4-Octyl Itaconate

Anti-inflammatory; Nrf2; KEAP1

为了克服衣康酸二甲酯（DMI）的局限性，研究人员合成了4-Octyl itaconate (OI) /衣康酸4-辛酯（OI），这是一种可渗透细胞的衣康酸衍生物（扩展数据图3a）。衣康酸酯和OI具有相似的硫醇反应性，远低于DMI（扩展数据图3b、c、f），使其成为合适的细胞渗透衣康酸酯替代品。此外，OI在小鼠成肌细胞C2C12细胞（扩展数据图3d）和LPS激活的小鼠巨噬细胞（扩展数据表3e）中被酯酶水解为衣康酸盐。OI提高了Nrf2水平（图1e，将泳道5与泳道1进行比较），增强了LPS诱导的Nrf2稳定（图1e），将泳道6与泳道2进行比较，并增加了下游靶基因9的表达，包括抗炎蛋白HMOX110（图1f，g）。我们使用定量NAD（P）H:醌氧化还原酶-1（NQO1）诱导剂生物测定11,12，通过NQO1的CD值（比酶活性加倍所需的浓度）评估Nrf2激活的效力，NQO1是Nrf2的原型靶基因。OI（CD值2μM）比临床使用的Nrf2激活剂DMF（CD值6.5μM）更有效（图1h，扩展数据图3f）。OI刺激了关键抗氧化剂GSH的合成（扩展数据图3g-i）。OI还促进了前氧化剂过氧化氢（H2O2）对Nrf2的规范活化（扩展数据图3j，k）。重要的是，相关的辛基酯4-辛基-2-甲基琥珀酸酯和辛基琥珀酸酯不是迈克尔受体，对Nrf2活性没有影响，证实了衣康酸酯部分的要求（扩展数据图3l）。丙二酸二甲酯是一种强效的SDH抑制剂4，它没有激活Nrf2（扩展数据图3m），证实OI激活Nrf2与SDH抑制无关[1]。

衣康酸 4-辛酯 (OI) 是衣康酸的衍生物，具有细胞渗透性。 4-Octyl itaconate 可抑制细胞因子的产生并阻止体内脂多糖诱导的死亡[1]。

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衣康酸4-辛酯（OI）也能抵消体内对LPS的促炎反应。OI激活Nrf2（扩展数据图7k），延长生存期，降低临床评分，改善体温调节，并在脓毒症LPS模型中降低IL-1β和TNF水平，但不降低IL-10[1]。

KEAP1半胱氨酸靶点验证[1]
将6孔板中的COS1细胞（每孔2.5×105）与0.8μg Nrf2-V5和1.6μg野生型或Cys151S突变体KEAP114或1.6μg pcDNA共转染。细胞生长21小时，然后用20或100μM4-Octyl itaconate (OI) 、5μM萝卜硫素或0.1%乙腈（载体）处理3小时。细胞在PBS中洗涤，并在200μl SDS裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 6.8，2%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和10%（v/v）甘油）中裂解。对裂解物进行超声波处理（使用Vibra Cell超声波处理器以30%的振幅处理20秒）并煮沸（3分钟），然后分别加入二硫苏糖醇（DTT）和溴酚蓝至终浓度分别为0.1 M和0.02%（w/v）。蛋白质（10μg）在梯度（4-12%）NuPAGE SDS凝胶上分离，转移到硝化纤维膜上，用抗KEAP1、抗Nrf2（兔单克隆）和抗β-肌动蛋白（小鼠单克隆）抗体进行免疫印迹。辣根过氧化物酶（HRP）或IRDye标记的二抗可以互换使用，然后进行ECL检测或使用Odyssey成像仪（Li-COR）进行扫描。

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GSH/GSSG测量[1]
BMDM以0.1×106个细胞/ml的速度在不透明的96孔板上铺板。细胞用4-辛基衣康酸酯（OI）（125μM）预处理2小时，然后用过氧化氢（100μM）刺激24小时。24小时后，取出细胞培养基，按照制造商的说明使用MyBio-GSH/GSSG-Glo Assay（V6611）定量还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比例。使用FLUOstar Optima平板阅读器对发光进行定量。

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4-Octyl itaconate (OI) 对KEAP1修饰的分析 细胞系尚未进行支原体污染检测。转染后24小时，细胞用4-Octyl itaconate (OI) （500μM）或载体对照（PBS）处理4小时。使用抗Flag抗体和蛋白A/G珠对标记的KEAP1进行免疫沉淀。免疫沉淀后，使用稀释在1×TBS pH 7.4中的Flag肽（500μl；200μg ml-1）从珠粒上洗脱结合的KEAP1。然后浓缩样品，使用10K离心过滤柱去除Flag肽。然后将浓缩的样品分成两半进行下游处理。用5×SDS样品缓冲液将每个样品的一半稀释1:2，并用SDS-PAGE分离。使用考马斯亮蓝染色检测过表达的KEAP1，并从凝胶中切下相应的条带，如所述进行凝胶内消化。简而言之，在用DTT（10mM）还原和用碘乙酰胺（50mM）烷基化之前，将凝胶切片切成更小的块（1-2mm3）。然后将每个样品的一半凝胶切片进行胰蛋白酶（2μg）消化，另一半用弹性蛋白酶（1μg）在37°C下消化过夜。同样，在通过甲醇-氯仿提取法沉淀蛋白质之前，剩余的样品浓缩物（溶液中）用DTT还原并用碘乙酰胺烷基化。将蛋白质颗粒重新悬浮在尿素（6M）中，然后用超纯H2O稀释至<1M尿素。然后在37°C下用胰蛋白酶（2μg）消化样品过夜。在与UPLC终极3000 RSLCnano系统耦合的Orbitrap Fusion Lumos中分析消化的蛋白质样品。

用于绝对琥珀酸和衣康酸定量和代谢物追踪的代谢物测量[1]
根据需要处理细胞。对于追踪研究，在LPS刺激前，立即取出培养基，用含有U-13C-葡萄糖（4.5 g l-1）或U-13C-谷氨酰胺（584 mg ml-1）的DMEM培养基（1 ml）替换，这些培养基会耗尽12C葡萄糖或12C谷氨酰胺。样品在甲醇/乙腈/水中提取，50:30:20（v/v/v）（每1×106个细胞1 ml），在Thermomixer中于4°C下搅拌15分钟，然后在-20°C下孵育1小时。样品在4°C以最大速度离心10分钟。将上清液转移到新试管中，在4°C下以最大速度再次离心10分钟。将上清液转移到自动进样瓶中。使用与Dionex U3000 UHPLC系统耦合的Q Exactive质谱仪进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析。更多详细信息，请参阅补充方法。

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蛋白质印迹[1]
通过在5×Laemmli样品缓冲液中直接裂解细胞，然后在95°C下加热5分钟来制备培养细胞的蛋白质样品。对于脾脏样品，使用Qiagen TissueLyserII系统在RIPA缓冲液中均质化30mg脾脏。所得匀浆在4°C下以14000 r.p.m.离心10分钟，上清液用于SDS-PAGE。蛋白质样品在8%或12%的SDS-PAGE凝胶上分离，然后使用湿式或半干式转移系统转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下，将膜在TBS吐温（TBST）中的5%（w/v）奶粉中封闭至少1小时。用第一抗体孵育膜，然后用适当的辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育。它们是使用LumiGLO增强化学发光（ECL）基底开发的。使用GelDoc系统对条带进行可视化

Mice were euthanized in a CO2 chamber and death was confirmed by cervical dislocation. Bone marrow cells were extracted from the leg bones and differentiated in DMEM (containing 10% fetal calf serum, 1% penicillin/streptomycin and 20% L929 supernatant) for 6 days, at which time they were counted and replated for experiments. Unless stated, 5 × 106 BMDMs per millilitre were used in in vitro experiments. Unless stated, the LPS concentration used was 100 ng ml−1, the DMI and 4-Octyl itaconate (OI) concentration was 125 μM, and in experiments where pre-treatments occurred before LPS stimulation this was for 3 h.[1]

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Endotoxin-induced model of sepsis [1]
For cytokine measurements, mice were treated intraperitoneally with 4-Octyl itaconate (OI) (50 mg kg−1) in 40% cyclodextrin in PBS or vehicle control for 2 h before stimulation with LPS (Sigma; 2.5 mg kg−1) intraperitoneally for 2 h. Mice were euthanized in a CO2 chamber, blood samples were collected and serum was isolated. Cytokines were measured using R&D ELISA kits according to manufacturer’s protocol. For temperature recording, mice (n = 10 per group) were treated intraperitoneally with 4-Octyl itaconate (OI) (50 mg kg−1) in 40% cyclodextrin in PBS or vehicle control for 2 h before stimulation with LPS (5 mg kg−1) and monitored for temperature at 1, 2, 3, 4, 6, 12, 18 and 24 h after LPS treatment. Temperature was monitored using subcutaneously implanted temperature transponder chips (Bio Medic Data Systems; IPTT 300) which were injected between the shoulder blades 48 h before experiment. At defined times, body temperature was measured by scanning the transponder with a corresponding BMDS Smart Probe. Animals were additionally monitored for clinical signs of endotoxic shock, based on temperature change, body condition, physical condition and unprovoked behaviour, with a combined score of 9 indicating the humane end point for the experiment.

[1]. Itaconate is an anti-inflammatory metabolite that activates Nrf2 via alkylation of KEAP1. Nature. 2018 Apr 5;556(7699):113-117.

The endogenous metabolite itaconate has recently emerged as a regulator of macrophage function, but its precise mechanism of action remains poorly understood. Here we show that itaconate is required for the activation of the anti-inflammatory transcription factor Nrf2 (also known as NFE2L2) by lipopolysaccharide in mouse and human macrophages. We find that itaconate directly modifies proteins via alkylation of cysteine residues. Itaconate alkylates cysteine residues 151, 257, 288, 273 and 297 on the protein KEAP1, enabling Nrf2 to increase the expression of downstream genes with anti-oxidant and anti-inflammatory capacities. The activation of Nrf2 is required for the anti-inflammatory action of itaconate. We describe the use of a new cell-permeable itaconate derivative, 4-octyl itaconate, which is protective against lipopolysaccharide-induced lethality in vivo and decreases cytokine production. We show that type I interferons boost the expression of Irg1 (also known as Acod1) and itaconate production. Furthermore, we find that itaconate production limits the type I interferon response, indicating a negative feedback loop that involves interferons and itaconate. Our findings demonstrate that itaconate is a crucial anti-inflammatory metabolite that acts via Nrf2 to limit inflammation and modulate type I interferons.[1]

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OI induction of HMOX1 was blocked in Nrf2-deficient macrophages (Fig. 3h (compare lanes 2 and 3 to lanes 8 and 9) and Extended Data Fig. 8a, d) or when Nrf2 was silenced (Extended Data Fig. 8a, d (compare lanes 7 and 8 to lanes 11 and 12)). Without Nrf2, the decrease in LPS-induced IL-1β with OI was significantly impaired (Fig. 3h (compare lane 6 to lane 12), Extended Data Fig. 8b–f (compare lanes 6 and 8 to 10 and 12 in c, d)). Furthermore, two Nrf2 activators, diethyl maleate and 15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2 decreased LPS-induced IL-1β, IL-10, nitric oxide synthase (NOS2) and nitrite (Extended Data Fig. 8g–k). Thus, itaconate activates an anti-inflammatory program through Nrf2.[1]

C₁₃H₂₂O₄

242.31

242.151

C, 64.44; H, 9.15; O, 26.41

3133-16-2

14239884

White to off-white solid powder

1.584

66.43

1

4

11

17

258

0

KBASUIDPDITQHT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H22O4/c1-3-4-5-6-7-8-9-17-12(14)10-11(2)13(15)16/h2-10H2,1H3,(H,15,16)

2-methylidene-4-octoxy-4-oxobutanoic acid

4-Octyl Itaconate; OI; 4 Octyl Itaconate; 4-Octyl Itaconate; 3133-16-2; 2-Methylene-4-(octyloxy)-4-oxobutanoic acid; 2-methylidene-4-(octyloxy)-4-oxobutanoic acid; Itaconic acid 4-octyl ester; 4-OctylItaconate; 2-methylidene-4-octoxy-4-oxobutanoic acid; SCHEMBL3681702; 4-Octyl-Itaconate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~412.69 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.32 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: 1 mg/mL (4.13 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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配方 7 中的溶解度: 5 mg/mL (20.63 mM) in 20% HP-β-CD in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。