FAPI-4

FAP (fibroblast activation protein)
FAPI-4 targets fibroblast activation protein (FAP). FAP is a serine protease that is selectively overexpressed in cancer-associated fibroblasts (CAFs) within the tumor microenvironment. FAPI-4 functions as a potent FAP inhibitor, enabling targeted delivery of imaging or therapeutic agents to the tumor microenvironment. When radiolabeled (e.g., with ⁶⁸Ga or ¹⁷⁷Lu), FAPI-4 enables precise tumor imaging and targeted radionuclide therapy.

FAPI骨架的化学修饰导致体外FAP结合增强。[2]
为了确定放射性示踪剂的FAP结合亲和力（补充表1），我们使用表达人FAP的HT-1080细胞进行了放射性配体结合实验。为了补偿FAP表达速率的差异并能够与先导化合物进行直接比较，所有实验均与FAPI-04平行进行。所有化合物均表现出与人FAP的强结合力，孵育1小时和4小时后，其结合值等于或高于FAPI-04（图1）。除FAPI-38外（24小时后内化率为63.1%；FAPI-04为97.1%；补充表2），所有化合物的内化率均与FAPI-04相当。尽管大多数衍生物在24小时后显示出比FAPI-04更高的结合值，但化合物FAPI-38、-39、-40和-41从表达FAP的细胞中清除速度明显更快，因此未对其进行更详细的表征。与FAPI-04类似，所有化合物与结构相关的膜蛋白CD26的结合均极低（数据未显示）。体外实验表明，FAPI-4是一种有效的FAP抑制剂，对FAP具有高亲和力。该化合物的喹唑啉-吡咯啉核心结构使其能够与FAP高亲和力结合。在FAPI配体中，FAPI-4是最有希望用于临床应用的示踪剂。

FAPI-4（静脉注射；每只小鼠30 nmol；单次）在BALB/c裸鼠中表现出优异的肿瘤抑制作用[2]。成纤维细胞活化蛋白（FAP）在多种肿瘤的癌相关成纤维细胞中过度表达。近年来，基于喹啉的PET示踪剂作为FAP抑制剂（FAPIs）的研发取得了令人鼓舞的临床前结果，并在部分临床病例中也展现出良好的应用前景。因此，我院目前已将这些示踪剂应用于癌症患者的诊断，以弥补常规检查的不足。本文分析了两种新型PET放射性药物的组织生物分布和初步剂量学数据。方法：使用QDOSE剂量学软件，对两名患者在示踪剂注射后0.2、1和3小时的检查结果进行了68Ga-FAPI-2和68Ga-FAPI-4的初步剂量学估算。在注射 68Ga-FAPI-2 (n = 25) 或 68Ga-FAPI-4 (n = 25) 后 1 小时，对肿瘤患者进行了进一步的 PET/CT 扫描；其中 6 例患者还进行了与上述注射相关的 18F-FDG 扫描（同样在注射后 1 小时进行）。对于 16 个器官的正常组织，在实质内放置了一个 2 cm 的球形感兴趣区；对于肿瘤病灶，使用阈值分割的感兴趣区来量化 SUVmean 和 SUVmax。结果：与文献中 18F-FDG、68Ga-DOTATATE 和 68Ga-PSMA-11 的值相似，使用 200 MBq 的 68Ga-FAPI-2 或 68Ga-FAPI-4 进行的检查相当于约 3–4 mSv 的剂量。经肾脏快速清除后，正常器官对示踪剂的摄取量较低，注射后10分钟至3小时内变化甚微。注射68Ga-FAPI-2后，肿瘤摄取量在1至3小时内下降了75%，而注射68Ga-FAPI-4后，肿瘤滞留时间延长（25%的清除率）。就肿瘤/背景比值而言，注射后1小时，两种68Ga-FAPI示踪剂的表现相当。与18F-FDG相比，肿瘤摄取量几乎相同（平均SUVmax值分别为18F-FDG 7.41和68Ga-FAPI-2 7.37；差异无统计学意义）。脑部（11.01 vs. 0.32）、肝脏（2.77 vs. 1.69）和口腔/咽部黏膜（4.88 vs. 2.57）的背景摄取在 68Ga-FAPI 中显著降低。其他器官在 18F-FDG 和 68Ga-FAPI 之间无显著差异。结论：FAPI PET/CT 是一种用于癌症患者成像的新型诊断方法。与 18F-FDG 不同，FAPI PET/CT 检查前无需饮食或禁食，且示踪剂注射后几分钟即可开始图像采集。其肿瘤/背景对比度与 18F-FDG 相当甚至更优。[1]

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在体内，⁶⁸Ga-FAPI-4 PET/CT 是一种很有前景的新型诊断方法，可用于多种类型癌症的成像，并具有良好的肿瘤/背景对比度。 FAPI-4在肝细胞癌（HCC）的PET成像中显示出强烈的肝脏摄取。FAPI-4是一种很有前景的示踪剂，可用于诊断成像和靶向治疗富含活化成纤维细胞的恶性肿瘤。

FAPI-4 与 FAP 的结合可通过放射性配体结合或表面等离子共振 (SPR) 检测，并使用重组 FAP 蛋白进行测定。竞争性结合实验用于确定其亲和力和特异性。典型的实验方案包括将化合物与 FAP 蛋白孵育，并测量结合动力学或标记探针的置换情况。

细胞培养[2]
将转染人FAP基因的HT-1080细胞以及转染鼠FAP和CD26基因的人胚肾细胞，在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中，于37℃/5%二氧化碳条件下培养。放射性配体结合实验中，将细胞接种于6孔板中，培养48小时至最终汇合度达到约80%–90%（每孔120万–200万个细胞）。更换培养基，加入1 mL不含胎牛血清的新鲜培养基。将放射性标记化合物加入细胞培养物中，孵育10分钟至24小时不等。竞争实验中，同时用未标记（10⁻⁵至10⁻¹⁰ M）和放射性标记化合物处理细胞60分钟。细胞与示踪剂孵育60分钟后，测定细胞外排情况。随后，移除放射性培养基，洗涤细胞，并在非放射性培养基中分别培养1、2、4和24小时。在所有实验中，细胞均用1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次，随后用1.4 mL裂解缓冲液（0.3 M NaOH，0.2%十二烷基硫酸钠）裂解。放射性通过γ计数器测定，并以100万个细胞为基准进行标准化，计算为应用剂量的百分比。每个实验重复3次，每个独立实验采集3个重复数据。

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在表达FAP的癌相关成纤维细胞中评估FAPI-4的细胞活性。用FAPI-4处理细胞，并评估FAP活性或结合情况。在基于细胞的检测中测量放射性标记的FAPI-4的摄取，以评估结合特异性和细胞内化。

动物/疾病模型：将8周龄BALB/c nu/nu（裸鼠）接种HT-1080-FAP细胞[2]。
剂量：每只小鼠30 nmol。
给药途径：静脉注射；每只小鼠30 nmol；单次。
实验结果：显示肿瘤总体摄取量较高（注射后4小时为9.44% ID/g）。

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在荷瘤小鼠模型中进行了FAPI-4的体内研究。给动物注射放射性标记的FAPI-4（例如，⁶⁸Ga-FAPI-4），并进行PET成像。评估肿瘤摄取、生物分布和肿瘤与背景的对比度。生物分布研究包括解剖组织和测量放射性。

改善PET中的药代动力学和图像对比度[2]
为了评估提高肿瘤滞留率及其药代动力学行为的潜力，我们对最有希望的候选药物进行了体内分析。为此，我们对HT-1080-FAP异种移植小鼠进行了小动物PET成像。所有化合物均显示出快速的肿瘤蓄积，总体背景活性低，并且主要通过肾脏排泄（补充图4）。FAPI-55显示出最高的肿瘤摄取（60分钟时SUVmax为1.8，120分钟时为1.7），其次是FAPI-36（60分钟时为1.5，120分钟时为1.3）和FAPI-21（60分钟和120分钟时均为1.3）（图2，补充图5）。由于绝对摄取值有限，难以与放射性示踪剂进行比较，因此基于时间-活性曲线计算AUC值，代表注射后2小时内累积的放射性。如表1所示，10种化合物中有7种的肿瘤摄取高于FAPI-04，其中FAPI-21、-36、-46和-55的摄取最高。然而，FAPI-36的全身循环时间较长，导致其肿瘤/血液比值不利，图像对比度低于FAPI-04（补充图4）。尽管FAPI-35的肿瘤/血液比值和肿瘤/肝脏比值与FAPI-04相当，但其肿瘤/肌肉比值略有改善（图3）。FAPI-21和-55在肝脏和肌肉组织中的积累量高于FAPI-04。在所有测试化合物中，FAPI-46的肿瘤/血液比值、肿瘤/肌肉比值和肿瘤/肝脏比值最高。基于影像学研究的观察结果，我们选择FAPI-21、-35、-46和-55，使用¹⁷⁷Lu标记的放射性示踪剂进行更详细的生物分布研究。如图4所示，所有化合物均表现出显著的肿瘤蓄积，而健康组织中的总体摄取量较低。由于放射性示踪剂主要经肾脏清除，且其活性主要集中在肾盏，因此在肾脏中仅检测到中等放射性（注射后1小时为1.8–3.5 %ID/g）。与FAPI-04相比，FAPI-21和-46在注射后1小时和4小时显示出更高的肿瘤蓄积。尽管所有其他化合物在注射后1小时均显示出最高的肿瘤内放射性，但FAPI-21的肿瘤摄取量在注射后1至4小时内持续增加。此外，注射后24小时，FAPI-21的肿瘤滞留率最高（6.03 ± 0.68 %ID/g），其次是FAPI-35（2.47 ± 0.23 %ID/g）和FAPI-46（2.29 ± 0.16 %ID/g），它们的摄取率与FAPI-04（2.86 ± 0.31 %ID/g）相似。相应地，注射后24小时，FAPI-21保留了其最大肿瘤活性的64%，其次是FAPI-35（37%）、FAPI-46和FAPI-55（均接近20%）。与FAPI-04相比，除FAPI-55外，所有化合物在所有指定时间点的血液放射性水平均相等或略高。注射后6小时内，FAPI-55的血放射性最高，但随后逐渐下降，24小时后达到与FAPI-04相似的水平。除FAPI-46外，所有衍生物的肝脏摄取均高于FAPI-04。注射后6小时内，FAPI-46的活性与FAPI-04相当，但其活性在24小时内逐渐降低。FAPI-04、-21和-35的肾脏活性相当，而FAPI-46和-55在所有指定时间点的肾脏活性均显著降低。比较注射后1至24小时的时间-活性曲线计算的AUC，结果显示FAPI-21的总体肿瘤摄取最高，其次是FAPI-46（表2）。基于总体AUC计算的肿瘤/器官比值表明，FAPI-21和FAPI-46的药代动力学总体上得到改善，除FAPI-35外，其他放射性示踪剂未见显著变化（图5，补充表3）。值得注意的是，FAPI-46的肿瘤/肝脏、肾脏和脑摄取比值显著增加。[2]

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生物分布[1]
注射后10分钟至3小时内对两名患者进行了检查，结果表明两种FAPI示踪剂均迅速达到稳定的生理生物分布。在正常组织中，注射后10分钟至3小时内变化甚微。使用68Ga-FAPI-2时，注射后1至3小时内肿瘤摄取平均下降75%；与注射后1至3小时相比，68Ga-FAPI-4的清除率较低，平均仅为25%（即肿瘤滞留时间更长）（图2，底部）。然而，在注射后1小时（也用于与18F-FDG进行比较），两种68Ga-FAPI示踪剂在肿瘤/背景比方面相当。[1] FAPI PET的定量肿瘤摄取与目前肿瘤PET的参考标准18F-FDG相似（18F-FDG的平均SUVmax为7.41，68Ga-FAPI-2为7.37；差异无统计学意义）。在胰腺癌、食管癌、肺癌、头颈癌和结直肠癌中，定量肿瘤摄取不劣于18F-FDG。相反，去分化甲状腺癌的¹⁸F-FDG摄取发生逆转，且未出现⁶⁸Ga-FAPI的积累（图3）。关于背景活性，⁶⁸Ga-FAPI-2在脑（0.32 vs. 11.01）、肝脏（1.69 vs. 2.77）和口腔/咽部黏膜（2.57 vs. 4.88）中的平均SUVmax显著降低，从而提高了胰腺癌和结直肠癌肝转移的对比度以及食管癌的成像清晰度（图3）。对于所有其他器官，⁶⁸Ga-FAPI-2和¹⁸F-FDG之间无显著差异（图4A）。

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FAPI-4的分子式为C₄₀H₅₄F₂N₁₀O₁₀，分子量为872.91 g/mol。其IUPAC名称为(S)-2,2',2''-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸。纯度通常≥95%。

关于FAPI-4的全面毒理学数据有限。该化合物仅供研究使用。处理该化合物时应遵循标准的实验室安全预防措施。

[1]. 68Ga-FAPI PET/CT: Biodistribution and Preliminary Dosimetry Estimate of 2 DOTA-Containing FAP-Targeting Agents in Patients with Various Cancers. J Nucl Med. 2019 Mar;60(3):386-392.

[2]. Development of Fibroblast Activation Protein-Targeted Radiotracers with Improved Tumor Retention. J Nucl Med. 2019 Oct;60(10):1421-1429.

癌相关成纤维细胞是肿瘤间质的重要组成部分，存在于超过90%的上皮癌中。丝氨酸蛋白酶成纤维细胞激活蛋白（FAP）的过表达使得基于抑制剂的放射性药物（FAPI）能够选择性地靶向多种肿瘤。在这些化合物中，FAPI-04近期被引入作为一种治疗性放射性示踪剂，并在癌症患者的多种FAP阳性肿瘤中显示出较高的摄取率。为了实现更高的剂量递送，从而提高治疗效果，研究人员设计了几种FAPI变体，以进一步增强这些示踪剂在肿瘤中的摄取和滞留。方法：采用有机化学方法合成了新型喹啉类放射性示踪剂，并使用表达FAP的HT-1080细胞进行了放射性配体结合实验。基于其体外性能，对荷HT-1080-FAP肿瘤的小鼠进行了小动物PET成像和生物分布研究。我们对8例癌症患者进行了临床PET成像，使用了最有前景的化合物。结果：与FAPI-04相比，15种FAPI衍生物中有11种在体外表现出更高的FAP结合能力。其中，7种化合物在荷瘤小鼠中显示出更高的肿瘤摄取。此外，大多数化合物的肿瘤/正常器官摄取比值均有所提高，从而获得了更高的图像对比度。值得注意的是，两种放射性示踪剂FAPI-21和FAPI-46的肿瘤/血液、肝脏、肌肉和肠道摄取比值均显著提高。在癌症患者的首次诊断应用中，两种放射性示踪剂在给药后10分钟内均显示出较高的肿瘤内摄取，但FAPI-21在口腔黏膜、唾液腺和甲状腺中的摄取更高。结论：FAPI骨架的化学修饰增强了大多数衍生物的FAP结合能力和药代动力学特性，从而获得了高对比度的图像。此外，在对健康组织损伤最小的情况下，可以输送更高剂量的放射性物质，这可能提高治疗效果。[2]

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FAPI-4 是一种强效的 FAP 抑制剂，用于癌症研究。⁶⁸Ga-FAPI-4 PET/CT 是一种很有前景的癌症成像诊断方法。FAPI-4 是一种很有前景的示踪剂，可用于恶性肿瘤的诊断成像和靶向治疗。研究人员利用 FAPI-4 研究肿瘤微环境、纤维化以及癌症的诊断和治疗策略。

C40H54F2N10O10

872.93

872.4

C, 55.04; H, 6.24; F, 4.35; N, 16.05; O, 18.33

2374782-02-0

138454803

White to off-white solid powder

1.46±0.1 g/cm3(Predicted)

1144.1±65.0 °C(Predicted)

-6.8

244

4

19

16

62

1580

1

FC1(C([H])([H])N(C(C([H])([H])N([H])C(C2C([H])=C([H])N=C3C([H])=C([H])C(=C([H])C=23)OC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N2C([H])([H])C([H])([H])N(C(C([H])([H])N3C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C(=O)O[H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C(=O)O[H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C(=O)O[H])C([H])([H])C3([H])[H])=O)C([H])([H])C2([H])[H])=O)=O)[C@]([H])(C#N)C1([H])[H])F

ICWDAESAANBIGG-LJAQVGFWSA-N

InChI=1S/C40H54F2N10O10/c41-40(42)21-29(22-43)52(28-40)34(53)23-45-39(61)31-4-5-44-33-3-2-30(20-32(31)33)62-19-1-6-46-15-17-51(18-16-46)35(54)24-47-7-9-48(25-36(55)56)11-13-50(27-38(59)60)14-12-49(10-8-47)26-37(57)58/h2-5,20,29H,1,6-19,21,23-28H2,(H,45,61)(H,55,56)(H,57,58)(H,59,60)/t29-/m0/s1

(S)-2,2',2''-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl)-2-oxoethyl)carbamoyl)quinolin-6-yl)oxy)propyl)piperazin-1-yl)-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triyl)triacetic acid

FAPI-04; FAPI 04; FAPI04; FAPI-4; FAPI-4; 2374782-02-0; DOTA-fapi-04; (S)-2,2',2''-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl)-2-oxoethyl)carbamoyl)quinolin-6-yl)oxy)propyl)piperazin-1-yl)-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triyl)triacetic acid; D7X5DKW7N9; FAPI-04; UNII-D7X5DKW7N9; SCHEMBL21257058; FAPI 4; FAPI4;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~114.56 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.86 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4 mg/mL (4.58 mM) in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。