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| 靶点 |
bestatin (as bestatin methyl ester, BME) targets Zn²⁺-binding aminopeptidases, specifically puromycin-sensitive aminopeptidase A (PsaA) in Dictyostelium discoideum. BME is a more cell-permeable analog of bestatin.
bestatin also targets the related aminopeptidase PsaB (not characterized in this study). [4] Ubenimex targets aminopeptidase B, leukotriene A4 hydrolase, and aminopeptidase N. It competitively inhibits many aminopeptidases, including B, N, and leucine aminopeptidases. It is used in the treatment of acute myelocytic leukemia. |
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| 体外研究 (In Vitro) |
在对ATRA敏感的APL NB4细胞中，贝斯他汀促进ATRA诱导的分化，并抑制ATRA驱动的p38 MAPK磷酸化。贝斯他汀不能逆转ATRA耐药的APL MR2细胞的分化阻滞。当CD13与抗CD13抗体WM-15结合时，p38 MAPK发生磷酸化。这降低了贝斯他汀对p38 MAPK磷酸化的抑制作用，并完全消除了贝斯他汀对ATRA诱导的NB4细胞分化的刺激作用[2]。用贝斯他汀（600 μM）处理的细胞由于细胞分裂和生长频率降低，细胞周期进程减慢。贝斯他汀抑制盘基网柄菌（D）的固有多核化和有丝分裂频率，且不引起D细胞死亡。在0-600 μM剂量下，贝斯他汀对盘基网柄菌细胞均有抑制作用。在 PsaA-GFP 和 GFP 表达细胞裂解液中，贝斯他汀分别使氨肽酶活性降低了 69.39% 和 39.93% [4]。
在盘基网柄菌中，用浓度为 10、50、100、300 或 600 μM 的贝斯他汀甲酯 (BME) 处理 48 小时，导致细胞密度增加呈浓度依赖性下降。在 600 μM 浓度下，细胞密度较未处理对照组增加了 3.25 倍（未处理对照组为 18.46 倍），抑制率为 82.3%。 BME 处理以浓度依赖的方式延长细胞倍增时间，从 0 μM 时的 8.22 ± 0.96 小时延长至 600 μM 时的 30.41 ± 3.07 小时（延长 3.70 倍）。 经 BME 处理（600 μM）的细胞核仁面积（占核面积的 4.69% ± 0.93%）比未处理细胞（占核面积的 20.07% ± 2.93%）小 0.23 倍，这种现象与细胞生长缓慢有关。 BME 处理增加了单核细胞的比例。在 600 μM 浓度下，单核细胞比例为 86.67% ± 6.54%，而未处理的对照组为 38.89% ± 4.81%（增加了 2.23 倍）。 BME 抑制了核浓度的增加。48 小时后，600 μM BME 处理组的核浓度为未处理组的 0.11 倍（抑制率为 89%）。 BME 无细胞毒性；在 300 μM 和 600 μM 浓度下，活细胞比例分别为 99.14% ± 1.22% 和 95.78% ± 3.25%，并且观察到了处于所有有丝分裂阶段的细胞。 在发育中的细胞中，BME（600 μM 和 900 μM）影响孢子细胞分化。在 600 μM 浓度下，孢子更圆；在 900 μM 浓度下，末端孢子细胞分化被完全抑制（孢子团中无末端分化的孢子）。 在过表达 PsaA-GFP 的细胞中，BME（600 和 900 μM）导致发育异常：未形成子实体，细胞聚集形成不规则的丘状结构，所有细胞均末端分化为柄细胞（无孢子）。在过表达 PsaAΔNLS2-GFP 的细胞中，BME（600 μM）导致孢子呈圆形，而 900 μM 则抑制末端孢子分化。[4] 体外实验表明，乌苯美克斯可促进 ATRA 诱导的分化，并抑制 ATRA 敏感的 APL NB4 细胞中 ATRA 驱动的 p38 MAPK 磷酸化。它抑制氨肽酶 B、白三烯 A4 水解酶和氨肽酶 N。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
在糖尿病小鼠中，与接受糖尿病载体治疗的小鼠相比，贝斯他汀（20 μM）显著抑制了MMP-9特异性溶胶区密度，并显著降低了CD13的表达。贝斯他汀治疗显著抑制了糖尿病小鼠的VEGF和肝素酶表达。在糖尿病小鼠的视网膜中，玻璃体内注射贝斯他汀显著降低了VEGF和HIF-1α的产生。此外，玻璃体内注射贝斯他汀可显著抑制糖尿病小鼠视网膜中肝素酶表达的升高[1]。当脾细胞用贝斯他汀（10、1和0.1 mg/kg，腹腔注射）处理后，在出现针对绵羊红细胞（SRBC）的抗原增强体液免疫应答之前，它们会产生更多的溶血性抗SRBC抗体（PFC）和更多的2-巯基乙醇（2-ME）耐受性血清。血凝素滴度（0.1 mg/kg）在环磷酰胺注射后，每隔一天给小鼠注射五次贝斯汀（1 和 0.1 mg/kg），并未改变该药物对前额叶皮层（PFC）数量的抑制作用，事实上，在抗原剂量为 1 mg/kg 时，刺激后七天，总抗绵羊红细胞血凝素的减少更为显著[3]。
体内发育实验：将盘基网柄菌 AX3 细胞接种于黑色滤膜上，滤膜垫浸泡在含有 600 或 900 μM 贝斯汀甲酯 (BME) 的蒸馏水中。培养 24 小时后，用钙荧光染色子实体，以分析菌柄和孢子细胞的形态。BME 处理抑制了孢子细胞的分化，并导致孢子变圆。在 900 μM 浓度下，孢子末端分化被阻断。 [4] 在体内，ubenimex 用于治疗急性髓细胞白血病。目前，它在美国正处于治疗肺动脉高压和淋巴水肿的 II 期临床试验阶段。它由日本化药株式会社研发。 |
| 酶活实验 |
荧光法氨肽酶活性测定：收集细胞，洗涤后用NP-40裂解缓冲液裂解。采用Bradford法定量细胞总蛋白。取10 μL细胞总蛋白（1 mg/mL）与290 μL底物溶液混合，该底物溶液含有0.1 mg/mL二硫苏糖醇（DTT）、0.1 mg/mL白蛋白和1 mM丙氨酸-β-萘酰胺。分别于15分钟和30分钟后进行荧光测定，激发波长为340 nm，发射波长为400 nm。15分钟和30分钟两次测定值的斜率代表氨肽酶活性。在进行测定前，将总细胞蛋白与贝斯他汀、阿马斯他汀、嘌呤霉素、EDTA 和/或氯化锌预孵育 20 分钟。
在该测定中，过表达 PsaA-GFP 的细胞的全细胞裂解液的氨肽酶活性比亲代 AX3 细胞高出 2 倍以上（229.97% ± 41.3%）。仅表达 GFP 的细胞裂解液的活性与 AX3 细胞相似（95.33% ± 6.2%）。嘌呤霉素 (200 μM) 使 PsaA-GFP 裂解液中的氨肽酶活性抑制了 39.39% ± 3.1%（以对照组为基准）；使 GFP 裂解液中的氨肽酶活性抑制了 17.68% ± 1.9%。贝斯他汀甲酯（BME，300 μM）对 PsaA-GFP 裂解液的活性抑制率为对照组的 69.39% ± 10.5%，对 GFP 裂解液的活性抑制率为对照组的 39.93% ± 18.7%。阿马他汀（20 μM）对 PsaA-GFP 裂解液的活性抑制率为 37.24% ± 3.6%，对 GFP 裂解液的活性抑制率为 47.01% ± 12.2%。EDTA（5 mM）对 PsaA-GFP 裂解液的活性抑制率为 43.00% ± 4.7%，对 GFP 裂解液的活性抑制率为 14.90% ± 19.0%。 ZnCl₂ (10 μM) 可部分逆转 EDTA 对 PsaA-GFP 裂解液的抑制作用（逆转率 17.68%），并使 GFP 裂解液中的活性提高 27.24% ± 16.0%。单独使用 ZnCl₂ 可使 PsaA-GFP 裂解液中的活性提高 85.18% ± 19.4%，使 GFP 裂解液中的活性提高 49.35% ± 18.0%。[4] 使用纯化的氨肽酶 B、氨肽酶 N 或白三烯 A4 水解酶进行无细胞酶抑制试验。将 Ubenimex 与酶和荧光或显色底物一起孵育，并通过测量产物生成的减少来确定其抑制活性。 |
| 细胞实验 |
细胞活力染色：将细胞用不同浓度的贝斯他汀甲酯 (BME) 处理 24 小时后收集，然后用荧光素二乙酸酯 (20 μg/ml) 和碘化丙啶染色 5 分钟。每个处理组至少计数 100 个细胞。对活细胞（FDA 阳性，PI 阴性）进行定量。在 300 μM 和 600 μM BME 浓度下，细胞活力分别为 99.14% ± 1.22% 和 95.78% ± 3.25%，在较低浓度下未检测到死亡细胞。
细胞生长和倍增时间测定：将生长中的盘基网柄菌细胞（1×10⁶ 至 2×10⁶ 个细胞/ml）稀释至 1.0×10³ 个细胞/ml，并转移至 12 孔板中。细胞分别用 0、10、50、100、300 或 600 μM BME 处理，并在 21°C 下以 180 rpm 的转速摇床培养 48 小时。分别在 0、24 和 48 小时使用血细胞计数器测量细胞密度。倍增时间根据 24 至 48 小时的数据计算。 核计数：细胞用超冷甲醇固定，并用含 DAPI 的抗淬灭剂封片。使用荧光显微镜计数细胞核。 免疫定位：细胞固定、封闭后，与抗 PsaA 或抗 NumA1 抗体（1:20 或 1:40）孵育，随后与 Alexa Fluor 二抗孵育。之后，细胞与抗 α-微管蛋白抗体（1:100）孵育，随后与二抗孵育。盖玻片用含 DAPI 的抗淬灭剂封片。使用尼康Eclipse 50i显微镜采集图像。 蛋白质印迹分析：为分析PsaA的表达，将2×10⁶个生长发育中的细胞用NP-40裂解缓冲液裂解。将样品（25 μg/泳道）在12% SDS-PAGE凝胶上进行分离，转移至PVDF膜，并用兔抗PsaA抗体（1:500）、鼠抗α-微管蛋白抗体（1:1000）或鼠抗GFP抗体（1:600）进行杂交。使用ECL Plus化学发光检测系统进行显色。 Northern印迹：将生长发育中的细胞的总RNA在1%琼脂糖-甲醛凝胶上进行分离（25 μg/泳道），转移至带正电荷的尼龙膜，并进行紫外交联。使用DIG标记的psaA和rnlA探针。预杂交（2小时）和杂交（过夜）均在42℃下进行。将印迹曝光于胶片 5 分钟。 形态发生素处理：将 AX3 细胞以 2×10⁶ 个细胞/ml 的浓度在 KK2 缓冲液中饥饿培养，然后分别用 20 mM NH₄Cl、1 mM cAMP 或 100 nM DIF-1 单独或联合处理，在 250 rpm 下振荡培养至多 4 小时。分别在处理后 2 小时和 4 小时收集细胞，裂解细胞，并通过 Western blot 分析 PsaA 的表达。[4] 体外细胞实验使用癌细胞系，例如 ATRA 敏感的 APL NB4 细胞。用 ubenimex 处理细胞，并检测分化标志物。氨肽酶活性的抑制可通过测量细胞裂解液中荧光底物的裂解来评估。 |
| 动物实验 |
由于本研究是在盘基网柄菌（一种社会性变形虫）而非动物身上进行的，因此动物实验方案不适用。“体内”实验指的是使用该生物体在滤膜上进行的发育测定。文中未描述任何动物（哺乳动物）实验方案。[4]
体内疗效在白血病或其他癌症的动物模型中进行评估。通过适当的途径给药，并监测肿瘤的生长和存活情况。其对免疫系统的影响也在免疫功能模型中进行评估。 |
| 药代性质 (ADME/PK) |
硫酸乌贝尼克斯的分子式和分子量与其盐形式相符。它是一种二肽，能特异性抑制细胞膜上的白三烯A4水解酶、氨肽酶B和亮氨酸氨肽酶的活性。目前，它正处于治疗肺动脉高压和淋巴水肿的II期临床试验阶段。
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
乌苯美司的毒性与其酶抑制作用有关。作为一种免疫调节剂和抗肿瘤药物，其副作用可能包括胃肠道紊乱和对免疫功能的潜在影响。其安全性已在白血病和其他疾病的临床试验中得到评估。
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| 参考文献 |
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| 其他信息 |
乌贝尼胺（又名贝斯汀）是一种竞争性蛋白酶抑制剂。它能抑制氨肽酶B、白三烯A4水解酶和氨肽酶N。目前，其治疗急性髓系白血病的潜力正在研究中。据报道，乌贝尼胺存在于链霉菌（Streptomyces abikoensis）和橄榄链霉菌（Streptomyces olivoreticuli）中，并已有相关数据。乌贝尼胺是一种微生物代谢产物和二肽，具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。乌贝尼胺能竞争性抑制多种氨肽酶，包括氨肽酶B、氨肽酶N和亮氨酸氨肽酶。氨肽酶参与细胞黏附和肿瘤细胞侵袭。因此，抑制氨肽酶可能是乌贝尼胺发挥抗肿瘤作用的部分原因。该药物还能激活T淋巴细胞、巨噬细胞和骨髓干细胞，并刺激白细胞介素-1和白细胞介素-2的释放，从而进一步增强其抗肿瘤活性。
药物适应症 用于急性和慢性粒细胞白血病、肺癌和鼻咽癌的辅助治疗。也用于治疗高胆固醇血症。 贝斯他汀（以贝斯他汀甲酯，BME的形式）是一种特异性的锌离子结合氨肽酶抑制剂。它能抑制细胞增殖并诱导正常细胞和癌细胞凋亡。贝斯他汀目前用于治疗急性粒细胞白血病和肺鳞状细胞癌。未来也可能用于治疗肺腺癌、食管腺癌、绒毛膜癌和宫颈癌。 Bestatin 还具有抗炎特性，能够调节单核细胞和巨噬细胞的细胞因子和趋化因子的产生。 在盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）中，目前仅鉴定出两种锌离子结合氨肽酶：嘌呤霉素敏感的氨肽酶 A 和 B（PsaA 和 PsaB）。PsaA 在生长发育过程中差异表达，其表达受发育形态发生素调控（cAMP 诱导，DIF-1 或 NH₄Cl 抑制）。Bestatin 甲酯特异性地与 PsaA 相互作用并抑制其氨肽酶活性。 PsaA-GFP（主要位于细胞核内）的过表达抑制孢子细胞分化并促使细胞分化为柄细胞，而胞质 PsaA（PsaAΔNLS2-GFP）则促使细胞分化为孢子细胞。 Bestatin治疗模拟了PsaA过表达对孢子分化的影响。 该研究表明PsaA在功能上与Cdk5相关，而bestatin对PsaA的抑制会影响细胞周期进程和分化。[4] Ubenimex是一种新型强效的氨肽酶B和白三烯A4水解酶抑制剂，用于治疗急性髓系白血病。它抑制氨肽酶B、白三烯A4水解酶和氨肽酶N。它是一种具有潜在免疫调节和抗肿瘤活性的二肽。它也被称为Bestatin。 |
| 相关CAS号 |
Bestatin hydrochloride;65391-42-6;Bestatin trifluoroacetate;223763-80-2
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|---|---|
| PubChem CID |
72172
|
| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
|
| 密度 |
1.2±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
604.7±55.0 °C at 760 mmHg
|
| 熔点 |
245 °C (dec.)(lit.)
|
| 闪点 |
319.5±31.5 °C
|
| 蒸汽压 |
0.0±1.8 mmHg at 25°C
|
| 折射率 |
1.557
|
| LogP |
2.64
|
| tPSA |
112.65
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
4
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
5
|
| 可旋转键数目(RBC) |
8
|
| 重原子数目 |
22
|
| 分子复杂度/Complexity |
367
|
| 定义原子立体中心数目 |
3
|
| HS Tariff Code |
2934.99.9001
|
| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。 |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~8.33 mg/mL (~27.01 mM)
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|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 0.83 mg/mL (2.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 8.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 0.83 mg/mL (2.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 8.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 0.83 mg/mL (2.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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463611831
