| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 10 mM * 1 mL in DMSO |
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| 2mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| 1g |
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| 2g |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
Anti-inflammatory; Nrf2; KEAP1
- KEAP1 (Kelch-like ECH-associated protein 1): Activates Nrf2 via alkylation of cysteine residues (C151, C257, C288, C273, C297)[1] - GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase): Inhibits its activity [1] |
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
为了克服衣康酸二甲酯（DMI）的局限性，研究人员合成了4-Octyl itaconate (OI) /衣康酸4-辛酯（OI），这是一种可渗透细胞的衣康酸衍生物（扩展数据图3a）。衣康酸酯和OI具有相似的硫醇反应性，远低于DMI（扩展数据图3b、c、f），使其成为合适的细胞渗透衣康酸酯替代品。此外，OI在小鼠成肌细胞C2C12细胞（扩展数据图3d）和LPS激活的小鼠巨噬细胞（扩展数据表3e）中被酯酶水解为衣康酸盐。OI提高了Nrf2水平（图1e，将泳道5与泳道1进行比较），增强了LPS诱导的Nrf2稳定（图1e），将泳道6与泳道2进行比较，并增加了下游靶基因9的表达，包括抗炎蛋白HMOX110（图1f，g）。我们使用定量NAD（P）H:醌氧化还原酶-1（NQO1）诱导剂生物测定11,12，通过NQO1的CD值（比酶活性加倍所需的浓度）评估Nrf2激活的效力，NQO1是Nrf2的原型靶基因。OI（CD值2μM）比临床使用的Nrf2激活剂DMF（CD值6.5μM）更有效（图1h，扩展数据图3f）。OI刺激了关键抗氧化剂GSH的合成（扩展数据图3g-i）。OI还促进了前氧化剂过氧化氢（H2O2）对Nrf2的规范活化（扩展数据图3j，k）。重要的是，相关的辛基酯4-辛基-2-甲基琥珀酸酯和辛基琥珀酸酯不是迈克尔受体，对Nrf2活性没有影响，证实了衣康酸酯部分的要求（扩展数据图3l）。丙二酸二甲酯是一种强效的SDH抑制剂4，它没有激活Nrf2（扩展数据图3m），证实OI激活Nrf2与SDH抑制无关[1]。
- 巨噬细胞炎症因子抑制：4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（4-OI，10-100 μM）在小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）和RAW264.7细胞中，显著抑制LPS诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6分泌，并降低这些炎症因子的mRNA表达水平[1] - Nrf2通路激活：4-OI（5-20 μM）促进HeLa细胞和巨噬细胞中Nrf2的稳定化和核转位，上调NQO1、HO-1、GCLC等抗氧化基因的表达[1] - 糖酵解抑制：4-OI（10-50 μM）通过修饰GAPDH的C22残基，抑制巨噬细胞的有氧糖酵解，减少ATP生成和炎症因子释放[1] - 氧化应激保护：在H₂O₂诱导的氧化应激模型中，4-OI（10-50 μM）减少细胞凋亡，提高细胞存活率[1] |
| 体内研究 (In Vivo) |
衣康酸 4-辛酯 (OI) 是衣康酸的衍生物，具有细胞渗透性。 4-Octyl itaconate 可抑制细胞因子的产生并阻止体内脂多糖诱导的死亡[1]。
衣康酸4-辛酯（OI）也能抵消体内对LPS的促炎反应。OI激活Nrf2（扩展数据图7k），延长生存期，降低临床评分，改善体温调节，并在脓毒症LPS模型中降低IL-1β和TNF水平，但不降低IL-10[1]。 - LPS诱导败血症模型：腹腔注射4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（30-100 mg/kg）显著提高小鼠存活率（从约30%升至70-80%），减轻体温下降和临床症状，使血清IL-1β和TNF-α水平降低50-70%[1] - LPS诱导急性肺损伤模型：4-OI（50 mg/kg，腹腔注射）减轻肺组织损伤，减少支气管肺泡灌洗液（BALF）中的炎症细胞数量和蛋白渗出，改善肺功能[1] |
| 酶活实验 |
KEAP1半胱氨酸靶点验证[1]
将6孔板中的COS1细胞（每孔2.5×105）与0.8μg Nrf2-V5和1.6μg野生型或Cys151S突变体KEAP114或1.6μg pcDNA共转染。细胞生长21小时，然后用20或100μM4-Octyl itaconate (OI) 、5μM萝卜硫素或0.1%乙腈（载体）处理3小时。细胞在PBS中洗涤，并在200μl SDS裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，2%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和10%（v/v）甘油）中裂解。对裂解物进行超声波处理（使用Vibra Cell超声波处理器以30%的振幅处理20秒）并煮沸（3分钟），然后分别加入二硫苏糖醇（DTT）和溴酚蓝至终浓度分别为0.1 M和0.02%（w/v）。蛋白质（10μg）在梯度（4-12%）NuPAGE SDS凝胶上分离，转移到硝化纤维膜上，用抗KEAP1、抗Nrf2（兔单克隆）和抗β-肌动蛋白（小鼠单克隆）抗体进行免疫印迹。辣根过氧化物酶（HRP）或IRDye标记的二抗可以互换使用，然后进行ECL检测或使用Odyssey成像仪（Li-COR）进行扫描。 GSH/GSSG测量[1] BMDM以0.1×106个细胞/ml的速度在不透明的96孔板上铺板。细胞用4-辛基衣康酸酯（OI）（125μM）预处理2小时，然后用过氧化氢（100μM）刺激24小时。24小时后，取出细胞培养基，按照制造商的说明使用MyBio-GSH/GSSG-Glo Assay（V6611）定量还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比例。使用FLUOstar Optima平板阅读器对发光进行定量。 4-Octyl itaconate (OI) 对KEAP1修饰的分析 细胞系尚未进行支原体污染检测。转染后24小时，细胞用4-Octyl itaconate (OI) （500μM）或载体对照（PBS）处理4小时。使用抗Flag抗体和蛋白A/G珠对标记的KEAP1进行免疫沉淀。免疫沉淀后，使用稀释在1×TBS pH 7.4中的Flag肽（500μl；200μg ml-1）从珠粒上洗脱结合的KEAP1。然后浓缩样品，使用10K离心过滤柱去除Flag肽。然后将浓缩的样品分成两半进行下游处理。用5×SDS样品缓冲液将每个样品的一半稀释1:2，并用SDS-PAGE分离。使用考马斯亮蓝染色检测过表达的KEAP1，并从凝胶中切下相应的条带，如所述进行凝胶内消化。简而言之，在用DTT（10mM）还原和用碘乙酰胺（50mM）烷基化之前，将凝胶切片切成更小的块（1-2mm3）。然后将每个样品的一半凝胶切片进行胰蛋白酶（2μg）消化，另一半用弹性蛋白酶（1μg）在37°C下消化过夜。同样，在通过甲醇-氯仿提取法沉淀蛋白质之前，剩余的样品浓缩物（溶液中）用DTT还原并用碘乙酰胺烷基化。将蛋白质颗粒重新悬浮在尿素（6M）中，然后用超纯H2O稀释至<1M尿素。然后在37°C下用胰蛋白酶（2μg）消化样品过夜。在与UPLC终极3000 RSLCnano系统耦合的Orbitrap Fusion Lumos中分析消化的蛋白质样品。 - GAPDH活性测定实验：重组GAPDH（10 μg/ml）与不同浓度的4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（1-100 μM）在37℃预孵育30分钟，加入GAP和NAD⁺启动反应，在340 nm处测量NADH的生成速率，4-OI以剂量依赖方式抑制GAPDH活性[1] - KEAP1烷基化检测实验：重组KEAP1蛋白与4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（10-50 μM）在37℃孵育2小时，通过质谱法检测烷基化的KEAP1，鉴定被修饰的半胱氨酸残基[1] |
| 细胞实验 |
用于绝对琥珀酸和衣康酸定量和代谢物追踪的代谢物测量[1]
根据需要处理细胞。对于追踪研究，在LPS刺激前，立即取出培养基，用含有U-13C-葡萄糖（4.5 g l-1）或U-13C-谷氨酰胺（584 mg ml-1）的DMEM培养基（1 ml）替换，这些培养基会耗尽12C葡萄糖或12C谷氨酰胺。样品在甲醇/乙腈/水中提取，50:30:20（v/v/v）（每1×106个细胞1 ml），在Thermomixer中于4°C下搅拌15分钟，然后在-20°C下孵育1小时。样品在4°C以最大速度离心10分钟。将上清液转移到新试管中，在4°C下以最大速度再次离心10分钟。将上清液转移到自动进样瓶中。使用与Dionex U3000 UHPLC系统耦合的Q Exactive质谱仪进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。更多详细信息，请参阅补充方法。 蛋白质印迹[1] 通过在5×Laemmli样品缓冲液中直接裂解细胞，然后在95°C下加热5分钟来制备培养细胞的蛋白质样品。对于脾脏样品，使用Qiagen TissueLyserII系统在RIPA缓冲液中均质化30mg脾脏。所得匀浆在4°C下以14000 r.p.m.离心10分钟，上清液用于SDS-PAGE。蛋白质样品在8%或12%的SDS-PAGE凝胶上分离，然后使用湿式或半干式转移系统转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下，将膜在TBS吐温（TBST）中的5%（w/v）奶粉中封闭至少1小时。用第一抗体孵育膜，然后用适当的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育。它们是使用LumiGLO增强化学发光（ECL）基底开发的。使用GelDoc系统对条带进行可视化 - 炎症因子分泌实验：小鼠BMDMs或RAW264.7细胞用LPS（1 μg/ml）刺激，同时加入不同浓度的4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（1-100 μM）共培养24小时，收集培养上清，通过ELISA检测IL-1β和TNF-α的浓度[1] - Nrf2核转位实验：HeLa细胞或巨噬细胞用4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（10 μM）处理2小时，固定、透化后用抗Nrf2抗体染色，通过免疫荧光显微镜观察并定量Nrf2在细胞核的积累[1] - 糖酵解活性测定实验：巨噬细胞用4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（20 μM）处理1小时，测量葡萄糖消耗率和乳酸产生率以评估糖酵解活性[1] - 氧化应激细胞存活实验：细胞用4-辛基衣康酸（4-Octyl Itaconate）（10-50 μM）预处理2小时，再用H₂O₂处理12小时，通过CCK-8法检测细胞活力，Hoechst 33258染色计数凋亡细胞[1] |
| 动物实验 |
小鼠在二氧化碳室中处死，并通过颈椎脱臼确认死亡。从腿骨中提取骨髓细胞，并在DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和20% L929上清液）中分化6天，然后计数并重新接种用于实验。除非另有说明，体外实验中使用的BMDM细胞浓度为5 × 10⁶个/毫升。除非另有说明，所用LPS浓度为100 ng ml⁻¹，DMI和4-辛基衣康酸酯(OI)浓度为125 μM，在LPS刺激前进行预处理的实验中，预处理时间为3小时。[1]
内毒素诱导的脓毒症模型[1] 为测定细胞因子，小鼠在腹腔注射LPS（Sigma；2.5 mg kg⁻¹）刺激2小时前，先腹腔注射4-辛基衣康酸酯(OI)（50 mg kg⁻¹，溶于40%环糊精PBS溶液）或溶剂对照2小时。小鼠在CO₂室中处死，采集血样并分离血清。使用R&D ELISA试剂盒，按照制造商的说明书测定细胞因子。为了记录体温，每组小鼠（n = 10）在接受脂多糖（LPS，5 mg kg⁻¹）刺激前2小时，腹腔注射4-辛基衣康酸酯（OI，50 mg kg⁻¹，溶于40%环糊精的PBS溶液中）或溶剂对照。在LPS刺激后1、2、3、4、6、12、18和24小时监测小鼠体温。体温监测采用皮下植入的温度传感器芯片（Bio Medic Data Systems；IPTT 300），该芯片在实验前48小时植入小鼠肩胛骨之间。在设定的时间点，使用相应的BMDS智能探头扫描传感器芯片测量体温。此外，还根据体温变化、体况、身体状况和非诱发行为对动物进行内毒素休克临床症状的监测，综合评分9分表示实验的人道终点。 - LPS诱导的脓毒症模型：将C57BL/6小鼠随机分为载体对照组和4-辛基衣康酸酯治疗组。将4-OI溶解于DMSO和PEG400（1:4）的混合溶液中，并以30-100 mg/kg的剂量进行腹腔注射。30分钟后，所有小鼠均腹腔注射LPS（15 mg/kg）。记录7天的存活率，并每12小时测量一次体温和临床评分[1] - LPS诱导的急性肺损伤模型：通过鼻内滴注LPS（50 μg）诱导小鼠肺损伤。在LPS给药前1小时，治疗组接受腹腔注射4-辛基衣康酸酯（50 mg/kg）。LPS灌注24小时后处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）以计数炎症细胞并测定蛋白质浓度；取肺组织进行组织学分析[1] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
内源性代谢产物衣康酸近期被发现是巨噬细胞功能的调节因子，但其确切的作用机制仍不甚明了。本研究表明，在小鼠和人巨噬细胞中，脂多糖激活抗炎转录因子Nrf2（又名NFE2L2）需要衣康酸的参与。我们发现衣康酸通过烷基化半胱氨酸残基直接修饰蛋白质。衣康酸烷基化KEAP1蛋白上的151、257、288、273和297位半胱氨酸残基，使Nrf2能够增加下游具有抗氧化和抗炎功能的基因的表达。Nrf2的激活是衣康酸发挥抗炎作用所必需的。我们描述了一种新型的细胞渗透性衣康酸衍生物——4-辛基衣康酸的应用，该衍生物在体内能够保护细胞免受脂多糖诱导的死亡，并降低细胞因子的产生。我们发现 I 型干扰素可增强 Irg1（也称为 Acod1）的表达和衣康酸的产生。此外，我们发现衣康酸的产生会限制 I 型干扰素的反应，表明干扰素和衣康酸之间存在负反馈回路。我们的研究结果表明，衣康酸是一种重要的抗炎代谢物，它通过 Nrf2 发挥作用，从而限制炎症并调节 I 型干扰素。[1]
在 Nrf2 缺陷型巨噬细胞中，OI 诱导的 HMOX1 表达被阻断（图 3h（比较第 2 和 3 道与第 8 和 9 道）和扩展数据图 8a、d），或者当 Nrf2 被沉默时（扩展数据图 8a、d（比较第 7 和 8 道与第 11 和 12 道））。在缺乏 Nrf2 的情况下，OI 引起的 LPS 诱导的 IL-1β 减少显著受损（图 3h（比较第 6 泳道和第 12 泳道），扩展数据图 8b–f（比较 c、d 中的第 6 和 8 泳道与第 10 和 12 泳道））。此外，两种 Nrf2 激活剂，马来酸二乙酯和 15-脱氧-Δ12,14-前列腺素 J2，均能降低 LPS 诱导的 IL-1β、IL-10、一氧化氮合酶 (NOS2) 和亚硝酸盐的水平（扩展数据图 8g–k）。因此，衣康酸通过 Nrf2 激活抗炎程序。[1] - 4-辛基衣康酸是内源性抗炎代谢物衣康酸的细胞渗透性衍生物，能够有效穿透细胞膜。[1] - 其核心作用机制涉及烷基化 KEAP1 的关键半胱氨酸残基，从而阻止 KEAP1 介导的 Nrf2 泛素化和降解，进而激活 Nrf2 依赖的抗氧化和抗炎转录程序。[1] - 4-辛基衣康酸的抗炎作用部分是通过抑制巨噬细胞中的有氧糖酵解来实现的，而有氧糖酵解是炎症反应的关键代谢过程。[1] |
| 分子式 |
C₁₃H₂₂O₄
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|---|---|
| 分子量 |
242.31
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| 精确质量 |
242.151
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| 元素分析 |
C, 64.44; H, 9.15; O, 26.41
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| CAS号 |
3133-16-2
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| PubChem CID |
14239884
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| 外观&性状 |
White to off-white solid powder
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| LogP |
1.584
|
| tPSA |
66.43
|
| 氢键供体(HBD)数目 |
1
|
| 氢键受体(HBA)数目 |
4
|
| 可旋转键数目(RBC) |
11
|
| 重原子数目 |
17
|
| 分子复杂度/Complexity |
258
|
| 定义原子立体中心数目 |
0
|
| InChi Key |
KBASUIDPDITQHT-UHFFFAOYSA-N
|
| InChi Code |
InChI=1S/C13H22O4/c1-3-4-5-6-7-8-9-17-12(14)10-11(2)13(15)16/h2-10H2,1H3,(H,15,16)
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| 化学名 |
2-methylidene-4-octoxy-4-oxobutanoic acid
|
| 别名 |
4-Octyl Itaconate; OI; 4 Octyl Itaconate; 4-Octyl Itaconate; 3133-16-2; 2-Methylene-4-(octyloxy)-4-oxobutanoic acid; 2-methylidene-4-(octyloxy)-4-oxobutanoic acid; Itaconic acid 4-octyl ester; 4-OctylItaconate; 2-methylidene-4-octoxy-4-oxobutanoic acid; SCHEMBL3681702; 4-Octyl-Itaconate
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
DMSO : ~100 mg/mL (~412.69 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL |
|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 配方 6 中的溶解度: 1 mg/mL (4.13 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C). 配方 7 中的溶解度: 5 mg/mL (20.63 mM) in 20% HP-β-CD in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C). *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 4.1269 mL | 20.6347 mL | 41.2694 mL | |
| 5 mM | 0.8254 mL | 4.1269 mL | 8.2539 mL | |
| 10 mM | 0.4127 mL | 2.0635 mL | 4.1269 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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