WHI-P258

Bcl-W (Ki = 1 nM); Bcl-xL (Ki = 1 nM); Bcl-2 (Ki = 1 nM)

WHI-P258 是通过同源建模发现的一种有效的选择性 Janus 激酶 3 (JAK3) 抑制剂。急性淋巴细胞白血病是最常见的儿童癌症类型，可能是使用有效的靶向 JAK3 抑制剂（如 WHI-P131）的新型治疗方法的目标。为了创建对 JAK3 具有有效且精确的抑制活性的二甲氧基喹唑啉化合物，使用了 Janus 激酶 (JAK) 3 激酶结构域的新型同源模型。该模型导致了 WHI-P258 的鉴定。该同源模型中可用于抑制剂结合的体积约为 530 A3，JAK3 的活性位点尺寸约为 8 A x 11 A x 20 A。建模研究表明，WHI-258 可能适合 JAK3 的催化位点并且在苯环 4' 位置含有 OH 基团的该物质的衍生物将更牢固地与 JAK3 结合，因为增加了与 Asp-967（JAK3 催化位点中的关键残基）的相互作用。

使用甲基纤维素集落测定系统，评估了 WHI-P131 针对克隆肿瘤细胞的抗白血病活性。将各种浓度的 WHI-P131 在 37°C 下应用于细胞（RPMI-10% 胎牛血清中 105 个细胞/ml）过夜。处理后，将细胞洗涤两次，以 104 或 105 个细胞/ml 的浓度铺在 RPMI、10% 胎牛血清和 0.9% 甲基纤维素的培养皿中，并在湿润的 5% CO2 培养箱中于 37°C 培养 7 天。然后，使用相差倒置显微镜计数白血病细胞（或肿瘤细胞）集落的数量。该公式用于确定集落形成的抑制百分比。

Sf21 (IPLB-SF21-AE) 细胞购自 Invitrogen (Carlsbad, CA)，并在补充有 10% 胎牛血清和 1.0% 抗生素/抗真菌剂 (Life Technologies, Inc) 的 Grace 昆虫细胞培养基中维持在 26–28°C .)。这些细胞来源于草地贪夜蛾的卵巢组织。库存细胞以 60-90 rpm 的转速悬浮在 1 升 Bellco 旋转烧瓶中，总培养体积为 600 ml，浓度为 0.2 × 106–1.6 × 106 个细胞/ml。使用台盼蓝染料排除法来测量细胞活力，其保持在 95% 至 100% 之间。根据之前的报道，将 BTK、SYK、JAK1、JAK2 或 JAK3 的杆状病毒表达载体引入 Sf21 细胞中。收获并裂解细胞 [10 mm Tris (pH 7.6)、100 mm NaCl、1% NP40、10% 甘油、50 mmNaF、100 μm Na3VO4、50 μg/ml 苯甲基磺酰氟、10 μg/ml 质子素和 10 μg/ ml 亮肽素]，从裂解物中免疫沉淀激酶，并测定其酶活性，如先前报道的。如前所述，对免疫沉淀物进行蛋白质印迹分析。 HepG2 人肝癌细胞生长至约 80% 汇合，然后用无血清 DMEM 洗涤一次，并在 CO2 培养箱中于 37°C 饥饿 3 小时以进行 IRK 测定。之后，用胰岛素（Eli Lilly and Co.，Indianapolis，IN；10 单位/ml，10 × 106 个细胞）在室温下刺激细胞 10 分钟。 IRK 激活步骤后，用无血清培养基洗涤细胞一次，在 NP40 缓冲液中裂解，然后使用抗 IRβ 抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA；多克隆 IgG）从裂解物中免疫沉淀 IRK。在运行免疫复合物激酶测定之前，我们用激酶缓冲液 [30 mm HEPES (pH 7.4)、30 mm NaCl、8 mm MgCl2 和 4 mm MnCl2] 调整珠子。如先前报道，NALM-6 人白血病细胞的全细胞裂解物用于生产 LYN。在 JAK3 免疫复合物激酶测定中，KL-2 EBV 转化的人淋巴母细胞 B 细胞（天然 JAK3 激酶测定）或昆虫卵巢细胞（重组 JAK3 激酶测定）用 NP40 裂解缓冲液 [50 mm Tris (pH 8), 150 mm氯化钠、5 mm EDTA、1% NP40、100 μm 原钒酸钠、100 μm 钼酸钠、8 μg/ml 抑肽酶、5 μg/ml 亮抑肽酶和 500 μm 苯甲基磺酰氟]并在 13,000 × g 下离心 10 分钟以除去不溶物质。使用 JAK3 特异性抗体对样品进行免疫沉淀。抗血清稀释后，与 15 μl Protein A-Sepharose 一起孵育，获得免疫复合物。将蛋白 A-Sepharose 珠子用 NP40 裂解缓冲液洗涤四次，然后用激酶缓冲液 (20 mm MOPS (pH 7)-10 mm MgCl2) 洗涤一次，然后重悬于相同的缓冲液中。添加25 μCi的[γ-32P]ATP (5000 Ci/mmol)和未标记的ATP至终浓度5 μm以开始反应。在 SDS 样品缓冲液中煮沸 4 分钟以终止反应。样品在 9.5% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上运行后，使用放射自显影技术发现了标记的蛋白质。将激酶凝胶进行电泳，在 Whatman 3M 滤纸上干燥，然后在分子成像仪（Bio-Rad，Hercules，CA）上进行磷光成像并在胶片上进行放射自显影。将磷光成像仪单位中的激酶活性与对照样品的激酶活性进行比较，以产生每个药物浓度的激酶活性指数。如前所述，在一些实验中进行了冷激酶测定。

以下细胞系用于各种生物学测定：BT-20（乳腺癌）、M24-MET（黑色素瘤）、SQ20B（鳞状细胞癌）、NALM-6（B-ALL 前）、LC1;19（B-ALL 前） B-ALL)、DAUDI (B-ALL)、RAMOS (B-ALL)、MOLT-3（T 细胞 ALL）和 PC3（前列腺癌）。正如之前报道的，这些细胞系维持在培养物中。在含有不同浓度 WHI-P131 的处理培养基中，将细胞以 50 × 104 个细胞/孔的密度接种在六孔组织培养板中，并在 37°C、湿润的 5% CO2 气氛中孵育 24-48 小时。

[1]. Structure-based design of specific inhibitors of Janus kinase 3 as apoptosis-inducing antileukemic agents. Clin Cancer Res. 1999 Jun;5(6):1569-82.

[2]. Role of a JAK3-dependent biochemical signaling pathway in platelet activation and aggregation. J Biol Chem. 2001 May 25;276(21):17815-22.

C16H15N3O2

281.32

281.12

C, 68.31; H, 5.37; N, 14.94; O, 11.37

21561-09-1

Solid powder

COC1=C(C=C2C(=C1)C(=NC=N2)NC3=CC=CC=C3)OC

MJKCGAHOCZLYDG-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H15N3O2/c1-20-14-8-12-13(9-15(14)21-2)17-10-18-16(12)19-11-6-4-3-5-7-11/h3-10H,1-2H3,(H,17,18,19)

6,7-dimethoxy-N-phenylquinazolin-4-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (8.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 22.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (8.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 22.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (8.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 22.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。