FAPI-46

FAP (fibroblast activation protein)
FAPI-46 targets fibroblast activation protein (FAP). FAP is a serine protease that is abundantly expressed in cancer-associated fibroblasts (CAFs) in over 90% of epithelial tumors. By binding to FAP, FAPI-46 allows for the visualization of FAP-positive tumors using PET imaging. FAP is also a key molecule in tissue fibrosis.

在表达人FAP的HT-1080细胞中，FAPI-46（1-24小时）可与人FAP瞬时结合[1]。体外实验表明，FAPI-46对FAP具有高亲和力和特异性。细胞摄取实验证实了其良好的FAP结合特异性。该化合物对FAP的亲和力通常通过表面等离子共振或结合实验在表达FAP的细胞上进行测定。这些体外活性支持其作为PET示踪剂用于FAP表达成像。

FAPI-46 (iv) 能显著改善肝脏、肠道和食管中肿瘤与食物的比例，从而增强 PET 成像的图像重建效果 [1]。体内研究表明，[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46 具有良好的 PET 成像药代动力学特性。它已被用于临床前和临床研究，用于多种癌症的成像，包括胰腺癌、胶质母细胞瘤，以及评估高血压诱导的组织改变中 FAP 的表达。[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46 PET 是一种新型的癌症成像工具。

体外FAP结合试验采用表达FAP的细胞系进行。将细胞与放射性标记的FAPI-46（例如⁶⁸Ga-FAPI-46）孵育。测量结合的放射性，并计算结合亲和力（Kd）。使用未标记的FAPI配体进行竞争性结合试验以验证特异性。此外，还进行了细胞摄取和内化研究。

细胞培养[1]
将转染人FAP基因的HT-1080细胞以及转染鼠FAP和CD26基因的人胚肾细胞，在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中，于37℃/5%二氧化碳条件下培养。
对于放射性配体结合研究，将细胞接种于6孔板中，培养48小时至最终汇合度达到约80%–90%（每孔120万至200万个细胞）。更换1 mL不含胎牛血清的新鲜培养基。将放射性标记化合物加入细胞培养物中，孵育10分钟至24小时不等。竞争实验中，同时用未标记（10⁻⁵至10⁻¹⁰ M）和放射性标记化合物处理细胞60分钟。细胞与示踪剂孵育60分钟后，测定细胞外排情况。随后，移除放射性培养基，洗涤细胞，并在非放射性培养基中分别培养1、2、4和24小时。在所有实验中，细胞均用1 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次，随后用1.4 mL裂解缓冲液（0.3 M NaOH，0.2%十二烷基硫酸钠）裂解。放射性通过γ计数器测定，并以100万个细胞为基准进行标准化，计算为应用剂量的百分比。每个实验重复3次，每个独立实验获得3个重复数据。

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使用FAP阳性细胞进行FAPI-46的体外细胞摄取实验。将细胞与放射性标记的FAPI-46在37°C下孵育。洗涤细胞后，测量细胞内化的放射性。通过使用过量的未标记配体（例如 DOTA-FAPI-04）进行阻断，可以证实摄取的特异性。摄取量以每毫克蛋白质所添加剂量的百分比表示。

动物实验[1]
对于体内实验，将500万个HT-1080-FAP细胞皮下接种到8周龄BALB/c裸鼠右侧躯干。当肿瘤体积达到约1 cm³时，经尾静脉注射放射性标记化合物（小动物PET成像剂量为80 nmol/GBq；器官分布实验剂量为200 nmol/GBq）。体内阻断实验通过在注射前向放射性标记化合物中加入30 nmol未标记的FAPI进行。对于器官分布实验，分别在示踪剂给药后1、4、6和24小时处死动物（每个时间点n=3）。使用γ计数器测量所有解剖器官和血液中的放射性分布。结果以每克组织注射剂量百分比（%ID/g）表示。PET成像使用小动物PET扫描仪进行。在注射后最初的60分钟内，以列表模式进行动态扫描，随后在注射后120至140分钟进行静态扫描。使用三维有序子集期望最大化最大先验方法迭代重建图像，并将其转换为SUV图像。对于动态数据，重建了28帧：4 × 5秒、4 × 10秒、4 × 20秒、4 × 60秒、4 × 120秒、6 × 300秒和2 × 470秒。使用感兴趣区域技术进行定量分析，结果以SUV表示。所有动物实验均符合德国动物保护法（批准号 35-91185.81/G-158/15）[1]。

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临床 PET/CT 成像[1]
根据更新后的《赫尔辛基宣言》第 37 条（未经证实的临床干预措施）和德国《药品法》第 13 条第 (2b) 款的规定，出于医疗需要，对 8 名患者进行了 PET/CT 成像。使用 68Ga-FAPI-21 和 -46 进行静脉注射（FAPI-21 剂量为 20 nmol，210–267 MBq；FAPI-46 剂量为 216–242 MBq）。分别在示踪剂给药后 10 分钟、1 小时和 3 小时进行成像。 PET/CT扫描采用Biograph mCT Flow PET/CT扫描仪，参数如下：层厚5 mm，层间距3–4 mm，软组织重建核，CARE Dose。CT扫描后立即使用FlowMotion软件以0.7 cm/min的速度进行全身三维PET扫描（矩阵200 × 200）。发射数据校正了随机散射、散射和衰减。重建采用有序子集期望最大化算法，迭代2次，子集数21，并进行高斯滤波，横轴分辨率为5 mm（半高全宽）。衰减校正采用低剂量非增强CT数据。SUV值采用感兴趣区（ROI）技术进行定量评估。本研究数据经当地伦理委员会批准（批准号 S016/2018）后进行回顾性分析。

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在携带 FAP 阳性肿瘤异种移植瘤的小鼠模型中开展了 FAPI-46 的体内成像研究。放射性标记化合物（例如 ⁶⁸Ga-FAPI-46）通过静脉注射给药。在注射后不同时间点进行 PET/CT 成像，以观察示踪剂的生物分布和肿瘤摄取情况。计算肿瘤与背景的比值以评估成像对比度。

血清稳定性[1]
将经处理的无溶剂放射性化合物（¹⁷⁷Lu-FAPI-21和¹⁷⁷Lu-FAPI-46）与人血清在37°C下孵育。孵育一定时间后，取样，用乙腈沉淀去除蛋白质，离心，取上清液进行放射性高效液相色谱分析。补充图1显示，即使24小时后，也仅检测到初始（放射性）峰，未观察到放射性降解产物或游离放射性。这些结果表明，这两种物质均未受到人血清酶成分的影响。

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FAPI-46的药代动力学数据表明，当用⁶⁸Ga标记时，其具有良好的PET成像药代动力学特性。该化合物的CAS号为2374782-04-2。药代动力学特性取决于所使用的特定放射性同位素和制剂。对于放射性标记化合物，生物分布和清除率通常在动物模型中进行评估。详细的药代动力学参数尚未得到广泛报道。

FAPI-46的毒性数据尚未得到充分报道。作为一种研究化合物，FAPI-46仅供研究用途，不得用于人体治疗。其毒性取决于用于标记的特定放射性同位素。需要进行标准的体外细胞毒性试验和体内耐受性研究才能进行全面的毒性评估。

[1]. Development of Fibroblast Activation Protein-Targeted Radiotracers with Improved Tumor Retention. J Nucl Med. 2019 Oct;60(10):1421-1429.

[2]. Targeting fibroblast activation protein (FAP): next generation PET radiotracers using squaramide coupled bifunctional DOTA and DATA 5m chelators. EJNMMI Radiopharm Chem. 2020 Jul 29;5(1):19.

癌相关成纤维细胞是肿瘤间质的重要组成部分，存在于超过90%的上皮癌中。丝氨酸蛋白酶成纤维细胞激活蛋白（FAP）的过表达使得基于抑制剂的放射性药物（FAPI）能够选择性地靶向多种肿瘤。在这些化合物中，FAPI-04近期被引入作为一种治疗性放射性示踪剂，并在癌症患者的多种FAP阳性肿瘤中显示出较高的摄取率。为了实现更高的剂量递送，从而提高治疗效果，研究人员设计了几种FAPI变体，以进一步增强这些示踪剂在肿瘤中的摄取和滞留。方法：采用有机化学方法合成了新型喹啉类放射性示踪剂，并使用表达FAP的HT-1080细胞进行了放射性配体结合实验。基于其体外性能，对荷HT-1080-FAP肿瘤的小鼠进行了小动物PET成像和生物分布研究。我们对8例癌症患者进行了临床PET成像，使用了最有前景的化合物。结果：与FAPI-04相比，15种FAPI衍生物中有11种在体外表现出更高的FAP结合能力。其中，7种化合物在荷瘤小鼠中显示出更高的肿瘤摄取。此外，大多数化合物的肿瘤/正常器官摄取比值均有所提高，从而获得了更高的图像对比度。值得注意的是，两种放射性示踪剂FAPI-21和FAPI-46的肿瘤/血液、肝脏、肌肉和肠道摄取比值均显著提高。在首次癌症患者的诊断应用中，两种放射性示踪剂在给药后10分钟内均显示出较高的肿瘤内摄取，但FAPI-21在口腔黏膜、唾液腺和甲状腺中的摄取更高。结论：FAPI骨架的化学修饰增强了大多数衍生物的FAP结合能力和药代动力学特性，从而获得了高对比度的图像。此外，该方法可在最大限度减少对健康组织损伤的同时输送更高剂量的放射性物质，从而可能提高治疗效果。[1]
背景：成纤维细胞激活蛋白 (FAP) 是一种脯氨酸选择性丝氨酸蛋白酶，在肿瘤基质和许多其他以组织重塑为特征的病变中过度表达。2014 年，一种高效的 FAP 抑制剂（命名为 UAMC1110）被开发出来，它对 FAP 具有低纳摩尔级的亲和力，并且对相关酶（例如脯氨酰寡肽酶 (PREP) 和二肽基肽酶 (DPP)：DPP4、DPP8/9 和 DPP2）具有高选择性。最近，其他研究团队利用该抑制剂通过双功能螯合剂-连接剂系统制备了放射性药物。本文报道了含有方酸 (SA) 的双功能螯合剂 DATA5m 和 DOTA，其中 UAMC1110 为药效团。我们对新型放射性药物 DOTA.SA.FAPi 和 DATA5m.SA.FAPi 及其非放射性衍生物进行了体外表征，以评估其对 FAP 和 PREP 活性的抑制作用，并利用镓-68 进行了放射化学研究。此外，我们还利用 [68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi 进行了初步的体内动物实验，并测定了其体外生物分布。结果表明，[68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi 和 [68Ga]Ga-DATA5m.SA.FAPi 在 10 分钟内放射化学产率均超过 97%，并保持了 2 小时的良好稳定性。DOTA.SA.FAPi、DATA5m.SA.FAPi 及其 natGa 和 natLu 标记的衍生物对成纤维细胞活化蛋白 (FAP) 表现出优异的亲和力，IC50 值低至纳摩尔级 (0.7–1.4 nM)。此外，所有五种化合物对相关蛋白酶PREP的亲和力均较低（IC50值较高，为1.7–8.7 μM）。在HT-29人结直肠癌异种移植小鼠模型中，[68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi前体首次用于体内PET成像动物实验，结果显示其在肿瘤中具有较高的积累（SUVmean = 0.75）和较低的背景信号，表明其具有良好的应用前景。体外生物分布实验表明，注射后60分钟，肿瘤中的摄取量最高（5.2% ID/g），而健康组织中的总体摄取量较低。结论：本研究合成并生化研究了靶向成纤维细胞活化蛋白的新型PET放射性示踪剂。这些新型化合物的关键亚结构包括源自鳞状酸基序的鳞状酰胺连接基、DOTA和DATA5m双功能螯合剂以及FAP靶向部分。总之，这些新型FAP配体展现出巨大的研究和开发潜力，并有望首次应用于人体。[2]

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FAPI-46（CAS 2374782-04-2）是一种喹啉类放射性药物，靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）。FAP在超过90%的上皮肿瘤中，于癌相关成纤维细胞中高表达。[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46已证实具有良好的PET成像药代动力学特性，是一种新型的癌症成像工具。本品仅供研究使用。

C41H57F2N11O9

885.97

885.43

C, 55.58; H, 6.49; F, 4.29; N, 17.39; O, 16.25

2374782-04-2

139400499

Light yellow to yellow solid powder

1.45±0.1 g/cm3(Predicted)

1148.7±65.0 °C(Predicted)

-6.7

238

4

19

16

63

1620

1

CN(CCCN1CCN(CC1)C(=O)CN2CCN(CCN(CCN(CC2)CC(=O)O)CC(=O)O)CC(=O)O)C3=CC4=C(C=CN=C4C=C3)C(=O)NCC(=O)N5CC(C[C@H]5C#N)(F)F

SDBGUEFOSXNKBX-HKBQPEDESA-N

InChI=1S/C41H57F2N11O9/c1-47(30-3-4-34-33(21-30)32(5-6-45-34)40(63)46-24-35(55)54-29-41(42,43)22-31(54)23-44)7-2-8-48-17-19-53(20-18-48)36(56)25-49-9-11-50(26-37(57)58)13-15-52(28-39(61)62)16-14-51(12-10-49)27-38(59)60/h3-6,21,31H,2,7-20,22,24-29H2,1H3,(H,46,63)(H,57,58)(H,59,60)(H,61,62)/t31-/m0/s1

2-[4,7-bis(carboxymethyl)-10-[2-[4-[3-[[4-[[2-[(2S)-2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamoyl]quinolin-6-yl]-methylamino]propyl]piperazin-1-yl]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid

FAPI-46; 2374782-04-2; 59QC5DY68A; UNII-59QC5DY68A; (10-(2-(4-(3-((4-(((2-((2S)-2-Cyano-4,4-difluoro-1-pyrrolidinyl)-2-oxoethyl)amino)carbonyl)-6-quinolinyl)methylamino)propyl)-1-piperazinyl)-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetato(3-)-kappaN1,kappaN4,kappaN7,kappaN10)-; 2-[4,7-bis(carboxymethyl)-10-[2-[4-[3-[[4-[[2-[(2S)-2-cyano-4,4-difluoropyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamoyl]quinolin-6-yl]-methylamino]propyl]piperazin-1-yl]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetic acid; [10-[2-[4-[3-[[4-[[[2-[(2S)-2-Cyano-4,4-difluoro-1-pyrrolidinyl]-2-oxoethyl]amino]carbonyl]-6-quinolinyl]methylamino]propyl]-1-piperazinyl]-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetato(3-)-kappaN1,kappaN4,kappaN7,kappaN10]-; SCHEMBL21257093;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~112.87 mM)
DMSO : ~100 mg/mL (~112.87 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5.75 mg/mL (6.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 57.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。