OXPHOS/oxidative phosphorylation; VLX600 targets mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), specifically inhibiting complexes I, II, and IV of the electron transport chain [2]. It reduces oxygen consumption rate and induces mitochondrial dysfunction [2]. The compound also inhibits mTOR signaling as a downstream effect [2].

- VLX600 处理HCT116多细胞球体6小时后再在无药培养基中孵育72小时，可降低球体活力，72-96小时后出现中央坏死区域 [2]。
- VLX600 显著降低分散的HCT116球体细胞的克隆形成能力 [2]。
- VLX600 抑制HCT116单层细胞增殖，48小时出现生长阻滞，随后细胞数量减少表明细胞死亡；结肠癌细胞的IC50值约为0.5-2 μM，而永生化细胞的IC50值较高（约5-10 μM）[2]。
- VLX600 对原代结肠癌患者细胞（n=22）显示出选择性细胞毒性，其敏感浓度低于体内可达到的血浆浓度 [2]。
- VLX600 诱导HIF-1α依赖的糖酵解反应，上调与缺氧和糖酵解相关的基因 [2]。
- VLX600 诱导自噬，表现为LC3-II诱导、自噬小体形成（Lysotracker和LC3染色）以及自噬流增加（氯喹联合处理进一步增加）[2]。
- VLX600 降低结肠癌细胞（HCT116、DLD、HT29）的细胞内ATP水平，但在永生化hTERT-RPE1细胞中无此作用 [2]。
- VLX600 在结肠癌细胞中诱导AMPK磷酸化，但在永生化细胞中无此作用 [2]。
- VLX600（1-6.5 μM）在克隆形成实验中协同增敏HCT116球体细胞对放射（4-6 Gy）的敏感性；单独6 Gy照射的存活分数为8.13%，与VLX600联合后存活分数进一步降低（相互作用比0.30-0.36）[1]。
- VLX600（1.5-3 μM）增加HCT116球体中gamma-H2AX表达（DNA双链断裂标志物），3 μM VLX600联合6 Gy照射在球体中心和边缘均显示最高表达 [1]。
- VLX600 的放射增敏作用特异于球体模型；在单层培养物中未观察到显著协同作用 [1]。
- VLX600 与伊立替康联用在结肠癌细胞中显示出协同效应 [2]。
- VLX600（6 μM）抑制HCT116细胞的氧消耗率，出现瞬时增加后在10小时内下降约50% [2]。
- VLX600 在3小时时将球体缺氧分数（吡莫硝唑染色）从63±13%降至32±4% [2]。
- VLX600 降低单层和球体培养物中COX-1（线粒体复合物IV亚基）的表达 [2]。
- VLX600 诱导的细胞死亡具有凋亡特征（caspase激活），但caspase抑制剂不影响总存活率，表明存在非凋亡依赖性机制 [2]。
- 葡萄糖饥饿可增强VLX600的细胞毒性 [2]。

---

VLX600（6 μM；72 小时）促进自噬反应 [2]。 VLX600 对 HCT116 球体具有细胞毒性。 VLX600 诱导 HIF-1α 依赖性糖酵解。 VLX600 抑制 HCT116 细胞的耗氧量。 VLX600 通过 HIF-1α 独立机制抑制 mTOR 下游效应器 4EBP1 和 p70-S6K 的磷酸化。 VLX600 优先导致癌细胞中的 ATP 水平降低，但不会降低正常细胞中的 ATP 水平 [2]。

- VLX600 以最大耐受剂量（16 mg/kg）静脉给药，在HCT116和HT29结肠癌异种移植模型中显示出抗肿瘤活性 [2]。
- 在HCT116异种移植瘤中，VLX600 治疗导致Ki67标记指数降低，与生长阻滞一致，肿瘤切片中观察到大的细胞质囊泡（自噬溶酶体）[2]。
- 在正位结肠癌模型（HT29-LUC细胞注射至盲肠壁）中，VLX600（8 mg/kg，每两天一次，共5个周期）与伊立替康（45 mg/kg，间隔4天，共2个周期）联合治疗将中位生物发光信号降至对照组的约10%（P < 0.05）[2]。
- VLX600 治疗显示出最小的全身毒性，无体重下降，血浆参数（肝丙氨酸氨基转移酶、血糖、总蛋白）无变化或仅有微小变化 [2]。

---

在人类肿瘤异种移植物中，VLX600（16 mg/kg；静脉注射；每三天一次，持续 16 天）显示出抗癌功效 [2]。

- Clark型电极测定氧消耗率： 细胞经胰蛋白酶消化后重悬于培养基中，置于呼吸室中。监测基础呼吸3-4分钟。在寡霉素（1 μg/mL）存在下测量状态4呼吸（寡霉素阻断线粒体ATP合酶）。在羰基氰化物间氯苯腙（3 μM）存在下评估解偶联呼吸 [2]。
- Seahorse XF分析仪测定： 细胞接种于XF24孔细胞板的培养基中。测定前，将培养基更换为含1 mM丙酮酸和25 mM葡萄糖的Seahorse测定培养基，在37°C无CO2条件下孵育1小时。使用XF24细胞外通量分析仪测量氧消耗率值 [2]。
- 透化细胞中的电子流分析： 细胞用毛地黄皂苷（6 mg/10⁶细胞）在含140 mM KCl、5 mM KH₂PO₄、1 mM MgCl₂、1 mM ADP和5 mM Tris（pH 7.2）的缓冲液中于37°C透化。底物和抑制剂的浓度如下：苹果酸、丙酮酸和琥珀酸各5 mM；鱼藤酮1 μM；丙二酸10 mM；抗霉素A 1 μM；抗坏血酸5 mM；N,N,N′,N′-四甲基-1,4-苯二胺0.5 mM [2]。
- ATP测定： 细胞（10,000/孔）接种于96孔板，暴露于VLX600 24或48小时。使用ATP测定试剂盒测量ATP [2]。
- 乳酸产量测定： 细胞（300,000）接种于6孔板，暴露于VLX600 24小时。收集上清液，使用乳酸测定试剂盒测量乳酸浓度 [2]。
- 球体葡萄糖测定： 球体经胰蛋白酶消化，PBS洗涤，计数细胞。通过三次冻融循环裂解细胞，上清液用于使用葡萄糖测定试剂盒测量葡萄糖浓度 [2]。

- 多细胞球体活力测定（酸性磷酸酶法）： 球体制备：每孔10,000个细胞接种于poly-HEMA包被的96孔板，加入过量培养基（170 μL）形成凸面，倒置培养24小时，然后恢复正常位置继续培养4天。球体暴露于药物6小时，洗涤，再孵育66小时。通过将球体裂解于100 μL含0.1% Triton X-100和p-硝基苯磷酸的0.1 M乙酸钠中，37°C孵育2小时，加入NaOH，测定405 nm吸光度来评估活力 [2]。
- 单层细胞荧光微量培养细胞毒性测定： 细胞（1,000/孔于384孔板）预孵育过夜，使用声波液体处理器加入药物。孵育7天后，移除培养基，PBS洗涤细胞，加入荧光素二乙酸酯缓冲液和溶液，37°C孵育50-70分钟，使用扫描荧光计测量荧光。存活指数定义为测试孔荧光占未处理对照孔荧光的百分比（扣除空白）[1][2]。
- 球体FMCA测定： 球体实验后，移除培养基，加入Accumax（50 μL/孔）于37°C孵育30分钟解离球体，然后用多道移液器吹打解离。后续FMCA步骤与单层细胞相同 [1]。
- 球体GFP测定： 使用高内涵筛选读取器每24小时测量HCT116 GFP细胞的荧光信号。计算平均球体荧光，用于确定AUTO SI（实验孔球体荧光占7天前加药前同一孔荧光的百分比）[1]。
- 单层细胞GFP测定： 使用活细胞分析系统测量HCT116 GFP细胞的荧光信号。每孔采集一张图像，使用绿色物体融合度作为荧光度量以计算存活指数 [1]。
- 球体克隆形成实验： 放射后约20小时，使用Accumax（50 μL/孔，37°C 30分钟）将球体解离为单细胞。离心板，移除Accumax，加入50 μL新鲜培养基。混匀后，每孔取20 μL细胞悬液与3 mL新鲜培养基一起转移至6孔板，孵育10天。细胞用6%戊二醛和0.5%结晶紫固定染色30分钟，冲洗，干燥，计数克隆。存活分数定义为克隆数占未处理对照孔克隆数的百分比 [1]。
- 单层细胞克隆形成实验： 放射后约20小时，从384孔板每孔移除40 μL培养基，加入50 μL Accumax，37°C孵育10分钟，混匀，离心，移除Accumax，加入50 μL新鲜培养基。混匀后，每孔取20 μL细胞悬液转移至含3 mL新鲜培养基的管中，再转移至6孔板，孵育10天。固定、染色和克隆计数同上 [1]。
- Western blotting： 细胞提取蛋白通过Tris-乙酸酯PAGE胶分离，转移至PVDF膜。膜与一抗孵育过夜（HIF-1α 1:200，β-actin 1:10,000，LC3 1:1,000，BNIP3 1:500，AMPK 1:1,000，phospho-AMPK 1:2,000，COX-1 1:1,000，COX-IV 1:1,000，VDAC 1:1,000，p70 1:1,000，phospho-p70 1:1,000，eIF2-α 1:200，phospho-eIF2-α 1:200，caspase-4 1:1,000，4EBP1 1:1,000，phospho-4EBP1 1:1,000，p62 1:400），洗涤，与HRP标记的二抗孵育1小时，使用化学发光底物显色 [2]。
- 球体免疫组织化学： 球体用2%缓冲福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切片。切片脱蜡，复水，微波处理，然后与一抗（Ki67 1:400，active caspase-3 1:200，Bip/Grp78 1:200，HIF-1α）孵育过夜，使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术显色。用Mayer苏木精复染 [2]。
- 凋亡ELISA（M30 CytoDeath）： 药物暴露后，向培养基中加入NP40至0.1%，提取球体中caspase切割的K18。使用25 μL培养基/提取物通过ELISA测定caspase切割的角蛋白-18（K18-Asp396）[2]。
- 自噬检测（Lysotracker和LC3染色）： 用6 μM VLX600处理42小时后，使用LysoTracker Red DND-99染色酸性囊泡，然后洗涤，用含3.7%甲醛的固定液中的10 μM Hoechst 33342染色细胞核。使用高内涵筛选读取器和专用试剂盒分析LC3B酸性囊泡 [2]。
- ROS检测： 使用二氢乙锭探针和Hoechst 33342研究氧化应激。细胞暴露于VLX600 24小时，每孔采集至少1,000个细胞的图像 [2]。
- 患者原代细胞活力测定： 结直肠癌患者的肿瘤细胞（5,000细胞/孔，双复孔）接种于预先加药的384孔板，37°C孵育72小时。细胞活力通过荧光素二乙酸酯孵育40分钟后测量活细胞荧光进行分析。存活指数定义为测试孔荧光除以对照孔荧光（扣除空白）乘以100 [2]。

---

细胞增殖实验[2]
细胞类型： HCT116、HT29、SW620、HT8、DLD 和 RKO 细胞
测试浓度： 0.1、1、10、 100μM
孵育持续时间：72小时
实验结果：抑制这些细胞的增殖。

---

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： HCT116 细胞
测试浓度： 6 μM
孵育时间：72小时
实验结果：LC3-II被诱导。

- 皮下异种移植模型： 雌性NMRI nu/nu小鼠（8-10周龄）右侧后 flank 皮下注射含5×10⁶ HT29或HCT116细胞的100 μL细胞悬液。当肿瘤体积达0.1 mL时，将小鼠随机分为对照组或治疗组。VLX600 溶于4.73 mM HCl至0.6 mg/mL，用0.9% NaCl稀释。药物静脉注射给药。测量肿瘤大小 [2]。
- 正位结肠癌模型： HT29-LUC人结肠肿瘤细胞（5×10⁶于50 μL中）注射至雄性无胸腺裸鼠的盲肠壁（每组9-10只动物）。肿瘤植入后11天，将小鼠按大小排序分组。VLX600（8 mg/kg）每两天一次静脉注射，共5次。伊立替康（45 mg/kg）从第11天开始间隔4天注射2次。成像时，小鼠腹腔注射D-荧光素（150 mg/kg），在2-3%异氟烷中麻醉，10-12分钟后使用CCD相机测量生物发光。光子发射测量为全身辐射亮度 [2]。
- 电子显微镜组织处理： 部分肿瘤用2.5%戊二醛在4°C固定过夜。从中心到外表面切取楔形切片。组织在1%四氧化锇中后固定，脱水，环氧树脂包埋。制备超薄切片用于透射电子显微镜分析 [2]。

---

动物/疾病模型： NMRI nu/nu（裸鼠）(HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植瘤) [2]
剂量： 16 mg/kg
给药途径： 静脉注射；每三天一次，持续 16 天
实验结果： 在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植瘤中观察到抗肿瘤活性。

- 在NMRI小鼠中以最大耐受剂量16 mg/kg静脉给药后，初始血浆浓度约为100 μM [2]。
- 该化合物快速分布，最终消除半衰期约为4-5小时 [2]。

- VLX600 在最大耐受剂量（16 mg/kg）下对小鼠显示最小的全身毒性，无体重下降，血浆参数（包括肝丙氨酸氨基转移酶、血糖和总蛋白）无变化或仅有微小变化 [2]。
- VLX600 在非增殖的汇合hTERT-RPE1细胞中未诱导可检测的细胞毒性 [2]。
- 在原代细胞中，VLX600 对癌细胞相较于永生化正常细胞显示出选择性活性 [2]。

[1]. A novel tumor spheroid model identifies selective enhancement of radiation by an inhibitor of oxidative phosphorylation. Oncotarget. 2019 Sep 3;10(51):5372-5382.

[2]. Induction of mitochondrial dysfunction as a strategy for targeting tumour cells in metabolically compromised microenvironments. Nat Commun. 2014;5:3295.

- VLX600 是一种铁螯合氧化磷酸化抑制剂，通过对约10,000个化合物进行高通量筛选，使用HCT116结肠癌多细胞球体模型鉴定得出，旨在寻找针对静止肿瘤细胞群的活性药物 [2]。
- 该化合物具有亲脂性阳离子性质（XlogP 2.85，预估pKa 3.5），有利于穿透细胞并在线粒体中积累 [2]。
- VLX600 在癌细胞和正常细胞之间显示出治疗窗口：结肠癌细胞的IC50值低于永生化细胞系（hTERT-RPE1、MCF10A、RPTEC/TERT1、NeHePxHtT）[2]。
- VLX600 的放射增敏作用特异于3D球体培养物，在单层培养物中未观察到，表明其通过抑制氧化磷酸化减少肿瘤缺氧发挥作用 [1]。
- VLX600 目前正在进行针对实体瘤的I期临床开发（ClinicalTrials.gov标识号：NCT02222363）[1]。
- VLX600 化学合成：以7-甲基靛红和氨基硫脲为起始原料，经三步合成。形成环化的1,2,4-三嗪-3-硫酮衍生物，然后与水合肼反应得到肼中间体，最后与2-乙酰吡啶反应得到VLX600游离碱（纯度>99%）[2]。
- VLX600 与伊立替康联用在正位结肠癌模型中显示出协同抗肿瘤效应 [2]。

---

VLX600 是一种亲脂性阳离子型三嗪并吲哚腙化合物，属于线粒体氧化磷酸化 (OxPhos) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。在葡萄糖供应充足的正常细胞和增殖性肿瘤细胞中，VLX600 输注后，通过抑制 OxPhos，诱导缺氧诱导因子 1-α (HIF-1α) 依赖性的代谢途径向糖酵解转变并增强糖酵解。在这种微环境下，仅靠糖酵解无法产生足够的能量来支持肿瘤细胞的生长，因此会诱导自噬。在代谢受损的肿瘤微环境中，由于肿瘤微区血管化和灌注不良，氧气和葡萄糖的供应有限。因此，在这种微环境下生长的肿瘤细胞无法通过增强糖酵解来补偿线粒体功能的下降。这会导致营养物质耗竭、能量产生减少、自噬诱导、肿瘤细胞死亡以及静止期肿瘤细胞增殖抑制。线粒体氧化磷酸化在癌细胞中过度激活，在促进癌细胞增殖中起着关键作用。

C17H15N7

317.348

317.138

C, 64.34; H, 4.76; N, 30.90

327031-55-0

327031-55-0;1622945-04-3

6410104

Light yellow to yellow solid powder

2.9

91.7

2

6

3

24

468

0

CC1=C2C(=CC=C1)C3=C(N2)N=C(N/N=C(\C)/C4=CC=CC=N4)N=N3

UQOSBPRTQFFUOA-SRZZPIQSSA-N

InChI=1S/C17H15N7/c1-10-6-5-7-12-14(10)19-16-15(12)22-24-17(20-16)23-21-11(2)13-8-3-4-9-18-13/h3-9H,1-2H3,(H2,19,20,23,24)/b21-11+

6-methyl-N-[(E)-1-pyridin-2-ylethylideneamino]-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indol-3-amine

VLX-600; VLX600; 6-methyl-3-(2-(1-(pyridin-2-yl)ethylidene)hydrazinyl)-5H-[1,2,4]triazino[5,6-b]indole; YZO6DG19MG; ...; OxPhos Inhibitor VLX600;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 该产品在溶液状态不稳定，请现配现用。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~78.78 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (6.55 mM) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。