OXPHOS/oxidative phosphorylation; VLX600 targets mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), specifically inhibiting complexes I, II, and IV of the electron transport chain [2]. It reduces oxygen consumption rate and induces mitochondrial dysfunction [2]. The compound also inhibits mTOR signaling as a downstream effect [2].
VLX600 targets mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS). It is an iron-chelating inhibitor that reduces mitochondrial OXPHOS in tumor cells. This leads to mitochondrial dysfunction and a shift in cellular metabolism toward glycolysis. VLX600 is preferentially active against quiescent cells, such as those found in the core of solid tumors.

VLX600 处理 6 小时后，HCT116 多细胞球体活力降低，随后进行 72 小时无药培养，中心坏死区域在 72-96 小时后出现 [2]。
- VLX600 显著降低了分散的 HCT116 球体细胞的克隆形成能力 [2]。
- VLX600 抑制 HCT116 单层细胞的增殖，在 48 小时后生长停滞，随后细胞数量减少，表明细胞死亡； VLX600 对结肠癌细胞的 IC50 值约为 0.5-2 μM，而永生化细胞的 IC50 值较高（约 5-10 μM）[2]。 - VLX600 对原发性结肠癌患者细胞（n=22）表现出选择性细胞毒性，其敏感性低于体内可达到的血浆浓度[2]。 - VLX600 诱导 HIF-1α 依赖性糖酵解反应，上调与缺氧和糖酵解相关的基因[2]。 - VLX600 诱导自噬，表现为 LC3-II 诱导、自噬体形成（Lysotracker 和 LC3 染色）以及自噬通量增加（氯喹联合治疗进一步增强）[2]。 - VLX600 降低结肠癌细胞的 ATP 水平。 （HCT116、DLD、HT29）但不在永生化 hTERT-RPE1 细胞中[2]。
- VLX600 诱导结肠癌细胞中的 AMPK 磷酸化，但不在永生化细胞中[2]。
- VLX600 (1-6.5 μM) 在克隆形成试验中协同增强 HCT116 球状体细胞对辐射 (4-6 Gy) 的敏感性；单独接受 6 Gy 照射的存活率为 8.13%，而与 VLX600 联合使用则进一步降低了存活率（相互作用比率为 0.30-0.36）[1]。
- VLX600 (1.5-3 μM) 可增加 HCT116 球体中 γ-H2AX（DNA 双链断裂标志物）的表达，其中 3 μM VLX600 + 6 Gy 联合照射在球体中心和边缘均显示出最高的表达[1]。
- VLX600 显示出对球体特有的放射增敏作用；在单层培养中未观察到显著的协同作用[1]。
- VLX600 与伊立替康联合用药在结肠癌细胞中显示出协同作用[2]。
- VLX600 (6 μM) 抑制 HCT116 细胞的耗氧率，表现为短暂升高，随后在 10 小时内下降约 50%[2]。
- VLX600 在 3 小时内将球状体缺氧分数（匹莫尼达唑染色）从 63±13% 降低至 32±4%[2]。
- VLX600 降低单层和球状体培养中 COX-1（线粒体复合物 IV 亚基）的表达[2]。
- VLX600 诱导具有凋亡特征（caspase 激活）的细胞死亡，但 caspase 对细胞总体存活率没有影响。抑制剂提示存在一种不依赖于细胞凋亡的机制[2]。
- VLX600的细胞毒性在葡萄糖饥饿条件下增强[2]。

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VLX600（6 μM；72 小时）促进自噬反应[2]。VLX600对HCT116球体具有细胞毒性。VLX600诱导HIF-1α依赖性糖酵解。VLX600抑制HCT116细胞的耗氧量。VLX600通过一种不依赖于HIF-1α的机制抑制mTOR下游效应因子4EBP1和p70-S6K的磷酸化。VLX600优先降低癌细胞而非正常细胞中的ATP水平[2]。
体外实验表明，在营养匮乏条件下，VLX600的细胞毒活性增强。在HCT116结肠癌多细胞球体（MCS）中，VLX600导致中心坏死区域的出现，诱导caspase-3活化，并显著降低分散细胞的克隆形成能力。它对结肠癌三维微组织中的静止细胞具有优先活性（低微摩尔活性）。VLX600可触发线粒体功能障碍并诱导自噬。

静脉注射最大耐受剂量（16 mg/kg）的VLX600在HCT116和HT29结肠癌异种移植模型中均显示出抗肿瘤活性[2]。
- 在HCT116异种移植瘤中，VLX600治疗导致Ki67标记指数降低，与肿瘤生长停滞一致，并且在肿瘤切片中观察到大的细胞质囊泡（自溶酶体）[2]。
- 在原位结肠癌模型（将HT29-LUC细胞注射到盲肠壁）中，VLX600（8 mg/kg，每隔一天给药一次，共5个疗程）与伊立替康（45 mg/kg，间隔4天给药一次，共2个疗程）联合治疗可将生物发光信号的中位数降低至载体对照组的约10%（P < 0.05）[2]。 VLX600 治疗显示出极低的全身毒性，未造成体重减轻，且血浆参数（肝丙氨酸氨基转移酶、血糖、总蛋白）无明显变化或仅有轻微变化[2]。在人肿瘤异种移植模型中，VLX600（16 mg/kg；静脉注射；每三天一次，持续16天）显示出抗癌疗效[2]。体内实验表明，VLX600 可抑制肿瘤生长。它是一种铁螯合氧化磷酸化抑制剂，已在临床前模型中显示出抗癌活性。其靶向静止期癌细胞的能力使其成为克服传统化疗耐药性的潜在有效药物。

使用克拉克型电极测量耗氧率：将细胞用胰蛋白酶消化，重悬于培养基中，并置于呼吸室中。监测基础呼吸3-4分钟。在寡霉素（1 μg/mL）存在下测量状态4呼吸，寡霉素可阻断线粒体ATP合酶。在羰基氰化物间氯苯腙（3 μM）存在下评估解偶联呼吸[2]。
- Seahorse XF分析仪测量：将细胞接种于XF24孔细胞板中，并用培养基培养。测量前，将培养基更换为含有1 mM丙酮酸和25 mM葡萄糖的Seahorse检测培养基，并在37°C、无CO2条件下培养1小时。使用 XF24 细胞外通量分析仪 [2] 测定耗氧率值。
- 透化细胞中的电子流分析：在含有 140 mM KCl、5 mM KH₂PO₄、1 mM MgCl₂、1 mM ADP 和 5 mM Tris (pH 7.2) 的缓冲液中，于 37°C 下用洋地黄皂苷 (6 mg/10⁶ 个细胞) 透化细胞。底物和抑制剂的使用浓度如下：苹果酸、丙酮酸和琥珀酸均为 5 mM；鱼藤酮 1 μM；丙二酸 10 mM；抗霉素 A 1 μM；抗坏血酸 5 mM；以及浓度为 0.5 mM 的 N,N,N′,N′-四甲基-1,4-苯二胺 [2]。
- ATP 测定：将细胞（每孔 10,000 个）接种于 96 孔板中，并用 VLX600 处理 24 或 48 小时。使用 ATP 测定试剂盒测定 ATP 含量 [2]。
- 乳酸生成测定：将细胞（300,000 个）接种于 6 孔板中，并用 VLX600 处理 24 小时。收集上清液，并使用乳酸测定试剂盒测定乳酸浓度 [2]。
- 球状体中葡萄糖的测定：用胰蛋白酶消化球状体，用 PBS 洗涤，并计数细胞。细胞经三次冻融循环裂解后，取上清液，使用葡萄糖检测试剂盒测定葡萄糖浓度[2]。
VLX600的活性可通过无细胞检测方法评估其铁螯合能力。该化合物对线粒体呼吸的影响可通过耗氧率（OCR）检测进行评估。其抑制氧化磷酸化（OXPHOS）的能力可通过测量ATP生成或线粒体膜电位进行评估。

多细胞球体活力检测（酸性磷酸酶法）：将10,000个细胞接种于聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）包被的96孔板中，加入过量培养基（170 μL）以形成凸面，将孔板倒置24小时，然后恢复原位并继续培养4天。将球体暴露于药物中6小时，洗涤后继续培养66小时。细胞活力测定方法为：将球状体在 100 μL 含有 0.1% Triton X-100 和对硝基苯磷酸酯的 0.1 M 乙酸钠溶液中裂解，于 37°C 孵育 2 小时，加入 NaOH，并在 405 nm 处测量吸光度 [2]。
- 单层细胞荧光微培养细胞毒性试验 (FMCA)：将细胞（384 孔板，每孔 1000 个细胞）预培养过夜，然后使用声波液体处理仪加入药物。孵育 7 天后，移除培养基，用 PBS 洗涤细胞，加入荧光素二乙酸酯缓冲液和溶液，于 37°C 孵育 50-70 分钟，并使用扫描荧光计测量荧光强度。存活指数定义为测试孔中荧光强度占未暴露对照孔荧光强度的百分比（扣除空白对照孔的荧光强度）[1][2]。
- 球状体荧光强度测定 (FMCA)：球状体实验结束后，移除培养基，加入 Accumax (50 μL/孔) 并在 37°C 下孵育 30 分钟使球状体解离，然后用多功能移液器进一步解离。FMCA 的步骤与单层细胞相同 [1]。
- 球状体 GFP 检测：使用高内涵筛选阅读器每 24 小时测量一次 HCT116 GFP 细胞的荧光信号。计算平均球状体荧光强度，并用于确定 AUTO SI（实验孔中球状体荧光强度占 7 天前加药前相同孔荧光强度的百分比）[1]。
- 单层细胞 GFP 检测：使用活细胞分析系统测量 HCT116 GFP 细胞的荧光信号。每个孔采集一张图像，绿色物体的汇合度作为荧光强度的指标，用于计算存活指数[1]。
- 球状体克隆形成实验：辐射后约20小时，使用Accumax（50 μL/孔，37°C，30分钟）将球状体解离成单细胞。离心培养板，去除Accumax，加入50 μL新鲜培养基。混匀后，将每个孔中20 μL细胞悬液与3 mL新鲜培养基一起转移至6孔板中，培养10天。用6%戊二醛和0.5%结晶紫固定和染色30分钟，冲洗，干燥，并计数克隆。存活率定义为菌落数占未照射对照孔的百分比[1]。
- 单层细胞克隆形成实验：辐射后约20小时，从384孔板的每个孔中取出40 μL培养基，加入50 μL Accumax，37°C孵育10分钟，混匀，离心，去除Accumax，加入50 μL新鲜培养基。混匀后，取20 μL细胞悬液转移至装有3 mL新鲜培养基的试管中，然后转移至6孔板中，培养10天。固定、染色和菌落计数方法同上[1]。
- 蛋白质印迹：将细胞提取物蛋白通过Tris-乙酸PAGE凝胶电泳分离，然后转移至PVDF膜上。将膜与一抗（HIF-1α 1:200，β-actin 1:10,000，LC3 1:1,000，BNIP3 1:500，AMPK 1:1,000，磷酸化AMPK 1:2,000，COX-1 1:1,000，COX-IV 1:1,000，VDAC 1:1,000，p70 1:1,000，磷酸化p70 1:1,000，eIF2-α 1:200，磷酸化eIF2-α 1:200，caspase-4 1:1,000，4EBP1 1:1,000，磷酸化4EBP1 1:1,000，p62 1:400）孵育过夜，洗涤后，与HRP标记的二抗孵育。孵育1小时后，使用化学发光底物显色[2]。
- 球状体的免疫组织化学：将球状体固定于2%中性缓冲福尔马林溶液中，脱水，石蜡包埋，切片。切片脱蜡、复水、微波处理后，与一抗（Ki67 1:400，活性caspase-3 1:200，Bip/Grp78 1:200，HIF-1α）孵育过夜，并使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术进行显色。复染采用Mayer苏木素[2]。
- 细胞凋亡ELISA（M30 CytoDeath）：药物处理后，向培养基中加入NP40至终浓度为0.1%，以从球状体中提取caspase切割的K18。使用 25 μL 培养基/提取物通过 ELISA 测定半胱天冬酶裂解的角蛋白-18 (K18-Asp396) [2]。
- 自噬检测（Lysotracker 和 LC3 染色）：用 6 μM VLX600 处理 42 小时后，用 LysoTracker Red DND-99 对酸性液泡进行染色，然后洗涤，并在含有 3.7% 甲醛的固定液中用 10 μM Hoechst 33342 对细胞核进行染色。使用高内涵筛选阅读器和专用试剂盒分析LC3B酸性液泡[2]。
- ROS检测：使用二氢乙锭探针和Hoechst 33342研究氧化应激。将细胞暴露于VLX600 24小时，每个孔至少采集1000个细胞的图像[2]。
- 患者原代细胞活力检测：将结直肠癌患者的肿瘤细胞（每个孔5000个细胞，重复两次）接种于预先配制药物的384孔板中，并在37°C下孵育72小时。用荧光素二乙酸酯孵育40分钟后，通过测量活细胞的荧光强度来分析细胞活力。存活指数定义为测试孔荧光强度除以对照孔荧光强度，减去空白对照，再乘以 100 [2]。

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细胞增殖实验 [2]
细胞类型： HCT116、HT29、SW620、HT8、DLD 和 RKO 细胞
测试浓度： 0.1、1、10、100μM
孵育时间： 72 小时
实验结果： 抑制这些细胞的增殖。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： HCT116 细胞
测试浓度： 6 μM
孵育时间： 72 小时
实验结果： LC3-II 被诱导。
为了评估 VLX600 的细胞效应，在正常或营养匮乏条件下用该化合物处理癌细胞。使用标准检测方法测量细胞活力、增殖和凋亡。通过测量耗氧率 (OCR)、ATP 水平和线粒体膜电位来评估线粒体功能。通过检测 LC3-II 积累或 p62 降解来测量自噬。

皮下异种移植模型：将含有 5×10⁶ 个 HT29 或 HCT116 细胞的 100 μL 细胞悬液皮下注射到 8-10 周龄的雌性 NMRI nu/nu 小鼠的右后侧腹部。当肿瘤体积达到 0.1 mL 时，将小鼠随机分为对照组和治疗组。将 VLX600 溶解于 4.73 mM HCl 中，配制成 0.6 mg/mL 的溶液，并用 0.9% NaCl 稀释。药物经静脉注射给药。测量肿瘤大小[2]。
- 原位结肠癌模型：将 HT29-LUC 人结肠肿瘤细胞（5×10⁶ 个，50 μL）注射到雄性无胸腺裸鼠（每组 9-10 只）的盲肠壁内。肿瘤植入 11 天后，根据肿瘤大小将小鼠随机分为治疗组。 VLX600（8 mg/kg）每隔一天静脉注射一次，共注射五次。伊立替康（45 mg/kg）从第11天开始，间隔4天注射两次。成像时，小鼠腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg），用2-3%异氟烷麻醉，10-12分钟后用CCD相机测量生物发光。光子发射以全身辐射强度测量[2]。
- 电子显微镜组织处理：部分肿瘤用2.5%戊二醛在4℃下固定过夜。切取从中心到外表面的楔形切片。组织用1%四氧化锇后固定，脱水，并包埋于环氧树脂中。制备超薄切片用于透射电镜分析[2]。

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动物/疾病模型： NMRI nu/nu（裸鼠）(HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植瘤) [2]
剂量： 16 mg/kg
给药途径： 静脉注射；每三天一次，持续 16 天
实验结果： 在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植瘤中观察到抗肿瘤活性。
VLX600 的体内研究通常包括给荷瘤小鼠给药。评估该化合物对肿瘤生长、坏死和凋亡的影响。检测肿瘤组织中氧化磷酸化抑制和线粒体功能障碍的生物标志物。

观察到初始血浆浓度约为 100 μM [2]。
该化合物分布迅速，最终以约 4-5 小时的半衰期消除 [2]。
VLX600 的分子式为 C17H15N7，分子量为 317.35，CAS 编号为 327031-55-0。该化合物是一种氧化磷酸化铁螯合抑制剂，可溶于 DMSO 和其他有机溶剂，纯度通常 >98%。

观察到初始血浆浓度约为 100 μM [2]。该化合物分布迅速，最终以约 4-5 小时的半衰期消除 [2]。现有文献中未提供 VLX600 的具体毒理学数据。然而，其作用机制涉及抑制线粒体氧化磷酸化，可能导致正常组织出现剂量依赖性毒性。与所有研究化合物一样，在操作过程中应采取标准安全预防措施。

[1]. A novel tumor spheroid model identifies selective enhancement of radiation by an inhibitor of oxidative phosphorylation. Oncotarget. 2019 Sep 3;10(51):5372-5382.

[2]. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nat Commun. 2014;5:3295.

VLX600 是一种铁螯合氧化磷酸化抑制剂，它是利用 HCT116 结肠癌多细胞球体筛选 10,000 种化合物后发现的，旨在寻找对静止肿瘤细胞群有效的药物 [2]。
- 该化合物具有亲脂性阳离子性质（XlogP 2.85，估计 pKa 3.5），这有利于其渗透到细胞内并在线粒体中积累 [2]。
- VLX600 显示出介于癌细胞和正常细胞之间的治疗窗口：与永生化细胞系（hTERT-RPE1、MCF10A、RPTEC/TERT1、NeHePxHtT）相比，结肠癌细胞的 IC50 值更低 [2]。
- VLX600 的放射增敏作用特异性地存在于 3D 球体培养中，在单层培养中未观察到。研究表明，VLX600 的作用机制是通过抑制氧化磷酸化来降低肿瘤乏氧[1]。
- VLX600 目前正处于实体瘤的 I 期临床开发阶段（ClinicalTrials.gov 注册号：NCT02222363）[1]。
- VLX600 的化学合成：以 7-甲基沙汀和硫代氨基脲为起始原料，经三步反应合成，首先形成环化的 1,2,4-三嗪-3-硫酮衍生物，然后与水合肼反应生成肼中间体，最后与 2-乙酰吡啶反应生成游离碱 VLX600（纯度 >99%）[2]。
- VLX600 与伊立替康联合用药在原位结肠癌模型中显示出协同抗肿瘤作用[2]。

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VLX600 是一种亲脂性阳离子三嗪-吲哚腙化合物，属于线粒体氧化磷酸化 (OxPhos) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。在葡萄糖供应充足的正常细胞和增殖性肿瘤细胞中，VLX600 输注通过抑制 OxPhos，诱导缺氧诱导因子 1-α (HIF-1α) 依赖性代谢途径向糖酵解转变，并增强糖酵解。在这种微环境下，仅靠糖酵解无法产生足够的能量来支持肿瘤细胞生长，从而诱导自噬。在代谢受损的肿瘤微环境中，由于肿瘤微血管化和灌注不良，氧气和葡萄糖供应有限。因此，在这种微环境下生长的肿瘤细胞无法通过增强糖酵解来弥补线粒体功能的下降。这会导致营养物质耗竭、能量产生减少、自噬诱导、肿瘤细胞死亡以及静止期肿瘤细胞增殖抑制。线粒体氧化磷酸化在癌细胞中过度激活，并在促进癌细胞增殖中起着至关重要的作用。
VLX600 是一种铁螯合氧化磷酸化抑制剂，用作研究工具，可诱导线粒体功能障碍、使细胞代谢转向糖酵解并触发自噬。它对静止期癌细胞具有优先活性，并在体内显示出肿瘤生长抑制作用。它尚未获得临床批准。

C17H15N7

317.348

317.138

C, 64.34; H, 4.76; N, 30.90

327031-55-0

327031-55-0;1622945-04-3

6410104

Light yellow to yellow solid powder

2.9

91.7

2

6

3

24

468

0

CC1=C2C(=CC=C1)C3=C(N2)N=C(N/N=C(\C)/C4=CC=CC=N4)N=N3

UQOSBPRTQFFUOA-SRZZPIQSSA-N

InChI=1S/C17H15N7/c1-10-6-5-7-12-14(10)19-16-15(12)22-24-17(20-16)23-21-11(2)13-8-3-4-9-18-13/h3-9H,1-2H3,(H2,19,20,23,24)/b21-11+

6-methyl-N-[(E)-1-pyridin-2-ylethylideneamino]-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indol-3-amine

VLX-600; VLX600; 6-methyl-3-(2-(1-(pyridin-2-yl)ethylidene)hydrazinyl)-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indole; YZO6DG19MG; ...; OxPhos Inhibitor VLX600;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~78.78 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (6.55 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。