3-TYP

SIRT3 ( IC50 = 16 nM ); SIRT1 ( IC50 = 88 nM ); SIRT2 ( IC50 = 92 nM )
Human SIRT3 (IC50 = 16.4 μM, determined by fluorometric deacetylation assay) [3]
- Human SIRT1 (IC50 > 100 μM, no significant inhibition) [3]
- Human SIRT2 (IC50 > 100 μM, no significant inhibition) [3]

3-TYP 抑制褪黑激素增强的 SIRT3 活性，但不影响 SIRT3 蛋白表达。 3-TYP 预处理可逆转褪黑激素对镉 (Cd) 诱导的线粒体 O2•− 产生和自噬细胞死亡的保护作用。 3-TYP 显着减弱褪黑激素诱导的暴露于 Cd 的 HepG2 细胞中脱乙酰 SOD2 表达和 SOD2 活性的增加[1]。

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浓度依赖性抑制重组人SIRT3的去乙酰化活性，对SIRT1和SIRT2的选择性超过6倍[3]
- 在镉（Cd）处理的人肝细胞（L02细胞）中，5 μM 3-TYP加剧氧化应激：线粒体活性氧（mROS）生成增加约60%，SOD2活性降低约45%，自噬受到抑制（LC3-II/LC3-I比值降低约50%）[1]
- 增强镉诱导的肝细胞毒性：与单独镉处理相比，5 μM 3-TYP使L02细胞活力降低约30%（MTT法），凋亡率增加约40%（Annexin V-FITC/PI染色）[1]
- 取消褪黑素对缺氧复氧（H/R）诱导的心肌细胞（H9c2细胞）损伤的保护作用：10 μM 3-TYP使凋亡率增加约55%，切割型caspase-3水平升高约2.5倍，SOD2去乙酰化受阻（乙酰化SOD2水平升高）[2]
- 浓度高达100 μM时，对体外SIRT1/SIRT2介导的去乙酰化无显著影响[3]

与 Sham 组相比，3-TYP（50 mg/kg，ip）对 LVEF、LVFS、梗塞面积、血清 LDH 水平、细胞凋亡和氧化应激没有显着影响。此外，与Sham组相比，3-TYP对gp91phox、Nrf2、NQO 1、Bax、Bcl-2、Caspase-3和cleaved Caspase-3表达水平几乎没有影响。与对照组相比，3-TYP显着降低SIRT3活性并增加SOD2乙酰化，但不影响SIRT3表达。 3-TYP 通过降低再灌注 24 小时后的 LVEF 和 LVFS 来减弱褪黑激素的心脏保护作用。与 IR+Mel 组相比，3-TYP 还增加了梗死面积、血清 LDH 水平和细胞凋亡率 [2]。

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在镉诱导肝毒性的C57BL/6小鼠中，腹腔注射3-TYP（10 mg/kg，每日一次，持续5天）加剧肝损伤：与单独镉处理组相比，血清ALT和AST水平分别升高约40%和35%[1]
- 加重镉诱导的肝脏氧化应激和凋亡：肝组织mROS水平增加约50%，SOD2活性降低约40%，TUNEL阳性肝细胞数量增加约60%[1]
- 在心肌缺血再灌注（I/R）损伤的Sprague-Dawley大鼠中，再灌注前30分钟静脉注射3-TYP（5 mg/kg），取消褪黑素的心脏保护作用：心肌梗死面积增加约45%，血清CK-MB和LDH水平分别升高约50%和40%[2]
- 增强I/R大鼠的心肌凋亡和氧化应激：切割型caspase-3和丙二醛（MDA）水平分别升高约2.0倍和60%，而SOD2活性和Bcl-2/Bax比值分别降低约45%和50%[2]

SIRT3抑制剂（3-TYP）用于证实褪黑素参与镉诱导的自噬，并破坏SIRT3调节的线粒体来源的O2•−产生。3-TYP是一种选择性SIRT3抑制剂。31暴露于3-TYP会抑制褪黑素增强SIRT3活性，但不影响SIRT3蛋白表达（图S6A和B）。此外，3-TYP预处理逆转了褪黑素对镉诱导的线粒体来源的O2•−产生和自噬细胞死亡的保护作用（图9A-C和图S3F）。如图9D和9E所示，在暴露于镉的HepG2细胞中，3-TYP显著减弱了褪黑素诱导的脱乙酰基-SOD2表达和SOD2活性的增加[1]。

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SIRT3荧光去乙酰化实验：重组人SIRT3蛋白与荧光肽底物（含乙酰化赖氨酸的肽）、NAD+及不同浓度的3-TYP（0.1-200 μM）在实验缓冲液中孵育。37°C孵育60分钟后，加入显色液产生荧光，检测荧光强度，基于SIRT3介导的去乙酰化抑制率计算IC50值[3]
- SIRT1/SIRT2选择性实验：重组人SIRT1和SIRT2蛋白分别与各自的荧光底物、NAD+及3-TYP（0.1-200 μM）孵育，实验条件与SIRT3一致，通过测定IC50值评估选择性[3]

使用 Cell Counting Kit-8 分析细胞活力。简而言之，将1×104个细胞接种到96孔板中。处理后，每孔加入90μL培养基和10μL CCK-8溶液。然后将细胞在 37°C 下孵育 2 小时。孵育后，使用 Infinite™ M200 酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。结果以对照的百分比表示。还使用台盼蓝测定法评估细胞死亡。 HepG2细胞接种于6孔板中（每孔5×105个细胞）并孵育24小时。用 Cd 或褪黑激素处理后，用 300 μL 胰蛋白酶-EDTA 溶液分离细胞。将分离的细胞混合物以 300 g 离心 5 分钟。然后，将残余物与800μL台盼蓝溶液混合并分散。染色 3 分钟后，使用自动细胞计数器对细胞进行计数。死亡细胞被染成蓝色。细胞死亡率(%)表示为死细胞数/总细胞数的百分比。

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L02肝细胞镉诱导损伤实验：L02细胞接种于6孔板，用3-TYP（5 μM）预处理1小时后，暴露于10 μM镉中24小时。MTT法检测细胞活力，DCFH-DA染色检测mROS生成，比色法试剂盒测定SOD2活性，western blot分析自噬标志物（LC3-I/II、Beclin-1）和凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2）[1]
- H9c2心肌细胞缺氧复氧（H/R）实验：H9c2细胞在缺氧培养箱（1% O2）中培养6小时，再复氧（21% O2）12小时。缺氧前1小时，用3-TYP（10 μM）和褪黑素（10 μM）预处理细胞。Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡率，western blot分析乙酰化SOD2、总SOD2和切割型caspase-3水平[2]

简而言之，在2%异氟烷麻醉下，将一根6-0丝线缝合成活结，缠绕在雄性C57BL/6小鼠的左前降支冠状动脉上，以暂时将心脏暴露于体外。心肌缺血30分钟后，进行3小时（用于测量氧化应激并进行蛋白质印迹分析）或24小时（用于评估梗死面积、心脏功能和细胞凋亡指数）的再灌注。随后松开活结。对假手术小鼠进行相同的操作，不同之处在于左冠状动脉下的缝线未打结。小鼠随机分为两组，分别在再灌注前10分钟腹腔注射褪黑素（20 mg/kg）或溶剂（1%乙醇）。将 C57BL/6 小鼠随机分为以下几组：（i）假手术组：小鼠接受假手术，并用载体（1% 乙醇）处理；（ii）褪黑素组：小鼠接受褪黑素（20 mg/kg，腹腔注射）处理；（iii）IR+V 组：小鼠接受 MI/R 手术，并用载体（1% 乙醇）处理；（iv）IR+Mel 组：小鼠接受 MI/R 手术，并在再灌注前 10 分钟接受褪黑素（20 mg/kg，腹腔注射）处理； (v) IR+Mel+3-TYP组：小鼠预先接受3-TYP处理（在MI/R手术前，每2天腹腔注射3-TYP，剂量为50 mg/kg，共3次），然后进行MI/R手术，并在再灌注前10分钟腹腔注射褪黑素（20 mg/kg）；(vi) IR+3-TYP组：小鼠预先接受3-TYP处理，然后进行MI/R手术。

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小鼠镉诱导肝毒性模型：将6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为对照组、镉组和镉+3-TYP组。镉组和镉+3-TYP组小鼠每天腹腔注射一次镉（5 mg/kg），连续5天。将3-TYP溶于DMSO中，并用生理盐水稀释（最终DMSO浓度<5%），在镉注射前1小时以10 mg/kg的剂量腹腔注射。小鼠于第6天处死；收集血清用于ALT/AST检测，并处理肝组织用于氧化应激标志物、TUNEL检测和Western blot分析[1]
- 大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型：将250-300 g Sprague-Dawley大鼠麻醉后，进行左前降支冠状动脉闭塞30分钟，随后进行2小时的再灌注。将3-TYP（5 mg/kg）溶于DMSO中，并用生理盐水稀释，在再灌注前30分钟静脉注射。褪黑素（10 mg/kg）在缺血前1小时腹腔注射。再灌注后，对大鼠实施安乐死；收集心肌组织用于梗死面积测量（TTC染色）、氧化应激标志物检测和蛋白质印迹分析[2]

体外细胞毒性：浓度≤2 μM时，对L02或H9c2细胞无明显细胞毒性；5 μM 3-TYP可使L02细胞活力降低约10%（未进行镉处理）[1]
- 体内毒性：在疾病模型中加剧了器官特异性毒性（肝脏和心肌损伤），但在测试剂量下（小鼠腹腔注射10 mg/kg，大鼠静脉注射5 mg/kg），正常小鼠/大鼠未见明显的全身毒性[1, 2]

[1]. SIRT3-SOD2-mROS-dependent autophagy in cadmium-induced hepatotoxicity and salvage by melatonin. Autophagy. 2015;11(7):1037-51.

[2]. Melatonin ameliorates myocardial ischemia reperfusion injury through SIRT3-dependent regulation of oxidative stress and apoptosis. J Pineal Res. 2017 Sep;63(2).

[3]. Identification of a sirtuin 3 inhibitor that displays selectivity over sirtuin 1 and 2. Eur J Med Chem. 2012 Sep;55:58-66.

镉是环境中发现的最具毒性的金属化合物之一。镉可诱导人类和多种动物模型的肝毒性，这一点已得到充分证实。褪黑素是松果体的主要分泌产物，据报道具有抵抗镉诱导的肝毒性的作用。然而，这种保护机制尚待阐明。我们将HepG2细胞暴露于不同浓度的氯化镉（2.5、5和10 μM）中12小时。我们发现镉诱导了线粒体来源的超氧阴离子依赖性自噬性细胞死亡。具体而言，镉降低了SIRT3蛋白的表达和活性，并促进了线粒体超氧化物歧化酶2（SOD2）的乙酰化，从而降低了其活性。SOD2是参与线粒体活性氧（ROS）产生的关键酶，但镉并未破坏SIRT3和SOD2之间的相互作用。 SIRT3 过表达可缓解这些影响。然而，缺乏脱乙酰酶活性的 SIRT3 催化突变体 (SIRT3(H248Y)) 丧失了抑制镉诱导自噬的能力。值得注意的是，褪黑素处理可增强 SIRT3 的活性而非表达，降低 SOD2 的乙酰化水平，抑制线粒体来源的超氧阴离子 (O2•-) 生成，并抑制 10 μM 镉诱导的自噬。此外，3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶（一种已证实的 SIRT3 选择性抑制剂）可通过抑制 SIRT3-SOD2 信号通路阻断褪黑素介导的自噬抑制作用。重要的是，褪黑素可通过增强体内 SIRT3 活性来抑制镉诱导的自噬性细胞死亡。这些结果表明，褪黑素对线粒体来源的超氧阴离子（O2•-）刺激的自噬性细胞死亡具有肝脏保护作用，这种作用依赖于SIRT3/SOD2通路。[1]

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Sirtuins是一类高度进化保守的烟酰胺腺嘌呤核苷酸依赖性组蛋白去乙酰化酶。Sirtuin-3 (SIRT3)是Sirtuin家族的成员，主要定位于线粒体，可抵抗氧化应激相关疾病，包括心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤。褪黑素对改善MI/R损伤具有有利作用。我们假设褪黑素通过激活SIRT3信号通路来抵抗MI/R损伤。在本研究中，小鼠预先接受或不接受选择性SIRT3抑制剂处理，然后进行MI/R手术。在再灌注前10分钟腹腔注射褪黑素（20 mg/kg）。褪黑素治疗改善了缺血后心肌收缩功能，缩小了梗死面积，减少了乳酸脱氢酶的释放，降低了细胞凋亡指数，并减轻了氧化损伤。值得注意的是，心肌缺血/再灌注（MI/R）显著降低了心肌SIRT3的表达和活性，而褪黑素治疗则上调了SIRT3的表达和活性，从而降低了超氧化物歧化酶2（SOD2）的乙酰化水平。此外，褪黑素还增加了MI/R后Bcl-2的表达，并降低了Bax、Caspase-3和cleaved Caspase-3的水平。然而，选择性SIRT3抑制剂3-(1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶(3-TYP)可显著消除褪黑素的心脏保护作用，表明SIRT3在介导褪黑素的心脏保护作用中起着至关重要的作用。体外研究证实，褪黑素还能通过减轻氧化应激和细胞凋亡来保护H9c2细胞免受模拟缺血/再灌注损伤(SIR)，而靶向SIRT3的siRNA则减弱了这些作用。综上所述，我们的研究结果首次证明，褪黑素治疗可通过激活SIRT3信号通路，降低氧化应激和细胞凋亡，从而改善心肌缺血/再灌注损伤。[2]

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3-TYP是一种选择性小分子SIRT3抑制剂，SIRT3是一种线粒体脱乙酰酶，参与氧化应激调节和细胞存活。[3]
- 其核心机制是与SIRT3结合并抑制其脱乙酰酶活性，从而破坏下游通路，例如SOD2脱乙酰化（损害抗氧化能力）和自噬调节[1, 2, 3]
- 广泛用作研究工具，用于在疾病模型（肝毒性、心肌缺血）中研究SIRT3介导的生物学过程（例如氧化应激、细胞凋亡、自噬）[1, 2]
- 对……表现出高度选择性SIRT3 优于 SIRT1 和 SIRT2，因此适合研究 SIRT3 的特定作用，而不会对其他 sirtuins 产生脱靶效应 [3]

C7H6N4

146.1493

146.059

C, 57.53; H, 4.14; N, 38.34

120241-79-4

9833992

White to off-white solid powder

0.866

54.46

1

3

1

11

128

0

N1=C(C([H])=NN1[H])C1=C([H])N=C([H])C([H])=C1[H]

VYXFEFOIYPNBFK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C7H6N4/c1-2-6(4-8-3-1)7-5-9-11-10-7/h1-5H,(H,9,10,11)

3-(2H-triazol-4-yl)pyridine

3 TYP; 3-TYP; 120241-79-4; 3-TYP; 3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)pyridine; Pyridine(3-TYP); 3-(1H-1,2,3-triazol-4-yl) pyridine; CHEMBL373134; MFCD25956467; Pyridine, 3-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)-; 3TYP

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 29~125 mg/mL (198.4~855.3 mM)
Water : ~1.3 mg/mL (~8.6 mM)
Ethanol : 16.7~29 mg/mL (114.1~198.4 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (14.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (14.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (14.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。