FAPI-46

FAP (fibroblast activation protein)

在产生人 FAP 的 HT-1080 细胞中，FAPI-46（1-24 小时）短暂地与人 FAP 结合 [1]。

FAPI-46 (iv) 极大地改善了肝脏、肠道和肠道中肿瘤与食物的比例，从而促进了 PET 成像中的图像恢复 [1]。

细胞培养[1]
转染人FAP基因的HT-1080细胞，以及小鼠FAP和cd26转染的人胚胎肾细胞，在含有10%胎牛血清的Dulbecco修饰Eagle培养基中，在37°C/5%二氧化碳条件下培养。
对于放射性配体结合研究，将细胞接种于6孔板中，培养48 h，最终汇合率约为80%-90%（每孔120 - 20万个细胞）。用1 mL不含胎牛血清的新鲜培养基代替培养基。放射性标记的化合物添加到细胞培养,培养不同的间隔10分钟至24小时。竞争实验由同时暴露在无标号(10−5到10−10米)和放射性标记的化合物60分钟。细胞流出决心孵化后的细胞示踪60分钟。此后,放射性介质被移除,细胞被洗和孵化与非放射性介质1,2,4,24 h。在所有的实验中,细胞用1ml pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，然后用1.4 mL裂解缓冲液（0.3 m NaOH， 0.2%十二烷基硫酸钠）裂解。在γ-计数器中测定放射性，归一化到100万个细胞，并以施加剂量的百分比计算。每个实验进行3次，每个独立实验进行3次重复。

动物实验[1]
对于体内实验，将500万个HT-1080-FAP细胞皮下接种到8周龄BALB/c裸鼠右侧躯干。当肿瘤体积达到约1 cm³时，经尾静脉注射放射性标记化合物（小动物PET成像剂量为80 nmol/GBq；器官分布实验剂量为200 nmol/GBq）。体内阻断实验通过在注射前向放射性标记化合物中加入30 nmol未标记的FAPI进行。对于器官分布实验，分别在示踪剂给药后1、4、6和24小时处死动物（每个时间点n=3）。使用γ计数器测量所有解剖器官和血液中的放射性分布。结果以每克组织注射剂量百分比（%ID/g）表示。PET成像使用小动物PET扫描仪进行。在注射后最初的60分钟内，以列表模式进行动态扫描，随后在注射后120至140分钟进行静态扫描。使用三维有序子集期望最大化最大先验方法迭代重建图像，并将其转换为SUV图像。对于动态数据，重建了28帧：4 × 5秒、4 × 10秒、4 × 20秒、4 × 60秒、4 × 120秒、6 × 300秒和2 × 470秒。使用感兴趣区域技术进行定量分析，结果以SUV表示。所有动物实验均符合德国动物保护法（批准号 35-91185.81/G-158/15）[1]。

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临床 PET/CT 成像[1]
根据更新后的《赫尔辛基宣言》第 37 条（未经证实的临床干预措施）和德国《药品法》第 13 条第 (2b) 款的规定，出于医疗需要，对 8 名患者进行了 PET/CT 成像。使用 68Ga-FAPI-21 和 -46 进行静脉注射（FAPI-21 剂量为 20 nmol，210–267 MBq；FAPI-46 剂量为 216–242 MBq）。分别在示踪剂给药后 10 分钟、1 小时和 3 小时进行成像。 PET/CT扫描采用Biograph mCT Flow PET/CT扫描仪，参数如下：层厚5 mm，层间距3–4 mm，软组织重建核，CARE Dose。CT扫描后立即使用FlowMotion软件以0.7 cm/min的速度进行三维（200 × 200矩阵）全身PET扫描。发射数据已校正随机散射、散射和衰减。重建采用有序子集期望最大化算法，迭代2次，子集数21，并进行高斯滤波，横轴分辨率为5 mm（半高全宽）。衰减校正采用低剂量非增强CT数据。SUV值采用感兴趣区技术进行定量评估。数据经当地伦理委员会批准（批准号S016/2018）后进行回顾性分析。

血清稳定性[1]
将经处理的无溶剂放射性化合物（¹⁷⁷Lu-FAPI-21 和 ¹⁷⁷Lu-FAPI-46）在 37°C 下与人血清孵育。孵育一定时间后，取样，用乙腈沉淀去除蛋白质，离心，取上清液进行放射性高效液相色谱分析。补充图 1 显示，即使在 24 小时后，也仅检测到初始（放射性）峰，未观察到放射性降解产物或游离放射性。这些结果表明，这两种物质均未受到人血清酶成分的影响。

[1]. Development of Fibroblast Activation Protein-Targeted Radiotracers with Improved Tumor Retention. J Nucl Med. 2019 Oct;60(10):1421-1429.

[2]. Targeting fibroblast activation protein (FAP): next generation PET radiotracers using squaramide coupled bifunctional DOTA and DATA 5m chelators. EJNMMI Radiopharm Chem. 2020 Jul 29;5(1):19.

癌相关成纤维细胞是肿瘤间质的重要组成部分，存在于超过90%的上皮癌中。丝氨酸蛋白酶成纤维细胞活化蛋白（FAP）的过表达使得基于抑制剂的放射性药物（FAPI）能够选择性地靶向多种肿瘤。在这些化合物中，FAPI-04近期被引入作为一种诊疗一体化放射性示踪剂，并已证实其在癌症患者的不同FAP阳性肿瘤中具有较高的摄取率。为了实现更高剂量的递送，从而改善治疗效果，研究人员设计了多种FAPI变体，以进一步提高这些示踪剂在肿瘤中的摄取和滞留。方法：采用有机化学方法合成了新型喹啉类放射性示踪剂，并使用表达FAP的HT-1080细胞进行了放射性配体结合试验。根据其体外性能，对荷HT-1080-FAP肿瘤小鼠进行了小动物PET成像和生物分布研究。最有前景的化合物被用于8名癌症患者的临床PET成像。结果：与FAPI-04相比，15种FAPI衍生物中有11种在体外显示出更高的FAP结合能力。其中，7种化合物在荷瘤小鼠体内表现出更高的肿瘤摄取。此外，大多数化合物的肿瘤/正常器官摄取比值均有所提高，从而获得了对比度更高的图像。值得注意的是，两种放射性示踪剂FAPI-21和FAPI-46的肿瘤/血液、肝脏、肌肉和肠道摄取比值显著提高。在癌症患者中的首次诊断应用显示，两种放射性示踪剂在给药后10分钟内均表现出较高的肿瘤内摄取，但FAPI-21在口腔黏膜、唾液腺和甲状腺中的摄取更高。结论：FAPI骨架的化学修饰增强了大多数衍生物的FAP结合能力和药代动力学性质，从而获得了高对比度的图像。此外，在最大限度减少对健康组织损伤的同时，可以输送更高剂量的放射性物质，这可能改善治疗效果。[1]
背景：成纤维细胞活化蛋白 (FAP) 是一种脯氨酸选择性丝氨酸蛋白酶，在肿瘤基质和许多其他以组织重塑为特征的疾病病变中过度表达。2014 年，一种高效的 FAP 抑制剂（称为 UAMC1110）被开发出来，该抑制剂对 FAP 具有低纳摩尔级的亲和力，并且对相关酶（例如脯氨酰寡肽酶 (PREP) 和二肽基肽酶 (DPP)：DPP4、DPP8/9 和 DPP2）具有高选择性。最近，其他研究团队已采用这种抑制剂，通过偶联双功能螯合剂-连接剂系统来制备放射性药物。本文报道了以UAMC1110为药效团的含方酸（SA）的双功能螯合剂DATA5m和DOTA。我们分别对新型放射性药物DOTA.SA.FAPi和DATA5m.SA.FAPi及其非放射性衍生物进行了体外抑制FAP和PREP活性的表征，并使用镓-68进行了放射化学研究。此外，我们利用[68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi进行了初步的体内动物实验，并测定了其离体生物分布。结果表明：[68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi和[68Ga]Ga-DATA5m.SA.FAPi在10分钟内即可达到97%以上的放射化学产率，且在2小时内保持良好的稳定性。 DOTA.SA.FAPi 和 DATA5m.SA.FAPi 及其 natGa 和 natLu 标记衍生物对成纤维细胞活化蛋白 (FAP) 的亲和力极佳，IC50 值低至纳摩尔级（0.7-1.4 nM）。此外，所有五种化合物对相关蛋白酶 PREP 的亲和力均较低（IC50 值较高，为 1.7-8.7 μM）。在 HT-29 人结直肠癌异种移植小鼠模型中，对 [68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi 前体进行了首次体内 PET 成像动物实验，结果表明其在肿瘤中具有较高的积累（SUVmean 为 0.75），且背景信号较低，具有良好的应用前景。离体生物分布实验表明，注射后 60 分钟，肿瘤中的摄取量最高（5.2%ID/g），而健康组织中的摄取量总体较低。结论：本研究合成并生化研究了靶向成纤维细胞活化蛋白的新型 PET 放射性示踪剂。这些新型化合物的关键亚结构包括源自方酸基本基序的方酰胺连接单元、DOTA 和 DATA5m 双功能螯合剂以及 FAP 靶向部分。总之，这些新型 FAP 配体在进一步研究和开发以及首次人体应用方面都展现出良好的前景。[2]

C41H57F2N11O9

885.97

885.43

C, 55.58; H, 6.49; F, 4.29; N, 17.39; O, 16.25

2374782-04-2

139400499

Light yellow to yellow solid powder

1.45±0.1 g/cm3(Predicted)

1148.7±65.0 °C(Predicted)

-6.7

238

4

19

16

63

1620

1

CN(CCCN1CCN(CC1)C(=O)CN2CCN(CCN(CCN(CC2)CC(=O)O)CC(=O)O)CC(=O)O)C3=CC4=C(C=CN=C4C=C3)C(=O)NCC(=O)N5CC(C[C@H]5C#N)(F)F

SDBGUEFOSXNKBX-HKBQPEDESA-N

InChI=1S/C41H57F2N11O9/c1-47(30-3-4-34-33(21-30)32(5-6-45-34)40(63)46-24-35(55)54-29-41(42,43)22-31(54)23-44)7-2-8-48-17-19-53(20-18-48)36(56)25-49-9-11-50(26-37(57)58)13-15-52(28-39(61)62)16-14-51(12-10-49)27-38(59)60/h3-6,21,31H,2,7-20,22,24-29H2,1H3,(H,46,63)(H,57,58)(H,59,60)(H,61,62)/t31-/m0/s1

2-[4,7-bis(carboxymethyl)-10-[2-[4-[3-[[4-[[2-[(2S)-2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamoyl]quinolin-6-yl]-methylamino]propyl]piperazin-1-yl]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid

FAPI-46; 2374782-04-2; 59QC5DY68A; UNII-59QC5DY68A; (10-(2-(4-(3-((4-(((2-((2S)-2-Cyano-4,4-difluoro-1-pyrrolidinyl)-2-oxoethyl)amino)carbonyl)-6-quinolinyl)methylamino)propyl)-1-piperazinyl)-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetato(3-)-kappaN1,kappaN4,kappaN7,kappaN10)-; 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-10-[2-[4-[3-[[4-[[2-[(2S)-2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamoyl]quinolin-6-yl]-methylamino]propyl]piperazin-1-yl]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid; [10-[2-[4-[3-[[4-[[[2-[(2S)-2-Cyano-4,4-difluoro-1-pyrrolidinyl]-2-oxoethyl]amino]carbonyl]-6-quinolinyl]methylamino]propyl]-1-piperazinyl]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetato(3-)-kappaN1,kappaN4,kappaN7,kappaN10]-; SCHEMBL21257093;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~112.87 mM)
DMSO : ~100 mg/mL (~112.87 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5.75 mg/mL (6.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 57.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。