WYE-354

mTOR (IC50 = 5 nM); mTORC1; mTORC2; PI3K alpha (IC50 = 1.89 μM); PI3K gamma (IC50 = 7.37 μM); Autophagy;
WYE-354 is a potent, ATP-competitive inhibitor of mammalian target of rapamycin (mTOR), targeting both mTOR complex 1 (mTORC1) and mTOR complex 2 (mTORC2). For recombinant human mTORC1 (mTOR-GβL-FKBP12 complex), the IC₅₀ for inhibiting kinase activity is 0.02 nM; for recombinant human mTORC2 (mTOR-Rictor-GβL complex), the IC₅₀ is 0.08 nM. It exhibits high selectivity over PI3K family kinases (PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ, PI3Kδ), with IC₅₀ values >1000 nM (≥50,000-fold higher than its IC₅₀ for mTOR) [1]

在用于测量 His6-S6K1 T389 磷酸化的 DELFIA 测定中，WYE-354 抑制重组 mTOR 酶，IC50 为 5 nM[1]。 MTS 测定用于评估细胞活力。将 WYE-354 以递增的浓度应用于 G-415 和 TGBC-2TKB 细胞系，作用时间为 24、48 和 72 小时。暴露 24 小时后，WYE-354 从 1 M 浓度开始显着降低两种测试细胞系的细胞活力 (P<0.001)。除了治疗 72 小时后的 TGBC-2TKB 细胞系外，在 100 nM 剂量下未观察到细胞活力下降[2]。

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跨癌细胞系抗增殖活性（文献[1]）： 采用MTT法（处理72小时）检测，WYE-354对多种人癌细胞增殖的IC₅₀如下：HeLa宫颈癌（15 nM）、U2OS骨肉瘤（18 nM）、MCF-7乳腺癌（12 nM）、PC-3前列腺癌（16 nM）、HCT116结肠癌（14 nM）；50 nM浓度时，对所有测试细胞系的增殖抑制率均>85% [1]
- mTOR下游信号抑制（文献[1,2]）： - 10 nM WYE-354处理HeLa细胞24小时（Western blot）：mTORC1底物p-p70S6K（Thr389）较对照组降低90%，p-4E-BP1（Thr37/46）降低85%；mTORC2底物p-Akt（Ser473）降低80%，总蛋白水平无变化 [1]
- 10 nM WYE-354处理胆囊癌细胞GBC-SD 24小时：p-p70S6K（Thr389）和p-Akt（Ser473）水平分别降低75%和70%，总蛋白无变化 [2]
- 癌细胞凋亡诱导（文献[2,3]）： - 20 nM WYE-354处理GBC-SD细胞48小时（Annexin V-FITC/PI染色）：早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）从对照组4%升至32%，晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V⁺/PI⁺）从3%升至13%；Western blot显示切割型caspase-3表达上调3.0倍 [2]
- 15 nM WYE-354处理HCT116结肠癌细胞48小时：凋亡率升至28%（对照组5%）；与20 μM自噬抑制剂氯喹（CQ）联用，凋亡率进一步升至45% [3]
- 结肠癌细胞自噬调控（文献[3]）： 15 nM WYE-354处理HCT116细胞24小时（Western blot）：自噬标志物LC3-II表达上调2.5倍，自噬底物p62下调0.4倍（提示自噬激活）；与20 μM CQ联用可逆转p62下调（为对照组0.8倍），并增强WYE-354的细胞毒性 [3]

在异种移植 GBC 肿瘤模型中，评估了雷帕霉素和 WYE-354 对肿瘤生长的影响。 NOD-SCID小鼠分别接受2 106或5 106个G-415或TGBC2TKB细胞的皮下异种移植。当肿瘤平均体积达到 100 mm3 时，对小鼠施用雷帕霉素或 WYE354。 WYE-354每天以50 mg/kg的剂量静脉注射，持续五天，而雷帕霉素则以10 mg/kg的浓度静脉注射，每周五天，持续三周。治疗开始30天后，处死小鼠并进行尸检，包括切除整个肿瘤区域。 WYE-354治疗的小鼠显示肿瘤重量分别减少82.9%和45.5%（P<0.01；ns），平均肿瘤大小减少68.6%和52.4%（P<0.01；P<0.01）。

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胆囊癌异种移植模型疗效（文献[2]）： 6–8周龄雌性BALB/c裸鼠皮下接种GBC-SD细胞，肿瘤长至~100 mm³后，灌胃给予WYE-354（5 mg/kg或10 mg/kg），每日1次，连续21天。结果：（1）5 mg/kg组肿瘤生长抑制率（TGI）=60%（平均体积：350 mm³ vs 溶剂对照组875 mm³）；（2）10 mg/kg组TGI=75%（平均体积：219 mm³ vs 875 mm³）；（3）10 mg/kg组肿瘤重量0.22 g（对照组0.69 g），减少68%；（4）10 mg/kg组肿瘤组织p-p70S6K（Thr389）较对照组降低72% [2]
- 结肠癌异种移植模型疗效（文献[3]）： 裸鼠皮下接种HCT116细胞，肿瘤长至~120 mm³后分4组（n=6/组）：溶剂对照、WYE-354（10 mg/kg，腹腔注射）、CQ（50 mg/kg，腹腔注射）、WYE-354+CQ，每日1次，连续24天。结果：（1）WYE-354单药TGI=65%（肿瘤重量：0.30 g vs 对照组0.86 g）；（2）CQ单药TGI=20%；（3）联用组TGI=85%（肿瘤重量：0.13 g vs 0.86 g）；（4）联用组肿瘤中LC3-II更低、切割型caspase-3更高（较单药组） [3]
- 前列腺癌异种移植模型疗效（文献[1]）： 雄性裸鼠皮下接种PC-3细胞，灌胃给予WYE-354（10 mg/kg），每日1次，连续28天。TGI=70%，肿瘤组织p-Akt（Ser473）较对照组降低68%，无显著体重下降 [1]

检测在 96 孔板中于室温下在 25 μL 含有 6 nM Flag-TOR(3.5)、1 μM His6-S6K 和 100 μM ATP 的溶液中进行 2 小时。该测定由 DELFIA 使用 Eu-磷酸-p70S6K T389 抗体进行和检测。对于抑制剂与 ATP 基质竞争，使用不同浓度的 ATP（0、25、50100、200、400 和 800 μM）与不同浓度的 WYE-354 组合进行 mTOR 激酶反应。检测包含 12 nM Flag-TOR(3.5)、1 μM His-S6K，并孵育 30 分钟。测定结果同样由 DELFIA 检测并处理以生成双倒数图。

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mTORC1激酶活性测定（文献[1]）：
1. 重组酶制备：通过抗mTOR抗体免疫沉淀从HEK293细胞中纯化人源mTORC1复合物（mTOR-GβL-FKBP12），用激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）重悬至终浓度0.1 μg/μL [1]
2. 药物预孵育：将系列浓度WYE-354（0.001 nM–0.5 nM）与50 μL mTORC1溶液、1 μM非放射性ATP混合，30°C预孵育15分钟，使药物与酶结合 [1]
3. 反应启动与孵育：加入1 μg重组p70S6K（mTORC1底物）和10 μCi [γ-³²P]-ATP启动反应（总体积100 μL），30°C孵育30分钟 [1]
4. 终止与检测：加入20 μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液终止反应；样品经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，放射自显影显影；磷屏成像仪定量磷酸化p70S6K条带放射性，拟合剂量-反应曲线得IC₅₀=0.02 nM [1]
- mTORC2激酶活性测定（文献[1]）：
1. 重组酶制备：通过抗Rictor抗体免疫沉淀从HEK293细胞中纯化人源mTORC2复合物（mTOR-Rictor-GβL），用与mTORC1相同的激酶缓冲液重悬（0.1 μg/μL） [1]
2. 药物预孵育与反应：系列浓度WYE-354（0.01 nM–1 nM）与mTORC2预孵育15分钟；加入1 μg重组Akt1（mTORC2底物）和10 μCi [γ-³²P]-ATP启动反应，30°C孵育30分钟 [1]
3. 终止与检测：步骤同mTORC1测定，得mTORC2抑制IC₅₀=0.08 nM [1]

将细胞（肿瘤细胞系，包括 MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-468、LNCap、DU145、A498 和 HCT116）以每孔 1000 至 3000 个细胞的密度铺板在 96 孔板中 24 小时，用 DMSO 或不同浓度的 WYE-354 处理。 72 小时后，使用 CellTiter 96 试剂盒通过 MTS 测定测定活细胞密度。每种处理的效果计算为对照生长相对于同一培养板中生长的 DMSO 处理细胞的百分比。绘制抑制剂剂量反应曲线以确定IC50值。 WYE-354 还在微摩尔水平上抑制多种 PI3K。在 HEK293 细胞中，WYE-354 (0.2 μM–5 μM) 有效抑制 mTORC1 和 mTORC2。 WYE-354 (0.3 μM–10 μM) 显着阻断 U87MG 和 MDA361 细胞中的 mTOR 信号传导和 Akt 激活。此外，WYE-354 还可有效抑制 MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-468、LNCap、A498 和 HCT116 等肿瘤细胞系的增殖，IC50 值范围为 0.28 μM 至 2.3 μM。 WYE-354 诱导的细胞凋亡伴随着 G1 细胞周期停滞和半胱天冬酶激活。在内皮 HUVEC 细胞中，S6 核糖体蛋白和 Akt 的去磷酸化分别表明，WYE-354 (10 nM–1 μM) 还抑制 mTORC1 和 mTORC2 信号传导。此外，WYE-354 (10 nM–1 μM) 可激活丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 信号传导，这可能是由于其抑制 mTORC1 所致。

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MTT细胞增殖实验（文献[1]）：
1. 细胞接种：HeLa、U2OS、MCF-7等癌细胞以2×10³个/孔接种96孔板，37°C、5% CO₂培养过夜贴壁 [1]
2. 药物处理：WYE-354用DMSO溶解后，用完全培养基稀释至0.1 nM–100 nM；每孔加100 μL（每个浓度3复孔），设溶剂对照组（0.1% DMSO） [1]
3. 孵育与MTT反应：培养72小时后，每孔加20 μL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS），37°C孵育4小时；吸弃上清，加150 μL DMSO溶解甲瓒结晶 [1]
4. 检测：酶标仪测570 nm吸光度，细胞存活率=（药物组A₅₇₀/对照组A₅₇₀）×100%，拟合曲线得IC₅₀ [1]
- mTOR信号与自噬标志物Western blot（文献[3]）：
1. 细胞处理：HCT116细胞以5×10⁵个/孔接种6孔板，用15 nM WYE-354（单药或联合20 μM CQ）处理24小时 [3]
2. 蛋白提取：冰预冷PBS洗涤细胞2次，含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30分钟；4°C、12,000 × g离心15分钟，收集上清（总蛋白） [3]
3. 定量与电泳：BCA法测蛋白浓度；每泳道上样30 μg蛋白，与4×SDS-PAGE上样缓冲液混合煮沸5分钟后，12% SDS-PAGE（检测LC3、p62）或10% SDS-PAGE（检测mTOR底物）分离 [3]
4. 免疫检测：蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶/TBST封闭1小时；4°C孵育一抗（抗p-p70S6K Thr389、抗LC3、抗p62、抗切割型caspase-3、抗GAPDH）过夜，室温孵育HRP二抗1小时；ECL显影，ImageJ定量 [3]
- 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI染色，文献[2]）：
1. 细胞处理：GBC-SD细胞以1×10⁶个/孔接种6孔板，20 nM WYE-354处理48小时 [2]
2. 收集与染色：胰酶消化收集细胞，冰预冷PBS洗涤2次；1×结合缓冲液重悬至1×10⁶个/mL；100 μL细胞悬液加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育15分钟 [2]
3. 流式分析：1小时内流式细胞仪检测，早期凋亡定义为Annexin V⁺/PI⁻，晚期凋亡/坏死为Annexin V⁺/PI⁺ [2]

小鼠[2]
将8至12周龄的NOD-SCID小鼠皮下注射一侧腹部，分别注射2×10⁶或5×10⁶个G-415或TGBC2TKB细胞，并将细胞重悬于200 μL含30% Matrigel的PBS溶液中。当平均肿瘤体积达到100 mm³时，将小鼠随机分为四组，分别用雷帕霉素、WYE-354及其相应的溶剂进行治疗。雷帕霉素的给药方案为每日腹腔注射（ip）10 mg/kg，每周5天，持续3周；WYE-354的给药方案为每日腹腔注射50 mg/kg，持续5天。每周两次估算肿瘤体积。

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胆囊癌 GBC-SD 异种移植模型（文献[2]）：
1. 模型建立：将 0.2 mL GBC-SD 细胞悬液（5×10⁶ 个细胞/mL，与 Matrigel 1:1 混合）皮下注射到 6-8 周龄雌性 BALB/c 裸鼠的右侧腹部。待肿瘤生长至约 100 mm³ 后进行治疗[2]。
2. 分组和给药：将小鼠随机分为 3 组（每组 n=6）：载体对照组（DMSO:PEG400:生理盐水 = 1:4:5）、WYE-354 5 mg/kg 组、WYE-354 10 mg/kg 组。将 WYE-354 溶解于载体混合物中，每天一次通过灌胃给药，持续 21 天 [2]
3. 数据收集：每周两次测量肿瘤体积（长 × 宽² / 2）和体重。治疗结束后，将小鼠安乐死，切除肿瘤并称重，将肿瘤组织储存在-80°C，用于p-p70S6K的Western blot分析[2]
- 结直肠癌HCT116异种移植模型（文献[3]）：
1. 模型建立：将0.2 mL HCT116细胞悬液（5×10⁶个细胞/mL）皮下注射到6-8周龄的雌性裸鼠体内[3]
2. 分组和给药：当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分为4组（每组n=6）：（1）溶剂对照组（含0.5% DMSO的生理盐水）；（2）WYE-354 10 mg/kg（溶于溶剂，腹腔注射）； （3）氯喹 50 mg/kg（溶于生理盐水，腹腔注射）；（4）WYE-354 + 氯喹。所有治疗均每日一次，持续 24 天[3]
3. 数据收集：每周测量两次肿瘤体积和体重。处死后，收集肿瘤组织进行蛋白质印迹（LC3、p62、cleaved caspase-3）和组织学分析（HE染色）[3]
- 前列腺癌PC-3异种移植模型（文献[1]）：
1. 模型建立：将0.2 mL PC-3细胞悬液（5×10⁶个细胞/mL，与Matrigel 1:1混合）皮下注射到6-8周龄的雄性裸鼠体内[1]
2. 分组和给药：将小鼠随机分为2组（每组n=6）：载体对照组和WYE-354组（10 mg/kg）。WYE-354每日灌胃一次，连续28天[1]
3. 数据收集：每周测量两次肿瘤体积和体重。切除肿瘤组织用于通过蛋白质印迹法检测 p-Akt (Ser473) [1]

小鼠口服生物利用度：BALB/c 小鼠口服 WYE-354 (10 mg/kg) 后，最大血浆浓度 (Cmax) 为 42 ng/mL，达峰时间 (Tmax) 为 1.5 小时，末端半衰期 (t₁/₂β) 为 4.5 小时，口服生物利用度 (F) 为 35% [1]
- 血浆蛋白结合率：平衡透析实验表明，WYE-354 具有较高的血浆蛋白结合率：在人血浆中为 96%，在小鼠血浆中为 95%，在大鼠血浆中为 94%（主要与白蛋白结合）[1]
- 代谢稳定性：在人肝微粒体中，WYE-354 表现出良好的代谢稳定性，半衰期 (t₁/₂) 为 150 分钟； 2 小时内代谢的药物不足 20%。主要代谢产物为单羟基化衍生物（占总代谢产物的 22%）[1]
- 大鼠药代动力学：Sprague-Dawley 大鼠静脉注射 WYE-354 (5 mg/kg) 后，总清除率 (CL) 为 0.7 L/h/kg，稳态分布容积 (Vdss) 为 3.6 L/kg [1]

体外对正常细胞的毒性：用浓度≤200 nM的WYE-354处理人真皮成纤维细胞（HDF）72小时后，细胞存活率>90%（MTT法），与溶剂对照组相比无显著细胞毒性。WYE-354对HDF的CC₅₀为220 nM，比其对癌细胞（例如MCF-7，12 nM）的IC₅₀高约15倍[1]。体内一般毒性：用WYE-354（5–10 mg/kg/天，灌胃或腹腔注射，持续21–28天）处理裸鼠，未观察到显著体重减轻（<5% vs. 基线）。血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平均在正常范围内。肝脏、肾脏和脾脏组织的组织学检查未发现明显的病理损伤（例如炎症、坏死）[1,2,3]

[1]. Biochemical, cellular, and in vivo activity of novel ATP-competitive and selective inhibitors of the mammalian target of rapamycin. Cancer Res. 2009 Aug 1;69(15):6232-40.

[2]. Rapamycin and WYE-354 suppress human gallbladder cancer xenografts in mice. Oncotarget. 2015 Oct 13;6(31):31877-88.

[3]. Autophagy inhibition sensitizes WYE-354-induced anti-colon cancer activity in vitro and in vivo. Tumour Biol. 2016 Sep;37(9):11743-11752.

4-[6-[4-(甲氧羰基氨基)苯基]-4-(4-吗啉基)-1-吡唑并[3,4-d]嘧啶基]-1-哌啶羧酸甲酯是一种氨基甲酸酯。

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作用机制：WYE-354是一种ATP竞争性mTORC1和mTORC2双重抑制剂。它与mTOR的ATP结合口袋结合，阻断ATP水解，抑制所有mTOR介导的信号传导，包括mTORC1依赖的p70S6K/4E-BP1磷酸化和mTORC2依赖的Akt激活。与仅抑制 mTORC1 的抑制剂（例如雷帕霉素）相比，这种双重抑制可更有效地抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[1,2]
- 与自噬抑制剂的协同作用：在结直肠癌中，WYE-354 单独即可诱导保护性自噬（上调 LC3-II，下调 p62）。与自噬抑制剂（例如氯喹）联合治疗可阻断自噬通量，增强 WYE-354 诱导的细胞凋亡，并提高抗肿瘤疗效——为结直肠癌提供了一种潜在的联合治疗策略[3]
- 临床前开发现状：截至文献发表（2009-2016 年），WYE-354 在多种临床前模型（前列腺癌、胆囊癌、结直肠癌）中显示出强大的抗肿瘤活性，且具有良好的药代动力学特性（口服生物利用度高、代谢稳定性好）和可控的毒性。这些数据支持其作为晚期实体瘤进一步临床开发的候选药物的潜力[1,2,3]

C24H29N7O5

495.53

495.223

C, 58.17; H, 5.90; N, 19.79; O, 16.14

1062169-56-5

1062169-56-5

44219749

White to off-white crystalline solid

1.5±0.1 g/cm3

594.2±50.0 °C at 760 mmHg

313.2±30.1 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.692

0.93

123.94

1

9

6

36

753

0

COC(NC1=CC=C(C=C1)C2=NC3=C(C(N4CCOCC4)=N2)C=NN3C5CCN(CC5)C(OC)=O)=O

IMXHGCRIEAKIBU-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H29N7O5/c1-34-23(32)26-17-5-3-16(4-6-17)20-27-21(29-11-13-36-14-12-29)19-15-25-31(22(19)28-20)18-7-9-30(10-8-18)24(33)35-2/h3-6,15,18H,7-14H2,1-2H3,(H,26,32)

methyl 4-(6-(4-((methoxycarbonyl)amino)phenyl)-4-morpholino-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl)piperidine-1-carboxylate

WYE 354; WYE354; WYE-354;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 6.7~99 mg/mL (13.5 mM~199.8 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.35 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 6.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.35 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.35 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+30% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。