PI3Kδ (IC50 = 4.6 nM); PI3Kα (IC50 = 16 nM); PI3Kβ (IC50 = 44 nM); PI3Kγ (IC50 = 49 nM); Autophagy

根据 Lineweaver-Burk 图分析，ZSTK474 以 ATP 竞争性方式抑制所有四种 PI3K 同工型。四种 PI3K 异构体的 Ki 值显示，ZSTK474 对 PI3K 异构体的抑制最为有效，Ki 为 1.8 nM，而其他异构体的抑制效果为 Ki 值的 4-10 倍。因此，ZSTK474 应被视为泛 PI3K 抑制剂。使用 ZSTK474 和 LY294002，我们还计算了抑制四种 PI3K 亚型的 IC50 值。 ZSTK474 的 IC50 值（PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ 和 PI3Kγ 分别为 16、44、4.6 和 49 nM）与 Ki 值（PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ 和 PI3Kδ 分别为 6.7、10.4、1.8 和 11.7 nM）一致。 PI3Kγ，分别），这进一步支持了 ZSTK474 最有效地抑制 PI3Kδ 的观点。即使浓度为 100 µM，ZSTK474 也只能适度抑制 mTOR 活性[1]。

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新型PI3K抑制剂ZSTK474在体内对人类癌症异种移植物显示出强大的抗肿瘤活性，没有明显的毒性。然而，其分子作用方式尚未得到详细研究。我们之前的研究仅表明ZSTK474可能与ATP竞争PI3Kgamma的ATP结合口袋。在本研究中，我们使用体外均相时间分辨荧光激酶测定法来检测ZSTK474是否确实是PI3K的ATP竞争抑制剂，并确定ZSTK474的抑制活性是否是亚型特异性的。Lineweaver Burk图分析显示，ZSTK474以ATP竞争方式抑制所有四种PI3K亚型。在所有PI3K亚型中，ZSTK474对PI3Kdelta的抑制作用最强，K（i）为1.8 nM，其他亚型在较高剂量下受到抑制。我们还使用激酶活性ELISA来确定ZSTK474是否抑制哺乳动物雷帕霉素靶点，雷帕霉素是PI3K下游促进蛋白质合成和细胞增殖的关键激酶。即使在100微摩尔的浓度下，ZSTK474对哺乳动物雷帕霉素靶活性的抑制也相当弱。这些结果表明，ZSTK474是一种ATP竞争性泛I类PI3K抑制剂。[1]

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ZSTK474对I类PI3K亚型的竞争性抑制。[1]
之前有报道称ZSTK474在纳摩尔浓度下抑制PI3K，分子建模分析表明，ZSTK474可能是一种ATP竞争性抑制剂，与PI3Kγ的ATP结合口袋结合。为了验证这一概念，我们使用体外试验在ZSTK474浓度增加的情况下测量不同ATP浓度下的PI3K活性。如图1a所示，Lineweaver–Burk图分析显示，ZSTK474对所有PI3K亚型都表现为ATP竞争性抑制剂，因为对于每种亚型，图（直线）在1/v轴上相交。通过重新绘制每个Lineweaver–Burk图的斜率与各自的ZSTK474浓度的关系图，显示了每种PI3K亚型的ZSTK474Ki值（图1b）。为了准确确定Ki值，使用GraphPad Prism 4软件程序将数据最佳拟合为v=Vmax[ATP]/（Km（1+[ZSTK474]/Ki）+[ATP]）。结果，PI3Kα、β、δ和γ的Ki值分别为6.7、10.4、1.8和11.7 nM。

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ZSTK474和LY294002对I类PI3K亚型抑制作用的比较。[1]
LY294002是一种典型的PI3K抑制剂，也与ATP结合袋竞争性结合。因此，我们比较了ZSTK474和LY294002对每种PI3K亚型的抑制活性。两种抑制剂的剂量反应抑制曲线如图2所示。通过将数据拟合到逻辑斯谛曲线，使用GraphPad Prism 4计算IC50值。ZSTK474在抑制PI3K亚型方面比LY294002强30倍。这两种抑制剂对PI3Kα和δ亚型的抑制效果均优于PI3Kβ和γ亚型（表1）。

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ZSTK474对mTOR的抑制作用。[1]
使用K-LISA试验研究了ZSTK474对mTOR的抑制作用。之前报道的Wortmannin抑制mTOR，被用作阳性对照。如图3所示，ZSTK474在0.1µM时没有抑制mTOR，该浓度高于PI3K抑制的IC50；即使在100µM的浓度下，ZSTK474对mTOR活性的抑制也不到40%，这表明ZSTK474对mTOR的抑制作用比PI3K弱得多。

在接受 MCAO 剂量为 50、100、200 和 300 mg/kg 的小鼠中检查 ZSTK474 的治疗情况。由于 200 mg/kg 剂量产生显着改善且无明显毒性作用 (P<0.01)，因此在本研究的其余实验中，小鼠每天以 200 mg/kg/天的剂量接受 ZSTK474 治疗，持续 MCAO 后三天。对患有 MCAO 的小鼠进行 24、48 和 72 小时再灌注后的神经功能检查。除角点测试外，ZSTK474组神经功能评分均显着高于对照组[2]。

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ZSTK474缓解了脑缺血/再灌注损伤模型中的神经功能缺损，减少了梗死体积。据推测，ZSTK474将小胶质细胞/巨噬细胞的表型转变为恢复状态，因为这种治疗减少了促炎因子的分泌，促进了抗炎因子的分泌。ZSTK474的这些神经保护特性可能是由磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点（mTORC1）途径介导的。
结论：ZSTK474可介导小胶质细胞/巨噬细胞表型的转变，抑制小鼠脑缺血再灌注损伤的炎症反应。这些效应似乎是通过PI3K/AKT/mTORC1途径产生的。因此，ZSTK474可能代表一种治疗干预，有可能避免缺血性卒中的灾难性后果[3]。

每个动力学反应的线性相定义为各自的酶量（PI3Kα、PI3β、PI3δ 和 PI3γ 分别为 0.05、0.1、0.12 和 1 µg/mL）和反应时间（20 分钟）。在浓度不断增加的 ZSTK474 存在下，在不同浓度的 ATP（5、10、25、50、100 µM）下测定 PI3K 活性。 Lineweaver-Burk 图是通过绘制 1/v（v 的倒数，其中 v 是通过从负酶对照的 HTRF 信号中减去激酶测试样品的 HTRF 信号获得的）与 1/[ATP]（ ATP 浓度的倒数）。 PIP2 与不含激酶的 ATP 一起孵育，作为负酶对照。为了确定 ZSTK474 对于每种 PI3K 同工型的 Ki 值（抑制常数），根据 ZSTK474 浓度重新绘制相应 Lineweaver-Burk 图的斜率。使用GraphPad Prism 4来分析计算Ki值[1]。

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磷脂酰肌醇3激酶HTRF测定。[1]
PI3K HTRF测定的原理已在前面描述。简而言之，PI3K在ATP存在下催化PIP2磷酸化为PIP3。PIP3产物是通过从由铕标记的抗谷胱甘肽S转移酶（GST）抗体、GST标记的磷酸肌醇-1（GRP1）pleckstrin同源性（PH）结构域受体、生物素-PIP3和链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白（APC）组成的能量转移复合物中置换生物素化的PIP3（生物素-PPI3）来检测的。络合物中铕的激发导致能量转移到APC。从复合物中置换生物素-PIP3会导致能量转移的损失和HTRF信号的相应减少。减少的信号与反应中产生的PIP3的量成正比，因此可用于监测PI3K活性。

激酶反应在20µL的反应混合物中进行。在室温下，将每种I类PI3K亚型蛋白在384孔板中的含有10µM PIP2和ATP（浓度按要求）的测定缓冲液中孵育。通过添加ATP引发反应，20分钟后通过添加5µL含有乙二胺四乙酸和生物素-PIP3的终止溶液停止反应。然后，加入5µL检测缓冲液，其中含有铕标记的抗GST抗体、GST标记的GRP1 PH结构域和链霉抗生物素蛋白-APC。在室温下孵育14小时后，使用EnVision 2103 Multilabel Reader在时间分辨荧光模式下读取平板，并根据以下公式确定HTRF信号：

HTRF信号=10000×（665nm发射/620nm发射）
酶动力学研究。每个动力学反应的线性相定义为相应的酶量（PI3Kα、β、δ和γ分别为0.05、0.1、0.12和1µg/mL）和反应时间（20分钟）。在不同浓度的ATP（5、10、25、50、100µM）下，在浓度逐渐增加的ZSTK474存在下测定PI3K活性。Lineweaver–Burk图是通过绘制1/v（v的倒数，其中v是通过从负酶对照的HTRF信号中减去激酶测试样品的HTRF而获得的）与1/[ATP]（ATP浓度的倒数）而绘制的。对于负酶对照，PIP2在没有激酶的情况下与ATP一起孵育。为了确定每种PI3K亚型的ZSTK474的Ki值（抑制常数），将相应的Lineweaver–Burk图的斜率与ZSTK474浓度重新绘制。Ki值是通过使用GraphPad Prism 4进行分析并将曲线拟合为：
v=Vmax[ATP]/（（公里（1+[ZSTK474]/Ki）+[ATP]），
其中v是反应速度，Vmax是最大速度，Km是米氏常数，[ZSTK474]和[ATP]分别是ZSTK474和ATP的浓度。

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测定ZSTK474和LY294002对每种I类PI3K亚型的IC50。[1]
在10µM ATP的存在下，将每种PI3K亚型蛋白与一系列浓度的ZSTK474和LY294002一起孵育。其他反应条件如上文“酶动力学研究”一节所述。使用以下公式计算某个样品的PI3K活性（对照百分比）：

PI3K活性（对照百分比）=（样本-减去酶对照）/（加酶对照-减去酶控制）×100。
对于阳性酶对照，在没有抑制剂的情况下，将激酶与PIP2和ATP一起孵育。在负酶对照的情况下，PIP2与不含激酶和抑制剂的ATP一起孵育。对于每种PI3K亚型，激酶活性被绘制为抑制剂浓度的函数（ZSTK474和LY294002）。通过使用GraphPad Prism 4软件将这些数据拟合到逻辑斯谛曲线来计算IC50值。

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K-LISA mTOR测定。[1]
K-LISA mTOR检测是一种基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法，使用p70S6K-GST融合蛋白作为mTOR底物。该底物首先与谷胱甘肽包被的96孔板结合，然后将含mTOR的样品与ATP在孔中孵育，其中活性mTOR在Thr389处磷酸化p70S6K（T389）。为了检测磷酸化底物，首先用抗p70S6K-T389抗体处理孔，然后用辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体和3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物处理。由于HRP催化反应的产物在450 nm处显示最大吸光度，因此可以通过450 nm和595 nm处的吸光度差（背景吸光度）来评估mTOR的活性。

根据制造商的方案进行了测定。简而言之，将100µL重组p70S6K-GST融合蛋白在室温下在谷胱甘肽包被的96孔板中预孵育，然后在1小时后取出。在二甲亚砜（DMSO；对照）、5µM渥曼青霉素（阳性对照）或不同浓度的ZSTK474存在下，向每个孔中加入50微升冰冷的大鼠脑源性mTOR激酶。通过加入含有100µM ATP的50µL激酶测定缓冲液引发反应，并在30°C下孵育30分钟。洗涤后，首先用100µL抗p70S6K-T389处理平板1小时，然后用100µL HRP偶联抗体处理平板1 h，以检测T389磷酸化的p70S6K。最后，加入100µL TMB作为HRP底物并孵育20分钟。然后通过加入含有2.5 N H2SO4的100µL ELISA终止溶液来停止反应。使用Benchmark Plus微孔板分光光度计在450nm和595nm处测量吸光度。

ZSTK474 以逐渐升高的浓度应用于细胞 48 小时。通过使用磺基罗丹明 B 测定法测量总细胞蛋白的变化，评估细胞增殖的抑制作用。通过染色质浓缩或流式细胞术评估细胞凋亡。对于染色质浓缩测定，细胞用 Hoechst 33342 染色并通过荧光显微镜检查。 ZSTK474 诱导的形态变化（例如染色质浓缩）表明细胞凋亡。对于流式细胞术分析，收获细胞，用冰冷的 PBS 洗涤，并固定在 70% 乙醇中。然后再次用冰冷的 PBS 洗涤细胞两次，用 RNase A (500 μg/mL) 在 37 °C 下处理 1 小时，并用碘化丙啶 (25 μg/mL) 染色。使用流式细胞仪分析细胞的 DNA 含量。

小鼠：将小鼠随机分配接受不同剂量的ZSTK474（50、100、200和300 mg/kg），以确定最佳剂量；在本实验中，最佳剂量为200 mg/kg。然后，将小鼠随机分为三组：ZSTK474治疗组（MCAO+ZSTK474）、对照组（MCAO+PBS）和接受磷酸盐缓冲液（PBS）作为假手术的组。ZSTK474治疗组的小鼠接受推荐剂量200 mg/kg的药物。对照组和假手术组的小鼠接受等量的PBS。从局灶性缺血发生后6小时开始，连续三天，每天通过灌胃给予所有小鼠相同剂量的药物，并持续两天。

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ZSTK474 处理 [3]
ZSTK474 以固体分散体的形式悬浮于 5% 羟丙基纤维素水溶液中。 首先，将小鼠随机分组，分别接受不同剂量的 ZSTK474（50、100、200 和 300 mg/kg）以确定最佳剂量；在本实验中，最佳剂量为 200 mg/kg（补充文件 1：图 S1）。然后，将小鼠随机分为三组：假手术组（磷酸盐缓冲液，PBS）；对照组（MCAO + PBS）；ZSTK474 处理组（MCAO + ZSTK474）。在 ZSTK474 处理组中，小鼠接受最佳剂量 200 mg/kg 的 ZSTK474。在假手术组和对照组中，小鼠被给予等体积的PBS。所有小鼠从局灶性缺血发生后6小时开始，每天通过灌胃给予相同剂量的PBS，持续两天，即总共3天。

[1]. ZSTK474 is an ATP-competitive inhibitor of class I phosphatidylinositol 3 kinase isoforms. Cancer Sci, 2007, 98(10), 1638-1642.

[2]. Prolonged inhibition of class I PI3K promotes liver cancer stem cell expansion by augmenting SGK3/GSK-3β/β-catenin signalling. J Exp Clin Cancer Res. 2018 Jun 25;37(1):122.

[3]. Class I PI3K inhibitor ZSTK474 mediates a shift in microglial/macrophage phenotype and inhibits inflammatory response in mice with cerebral ischemia/reperfusion injury. J Neuroinflammation. 2016 Aug 22;13(1):192.

ZSTK-474 是一种三氨基-1,3,5-三嗪类化合物，其结构为 1,3,5-三嗪，其中两个氢原子被吗啉-4-基取代，第三个氢原子被 2-(二氟甲基)苯并咪唑-1-基取代。它是磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂。它既是 EC 2.7.1.137（磷脂酰肌醇 3-激酶）抑制剂，也是一种抗肿瘤药物。它属于吗啉类、苯并咪唑类、三氨基-1,3,5-三嗪类和有机氟化合物。
ZSTK474 已用于肿瘤治疗的临床试验。
PI3K 抑制剂 ZSTK474 是一种口服有效的 s-三嗪衍生物，属于 ATP 竞争性磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。PI3K 抑制剂 ZSTK474 可抑制所有四种 PI3K 亚型。抑制 PI3K/AKT 激酶（或蛋白激酶 B）信号通路的激活可抑制易感肿瘤细胞群的生长和存活。PI3K 信号传导失调可能导致肿瘤对多种抗肿瘤药物产生耐药性。该药物不诱导细胞凋亡，而是诱导强烈的G0/G1期阻滞，这可能是其对肿瘤细胞具有良好疗效的原因之一。我们还发现，ZSTK474对mTOR的抑制作用远弱于PI3K亚型。由于mTOR是一种含有保守PI3K结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶，因此PI3K抑制剂预计会与mTOR发生交叉反应。事实上，其他PI3K抑制剂，例如LY294002和PI-103，已知能显著抑制mTOR。然而，ZSTK474并未抑制mTOR。我们之前的研究表明，ZSTK474对PI3K的抑制作用强于对其他139种蛋白激酶的抑制作用。综上所述，这些结果进一步证明了ZSTK474对PI3K具有更高的特异性。这种选择性对其降低毒性和在动物模型中体内效力增强的贡献仍有待阐明。总之，我们已证实 ZSTK474 是所有 I 类 PI3K 亚型的 ATP 竞争性抑制剂。ZSTK474 被认为是一种泛 I 类 PI3K 抑制剂。[1]

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背景：小胶质细胞/巨噬细胞在脑缺血/再灌注损伤的炎症和免疫过程中发挥着关键作用。由于小胶质细胞/巨噬细胞在受损的中枢神经系统 (CNS) 中可以可逆地将其表型转变为“有害”或“修复”状态，因此能够介导这种转变并抑制炎症和恢复缓解脑缺血/再灌注损伤能力的化合物具有治疗潜力。
方法：在雄性 C57BL/6 小鼠中诱导短暂性大脑中动脉闭塞。小鼠被随机分为假手术组、对照组和ZSTK474治疗组。我们通过评估神经功能缺损、梗死体积和组织病理学变化来研究ZSTK474的作用。然后，我们通过免疫荧光染色、定量实时聚合酶链式反应（PCR）和蛋白质印迹分析来确定其潜在机制。采用Tukey检验或Mann-Whitney U检验比较各组之间的差异。
结果：ZSTK474减轻了脑缺血/再灌注损伤模型中的神经功能缺损并减少了梗死体积。推测ZSTK474使小胶质细胞/巨噬细胞的表型向修复状态转变，因为该治疗减少了促炎因子的分泌并促进了抗炎因子的分泌。 ZSTK474的这些神经保护特性可能由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）通路介导。
结论：ZSTK474可以介导小鼠脑缺血再灌注损伤中小胶质细胞/巨噬细胞表型的转变，并抑制炎症反应。这些作用似乎是通过PI3K/AKT/mTORC1通路实现的。因此，ZSTK474可能是一种具有潜在治疗价值的干预手段，可以避免缺血性卒中带来的灾难性后果。[3]

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总之，我们的结果表明，在脑缺血/再灌注损伤的实验模型中，ZSTK474可以诱导小胶质细胞/巨噬细胞表型的转变，抑制炎症反应，减少梗死体积，并改善神经功能。这些效应似乎是由 PI3K/AKT/mTORC1 通路介导的。我们的研究结果为开发可能使缺血性中风患者受益的治疗策略奠定了坚实的基础。[3]

C19H21F2N7O2

417.4125

417.172

C, 54.67; H, 5.07; F, 9.10; N, 23.49; O, 7.67

475110-96-4

19545-26-7

11647372

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

640.3±65.0 °C at 760 mmHg

341.0±34.3 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.711

-0.21

81.43

0

10

4

30

539

0

FC([H])(C1=NC2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2N1C1=NC(=NC(=N1)N1C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C1([H])[H])N1C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C1([H])[H])F

HGVNLRPZOWWDKD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H21F2N7O2/c20-15(21)16-22-13-3-1-2-4-14(13)28(16)19-24-17(26-5-9-29-10-6-26)23-18(25-19)27-7-11-30-12-8-27/h1-4,15H,5-12H2

4-[4-[2-(difluoromethyl)benzimidazol-1-yl]-6-morpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl]morpholine

ZSTK-474; ZSTK474; ZSTK 474

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~21 mg/mL (~50.3 mM)
Water: <1 mg/mL (slightly soluble or insoluble)
Ethanol: <1 mg/mL

配方1: 0.5%羟乙基纤维素 (hydroxyethyl cellulose)：30mg/mL
配方2：悬浮在5%羟丙基纤维素(5% hydroxypropyl cellulose)中 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。