肺癌细胞系，PC9 GR4（EGFR E746_A750/T790M）、HCC827 GR6（EGFR E646_A750/MET扩增）18，37和卵巢癌症细胞系Ovcar8，我们使用siRNA介导的Her3缺失再次确认其对Her3“上瘾”（补充图5）。TX1-85-1对所有三种细胞系都具有大于或等于约10μM的抗增殖EC50（图2a）。当TX1-85-1的浓度足以完全标记细胞中的Her3时（5μM），PC9 GR4细胞没有生长抑制，Her3的重要下游效应器Akt的磷酸化也没有受到抑制（图2b）。这些结果表明，尽管TX1-85-1成功地将Her3靶向结合到细胞中，但在所研究的条件下，该化合物不能抑制Her3依赖性功能。

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TX1-85-1-金刚烷偶联物诱导Her3降解[1]
最近的报道表明，用疏水性小分子共价修饰蛋白质会导致其蛋白酶体介导的降解25,26,38,39。虽然对这一现象的详细机制尚不清楚，但有相当多的证据表明，细胞已经进化出复杂的蛋白质稳态机制，可以消除未折叠和受损的蛋白质，这些蛋白质可能是由这种疏水标记策略参与的。在报道的疏水标签中，我们选择了金刚烷基团，因为它能够以最小的分子量增加密集地引入疏水性。合成了一系列具有将TX1-85-1与金刚烷部分连接的各种连接体的化合物，并证实其与Her3有效结合，鉴定出一种代表性分子（TX2-121-1）（6），在基于蛋白质的结合分析中显示IC50为49.2 nM。为了确认TX2-121-1的选择性与TX1-85-1的选择性保持相似，我们进行了KiNativ®分析。TX2-121-1的选择性与TX1-85-1非常相似，与Her3的结合最强（90.3%）。TX2-121-1脱靶标记列表包括Her2、EGFR、几种Src家族激酶，如Src、Yes和Lyn，正如预期的那样，与TX1-85-1的脱靶列表相同。（附表1）。为了研究TX1-85-1和TX2-121-1是否可以直接抑制EGFR或Her2，我们使用Ba/F3 EGFR VIII细胞系进行了酶法测定（Z′-LYTE）和细胞增殖测定（补充图6）。TX2-121-1在低于10μM的浓度下不直接抑制EGFR或Her2的酶活性，也不抑制EGFR依赖性增殖。

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为了证实观察到的药理学是Her3依赖性的，我们改造了PC9 GR4细胞，使其具有含有反应性Cys721的天然Her3或含有非反应性丝氨酸突变C721S的Her3。ErbB3的Sanger DNA测序证实了突变（补充图7）。我们使用TX1-85-1-生物素偶联化合物进行下拉分析，验证了靶点参与。事实上，TX1-85-1-biotin有效地降低了Her3-WT，但没有降低Her3-C721S，这表明TX1-85-1-biotin的丙烯酰胺基序与C721形成了特定的共价相互作用，但没有与C721S-Her3形成共价键（补充图8）。

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我们对表达野生型或C721S突变体Her3的PC9 GR4细胞进行了细胞增殖试验，其中TX1-85-1和TX2-121-1及其相应的丙酰胺对照（TX1-85-3（9）和TX2-135-2），以研究亲电丙烯酰胺和金刚烷部分的重要性。这些实验表明，C721S Her3的EC50向右偏移了6倍（PC9 GR4 Her3 C721S的EC50=5.5μM），而野生型Her 3表达细胞（PC9 GRU4 WT Her3的EC 50=0.9μM）仅对TX2-121-1具有亲电弹头和金刚烷部分（图4a，补充图9），下游信号蛋白质印迹与抗增殖结果一致（图4b）。所有其他化合物：TX1-85-1、TX1-85-3和TX2-135-2在PC9 GR4 Her3 WT和PC9 GR4-Her3 C721S上的EC50相似。这些结果表明，在这种细胞系统中，有效抑制Her3依赖性生长需要共价修饰和金刚烷部分的存在。顺便说一句，我们还观察到两个可逆的对照，即带有金刚烷基团的TX2-135-2比TX1-85-3更具抗增殖性[1]。

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抑制ErbB2或ErbB3抑制了miPSCs向CSCs的转化[2]
为了评估ErbB2/ErbB3信号在转化过程中的作用，前一节提出的假设是，拉帕替尼作为ErbB2的酪氨酸激酶抑制剂，TX1-85-1作为ErbB3抑制剂，用于中断酪氨酸激酶。MTT法显示，拉帕替尼对miPSCs的IC50约为12µM，而TX1-85-1的IC50约等于25µM（图3A）。miPSCs通常与白血病抑制因子（LIF）一起培养以保持其干燥性，miPSCs将开始分化并停止生长，即在没有LIF的情况下无法存活。在没有LIF的情况下培养的miPSCs失去了GFP表达，无法通过传代存活。相比之下，在PK8细胞的CM存在下，miPSCs在没有LIF的情况下保持GFP表达并保持增殖。含有1µM或5µM拉帕替尼的CM似乎维持了GFP，而观察到5µM的粘附细胞分化增强（图3B）。用CM和10µM TX1-85-1培养的一部分细胞保持GFP，分化的细胞在粘附细胞培养条件下显示为GFP阴性细胞。细胞完全失去GFP表达，并用20µM TX1-85-1分化，在治疗一周后无法存活（图3C）。

我们的研究小组已经证明，当在癌症细胞的CM中培养时，转化为CSC的iPSC保持自我更新和结肠形成能力。在转化过程中评估了拉帕替尼和TX1-85-1对集落和球体形成的影响。在1和5µM拉帕替尼存在下培养的miPSCs显示菌落数量减少（图4A）。虽然1µM的减少微不足道，但5µM的菌落数量从250个显著减少到17个（图4B）。用TX1-85-1培养的细胞以剂量依赖的方式显示集落数减少。1、5和10µM TX1-85-1的平均菌落数分别为217、163和20（图4A、C）。1µM和5µM拉帕替尼、5µM和10µM TX1-85-1也抑制了在无血清培养基中低附着培养条件下培养的miPSCs的球体形成能力，而用CM培养的miPSC保持了球体形成能力（图4C）。

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抑制ErbB2或ErbB3可增强Erk的激活，并在转化过程中减弱茎性[2]
为了研究ErbB2和ErbB3信号传导在转化过程中的作用，评估了拉帕替尼和TX1-85-1对miPSC在转化期间获得CSC特征的影响。western blot显示，与用LIF培养的miPSCs相比，在CM中培养的miPSC保持Oct3/4水平，而作为CSC标志物的CD24略有增加。另一方面，在1µM拉帕替尼存在下培养的miPSCs中，Oct3/4和CD24的水平得以维持。与没有拉帕替尼培养的细胞中的水平相比，在5µM拉帕替尼存在的情况下，Oct3/4和CD24水平显著降低（图6Aa，B）。数据还显示，与不含拉帕替尼的miPSCs相比，在5µM拉帕替尼存在下培养的miPSCs中Erk过度激活，干性减弱。与没有拉帕替尼的情况相比，1µM拉帕替尼可降低CM中培养的miPSCs中的Erk激活（图6Aa，B）。用小干扰RNA（siRNA）或10µMTX1-85-1抑制ErbB3会降低Oct3/4和Nanog水平，并过度激活Erk。与阴性siRNA对照相比，用siRNA靶向ErbB3也显示出CD24水平的降低。（图6Ab、c、c、D）。

Her3标记为TX1-85-1[1]
通过在室温下将浓度为15μM（0.5mg/ml）的纯化Her3蛋白与150μM TX1-85-1在含有50mM MOPS pH 7、50mM硫酸铵、1mM TCEP和5%甘油的缓冲液中孵育2小时，实现了用TX1-85-1标记。

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LanthaScreen®技术激酶结合分析[1]
结合效力（IC50）通过LanthaScreen®Eu激酶结合试验进行测量，该试验基于Alexa Fluor 647标记的ATP竞争性激酶抑制剂支架的结合和置换。使用铕标记的抗标记抗体（抗GST）检测示踪剂与激酶的结合。纯化的ErbB3（665-1001）蛋白从Life Technologies获得，浓度为1.19 mg/ml，溶于50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.02%Triton®X-100、2 mM DTT、50%甘油中。典型的实验程序是用激酶缓冲液A（50 mM HEPES，pH 7.5，10 mM MgCl2，1 mM EGTA，0.01%Brij-35）将ErbB3蛋白稀释至30 nM，然后将ErbB蛋白1:1与12 nM LanthaScreen®Eu抗GST抗体溶液混合，该溶液也在激酶缓冲液A.中稀释。使用前，将抗体管解冻并在约10000 g下离心5分钟，从溶液顶部吸取用于测定的量。此离心步骤将消除因产品中的任何颗粒而偶尔出现的虚假数据点。接下来，将5μl ErbB3蛋白和Eu抗GST的混合物加入康宁384板中每孔5μl的测试化合物溶液中。然后，以每孔39 nM的浓度加入5μl激酶示踪剂178。然后将平板在4°C下孵育3小时，并用Perkin-Elmer EnVision®读取。

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完整Her3[1]的质谱分析
将经TX1-85-1处理的Her3（约1μg）装载到自填充反相柱上（外径1/32英寸x内径500μm，含5cm POROS 10R2树脂）。脱盐后，用HPLC梯度（4分钟内0%–100%B，A=0.2 M乙酸水溶液，B=0.2 M醋酸乙腈溶液，流速=10μl/min）将蛋白质洗脱到QSTAR Elite质谱仪中，扫描M/z 330–1500。使用MagTran1.03b2软件对质谱进行解卷积。

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蛋白酶消化和肽片段的纳米LC/MS分析[1]
TX1-85-1处理的Her3（约1μg）用碳酸氢铵缓冲液（pH 8.0）稀释，在56°C下用10 mM DTT还原30分钟，用22.5 mM碘乙酰胺烷基化30分钟（室温黑暗），并在37°C下与胰蛋白酶消化过夜。将消化的肽（约2 pmol）注射到自填充的预柱（4 cm POROS10R2）上，并使用HPLC梯度（20分钟内0%~35%的B，a=0.2 M乙酸水溶液，B=0.2 M醋酸乙腈溶液，流速~30 nl/min）52洗脱到质谱仪中。对每次MS扫描（图像电流检测；分辨率=30K）中的前10个离子进行CAD（电子倍增检测，相对碰撞能量35%，q=0.25）。启用了动态排除，重复计数为1，排除持续时间为15秒。

MTT法[2]
将miPSCs以5000个细胞/孔的密度接种在96孔板中，用补充了50%CM的miPS培养基接种，并在37°C和5%CO2下孵育。接种24小时后，用不同浓度的拉帕替尼或TX1-85-1孵育细胞，孵育24小时后用噻唑蓝-四唑蓝评估细胞存活率。将浓度为0.5mg/mL的MTT溶液加入孔中，并在37°C的5%CO2中孵育平板4小时。孵育后，丢弃培养基，用100µL DMSO溶解甲赞晶体，用MTP-800 Lab酶标仪在570 nm处测量吸光度。根据存活曲线估算IC50值。

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菌落和球体形成试验[2]
为了进行菌落分析，将1000个miPSCs培养在60mm培养皿中，培养基中含有1000U/ml LIF的miPS培养基。接种24小时后，培养基改为不含LIF的miPS培养基，补充50%CM、50%CM和1µM拉帕替尼、50%CM与5µM拉帕替尼，或补充50%CM和1.5或10µM TX1-85-1。细胞在37°C和5%CO2中孵育7天。孵育后，用75%甲醇固定细胞，并用Giemsa染色。对培养皿进行拍照，并使用ImageJ软件对直径为 ≥ 50 µm.为了评估细胞形成球体的能力，将在补充了上述条件的miPS培养基中培养一周的miPSCs以1000个细胞/孔的密度接种到24孔超低附着板中，该板含有由DMEM、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mMβ-ME、0.1 mM NEAA和ITS-X组成的无血清培养基，并补充了青霉素/链霉素和0.1或5µM拉帕替尼或1、5、10µM TX1-85-1。然后将细胞在37°C的5%CO2中孵育7天，并使用配备有光荧光装置的Olympus IX81显微镜拍摄形成的球体。

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蛋白质印迹[2]
在含有50%CM、50%CM和1µM拉帕替尼或50%CM和5µM拉帕替尼或含有50%CM和10µMTX1-85-1的miPS培养基中培养一周的miPSCs，用由50 mM Tris pH 8.0、150 mM氯化钠、0.05%Triton X-100和0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）组成的裂解缓冲液裂解转染有阴性对照siRNA或ErbB3 siRNA的细胞。蛋白酶和磷酸酶抑制剂也加入到裂解缓冲液中。裂解的细胞进一步超声处理，在4°C下以15000xg离心30分钟，收集上清液并保持在-80°C。通过Pierce™BCA蛋白检测试剂盒评估总蛋白浓度，将30µg总蛋白装载在SDS-PAGE上，转移到Immobilon FL转移膜上。

[1]. Pharmacological targeting of the pseudokinase Her3. Nat Chem Biol. 2014 Dec;10(12):1006-12.

[2]. The significance of ErbB2/3 in the conversion of induced pluripotent stem cells into cancer stem cells. Sci Rep. 2022 Feb 17;12(1):2711.

TX1-85-1 是一种芳香醚。

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本文报道了首个小分子 Her3 ATP 竞争性结合剂 TX1-85-1 的开发，该化合物可通过共轭加成与 Cys721 共价修饰 Her3。用微摩尔浓度的 TX1-85-1 处理细胞，可使 Her3 发生共价修饰，且其激酶组选择性与该化合物的化学类型一致。尽管 TX1-85-1 成功结合靶点，但 PC9 肺癌细胞系的增殖和 Her3 依赖性功能（包括下游效应分子 Akt 的磷酸化）并未受到影响。然而，尽管 TX1-85-1 对 Her3 依赖性细胞系（如 Ovcar8 和 HCC2935）的生长抑制作用很弱（EC50>10 μM），但它能够诱导 Her3 蛋白的部分降解并减弱 Her3 依赖性信号传导。这些结果与一些研究结果一致，这些研究表明，某些非共价激酶抑制剂，如 Her2（拉帕替尼）和 b-Raf（维莫非尼），也会导致其激酶靶标的部分降解。[1]

C32H36N8O3

580.680046081543

580.291

C, 66.19; H, 6.25; N, 19.30; O, 8.27

1603845-32-4

78243752

White to light yellow solid powder

3.3

132

2

8

7

43

962

0

C(NC1=CC(C2C3=C(N)N=CN=C3N(C3CCC(N4CCN(C(C)=O)CC4)CC3)N=2)=CC=C1OC1=CC=CC=C1)(=O)C=C

FYICDSWKKFSYOM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C32H36N8O3/c1-3-28(42)36-26-19-22(9-14-27(26)43-25-7-5-4-6-8-25)30-29-31(33)34-20-35-32(29)40(37-30)24-12-10-23(11-13-24)39-17-15-38(16-18-39)21(2)41/h3-9,14,19-20,23-24H,1,10-13,15-18H2,2H3,(H,36,42)(H2,33,34,35)

N-[5-[1-[4-(4-acetylpiperazin-1-yl)cyclohexyl]-4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin-3-yl]-2-phenoxyphenyl]prop-2-enamide

TX185-1 TX1 85-1 TX1-85-1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~3.85 mg/mL (~6.63 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.38 mg/mL (0.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 3.8 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.38 mg/mL (0.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 3.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。