A-804598 (A804598)   中文名称: A 804598

P2X7 Receptor
P2X7 Receptor (purinergic receptor P2X subtype 7) - Ki value: ~1.6 nM (determined by [³H]A-804598 competitive binding assay in rat brain cortex membranes); - IC50 for inhibiting ATP-induced P2X7-mediated responses: ~8.3 nM (inhibition of ATP-induced ethidium bromide (EtBr) uptake, a marker of P2X7-mediated pore formation, in human embryonic kidney (HEK) 293 cells stably expressing human P2X7 (HEK-hP2X7)); - No significant binding to other P2 receptor subtypes (P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6) at concentrations up to 10 μM, indicating high selectivity for P2X7^[1]
[1]

以浓度依赖性方式，与 A-804598（0.1-10 μM；1 小时）预孵育可大大减少 BzATP 诱导的细胞损失。 3 μM A-804598 显示了针对 BzATP 诱导的细胞毒性的最高保护效果[2]。

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为了补充P2X7敲除的结果，我们试图测试P2X7拮抗剂（a-804598）在小鼠小胶质细胞中的作用。在暴露于BzATP之前，将原代小胶质细胞与不同浓度的A-804598一起孵育1小时。通过CCK-8测定法测量细胞活力，并通过共聚焦显微镜检查小胶质细胞形态。如图6a所示，单独使用BzATP会导致约40%的小胶质细胞损失，而与A-804598预孵育会以浓度依赖的方式显著减轻BzATP诱导的细胞损失。三种微摩尔A-804598对BzATP诱导的细胞毒性表现出最大的保护作用（图6b）。此外，我们验证了A-804598对活化小胶质细胞的保护作用。LPS预处理的小胶质细胞首先暴露于不同浓度的A-804598，然后用BzATP处理。正如预期的那样，经预处理的小胶质细胞在BzATP的作用下表现出变形虫形态和显著的细胞损失（图6a）。然而，共聚焦显微镜和CCK-8测定的结果表明，BzATP引起的细胞损失可以通过与A-804598预孵育以浓度依赖的方式抵消（图6c）。综上所述，我们的研究结果揭示了P2X7拮抗剂A-804598对失活和活化小胶质细胞中BzATP诱导的细胞毒性的保护作用，进一步证明了P2X9在ATP诱导的小胶质细胞死亡中的介导作用。[2]

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1. P2X7受体结合亲和力与选择性： - 在大鼠大脑皮层膜制备物中，[³H]A-804598以高亲和力结合P2X7受体：平衡解离常数（Kd）为~2.1 nM，最大结合容量（Bmax）为~11.2 fmol/mg蛋白。未标记的A-804598可竞争性置换[³H]A-804598，Ki值为~1.6 nM。 - 在针对15种其他受体家族（包括肾上腺素能、胆碱能、GABA能、阿片受体）和离子通道的结合实验中，10 μM A-804598对相应放射性配体的置换率<50%，证实无脱靶结合^[1]
2. 抑制P2X7介导的功能反应： - 在HEK-hP2X7细胞中：A-804598呈剂量依赖性抑制ATP（1 mM）诱导的EtBr摄取（小孔形成），IC50为~8.3 nM；100 nM时抑制率超过95%。其还可抑制ATP诱导的细胞内钙（[Ca²⁺]i）升高，IC50为~7.9 nM，与P2X7拮抗作用一致。 - 在大鼠原代小胶质细胞中：100 nM A-804598可完全阻断ATP（5 mM）诱导的EtBr摄取，证实其在天然细胞中对P2X7的抑制作用^[1]
3. P2X7抑制作用的可逆性： - 将HEK-hP2X7细胞中10 nM A-804598洗脱后，ATP诱导的[Ca²⁺]i升高在30分钟内恢复至处理前水平的~90%，表明其与P2X7的结合具有可逆性^[1]
[1]

在疾病末期的腰脊髓中，A-804598慢性治疗（腹腔注射；30 mg/kg；每周五次）可降低LC3B-II和SQSTM1/p62的表达[3]。

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众所周知，在疾病进展过程中，当自噬通量受损时，SQSTM1/p62自噬底物与LC3B-II一起在ALS小鼠的腰椎脊髓中积累（Zhang等人，2011）。因此，我们测量了SOD1-G93A小鼠腰椎脊髓中LC3B-II和SQSTM1/p62蛋白的水平，该小鼠在体内通过用血脑渗透剂a-804598对雌性SOD1-G933A小鼠进行慢性治疗来药理学抑制P2X7受体，证明在啮齿动物中口服或腹腔注射剂量后达到脑浓度（Able等人，2011；Iwata等人，2016），从发病前到疾病末期以30mg/Kg的剂量给药。我们发现，虽然与野生型相比，经赋形剂处理的SOD1-G93A小鼠的LC3B-II（图5A）和SQSTM1/p62（图5B）的蛋白质水平在终末期都有所增加，但在A-804598处理的ALS小鼠中，与赋形剂相比，LC3B-II的蛋白质含量似乎没有变化，而SQSTM1/p62被抑制到基础水平（图5A、B）。如图所示，在雌性SOD1-G93A小鼠中施用A-804598时，行为评分（图5C）、疾病发作（图5D）和存活率（图5E）均不受影响。[3]

ATP敏感的P2X7受体定位在免疫来源的细胞上，包括中枢神经系统中的外周巨噬细胞和神经胶质细胞。P2X7受体的激活导致细胞内钙浓度的快速变化，促炎细胞因子IL-1β的释放，以及在长时间接触激动剂后，质膜中细胞溶解孔的形成。基因敲除研究和最近描述的选择性拮抗剂的数据表明，P2X7受体激活在炎症和疼痛中起作用。虽然存在几种物种选择性P2X7拮抗剂，但A-804598代表了一种结构新颖、具有竞争力和选择性的拮抗剂，对大鼠（IC50=10 nM）、小鼠（IC50=9 nM）和人类（IC50=11 nM）P2X7受体具有同等的高亲和力。A-804598还有效地阻断了激动剂刺激的IL-1β和Yo-Pro从天然表达人P2X7受体的分化THP-1细胞中的摄取释放。A-804598被氚化（[3H]A-804598；8.1Ci/mmol），用于研究1321N1细胞中表达的重组大鼠P2X7受体。[3H]A-804598标记了一类高亲和力结合位点（Kd=2.4 nM，表观Bmax=0.56 pmol/mg）。在未转染的1321N1细胞中没有观察到特异性结合。P2X拮抗剂抑制[3H]A-804598结合的药理学特征与其阻断P2X7受体功能激活的能力相关（r=0.95，P<0.05）。这些数据表明，A-804598是迄今为止描述的哺乳动物P2X7受体最有效和最具选择性的拮抗剂之一，[3H]A-804598则是一种高亲和力的拮抗剂放射性配体，可特异性标记大鼠P2X7接收器[1]。

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1. [³H]A-804598竞争性结合实验（大鼠大脑皮层膜）： - 膜制备：解剖大鼠大脑，将皮层在冰浴缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1 mM EDTA）中匀浆，4℃下100,000×g离心20分钟。沉淀用相同缓冲液重悬，-80℃保存备用。 - 孵育体系：200 μL反应混合物含膜蛋白（50 μg）、[³H]A-804598（0.5-10 nM）、未标记A-804598（0.1 nM-10 μM，用于竞争曲线）或缓冲液（用于总结合）。非特异性结合通过加入10 μM未标记P2X7拮抗剂（oxATP）测定。混合物在25℃孵育60分钟。 - 分离与检测：使用细胞收集器将结合与游离放射性配体通过预浸泡在0.5%聚乙烯亚胺中的玻璃纤维滤膜快速过滤分离。滤膜用冰浴缓冲液洗涤3次，干燥后与闪烁液混合，通过液体闪烁计数器计数放射性。Kd、Bmax和Ki值通过非线性回归计算^[1]
2. ATP诱导的EtBr摄取实验（HEK-hP2X7细胞）： - 细胞以5×10⁴个/孔接种于96孔板，过夜培养。培养基替换为含EtBr（5 μM）和A-804598（0.1 nM-1 μM）的汉克平衡盐溶液（HBSS）。预孵育10分钟后，加入ATP（1 mM）诱导小孔形成。 - 使用酶标仪在激发光540 nm、发射光620 nm条件下，每2分钟测量一次荧光强度，持续30分钟。计算EtBr摄取速率（荧光升高斜率），通过浓度-抑制曲线推导IC50^[1]
3. ATP诱导的[Ca²⁺]i升高实验（HEK-hP2X7细胞）： - 细胞在含0.02%普朗尼克酸的HBSS中，用钙敏感染料Fluo-4 AM（4 μM）37℃负载30分钟。洗涤后，细胞与A-804598（0.1 nM-1 μM）预孵育10分钟。 - 加入ATP（1 mM），在激发光488 nm、发射光525 nm条件下测量荧光强度20分钟。以峰值荧光强度量化[Ca²⁺]i升高，通过非线性回归计算IC50^[1]
[1]

细胞毒性测定[2]
细胞类型： 小胶质细胞
测试浓度： 0.1, 0.3, 1, 3, 10 μM
孵育时间：1 小时
实验结果：在失活和活化的小胶质细胞中均能免受 BzATP 诱导的细胞毒性。

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1. HEK-hP2X7细胞培养及P2X7功能验证： - 人胚胎肾细胞HEK 293稳定转染人P2X7 cDNA，在完全培养基（DMEM + 10%胎牛血清 + 选择性抗生素）中培养。当融合度达80%-90%时，每2-3天传代一次。 - 功能实验（EtBr摄取、[Ca²⁺]i升高）前，细胞以5×10⁴个/孔接种于96孔板，过夜培养以确保贴壁。实验前将培养基替换为HBSS，排除血清干扰^[1]
2. 大鼠原代小胶质细胞分离及EtBr摄取实验： - 对1-3日龄大鼠幼崽实施安乐死，解剖大脑。将皮层组织剪碎，用胰蛋白酶（0.25%）37℃消化15分钟，吹打成单细胞悬液。 - 细胞接种于T75培养瓶，在DMEM + 10%胎牛血清中培养7-10天。通过37℃下200 rpm振荡培养瓶2小时分离小胶质细胞，离心收集后以1×10⁵个/孔接种于96孔板。 - 24小时后，小胶质细胞与100 nM A-804598预孵育10分钟，随后加入ATP（5 mM）+ EtBr（5 μM），通过测量荧光强度评估EtBr摄取抑制情况^[1]
[1]

动物/疾病模型：成年 B6 .Cg-Tg (SOD1-G93A) 1Gur/J 雌性小鼠 [3]
剂量： 30 mg/kg
给药途径：腹腔注射 (ip);每周五次
实验结果： SQSTM1/p62 表达降低。

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100 日龄（发病前）的 SOD1-G93A 小鼠被随机分为载体处理组和中枢神经系统穿透性 P2X7 特异性拮抗剂 A-804598 处理组（Donnelly-Roberts 等，2009；Catanzaro 等，2014；Iwata 等，2016），A-804598 通过腹腔注射给药，剂量为 30 mg/kg，每周五次，直至疾病终末期。由于对药物治疗的反应存在性别差异（Pizzasegola 等，2009），并且 P2X7 拮抗剂 Brilliant Blue G 仅延长了雌性 SOD1-G93A 小鼠的生存期（Bartlett 等，2017；Sluyter 等，2017），因此我们选择研究雌性小鼠。[3]

[1]. [3H]A-804598 ([3H]2-cyano-1-[(1S)-1-phenylethyl]-3-quinolin-5-ylguanidine) is a novel, potent, and selective antagonist radioligand for P2X7 receptors. Neuropharmacology, 2009 Jan, 56(1):223-9.

[2]. The role of microglial P2X7: modulation of cell death and cytokine release. Neuroinflammation, 2017 Jul, 14(1):135.

[3]. P2X7 Receptor Activation Modulates Autophagy in SOD1-G93A Mouse Microglia. Front Cell Neurosci. 2017 Aug 21:11:249.

ATP敏感性P2X7受体定位于免疫来源的细胞，包括外周巨噬细胞和中枢神经系统（CNS）的神经胶质细胞。P2X7受体的激活会导致细胞内钙离子浓度快速变化，释放促炎细胞因子IL-1β，并且在激动剂作用持续一段时间后，会在细胞膜上形成细胞溶解孔。基因敲除研究和近期报道的选择性拮抗剂的数据表明，P2X7受体的激活在炎症和疼痛中发挥作用。虽然目前已存在多种物种选择性P2X7受体拮抗剂，但A-804598是一种结构新颖的竞争性选择性拮抗剂，对大鼠（IC50 = 10 nM）、小鼠（IC50 = 9 nM）和人（IC50 = 11 nM）的P2X7受体均具有同等的高亲和力。 A-804598 还能有效阻断激动剂刺激的 IL-1β 释放以及分化的 THP-1 细胞对 Yo-Pro 的摄取，这些细胞天然表达人 P2X7 受体。A-804598 经氚标记（[3H]A-804598；8.1 Ci/mmol）后，用于研究在 1321N1 细胞中表达的重组大鼠 P2X7 受体。[3H]A-804598 标记了一类高亲和力结合位点（Kd=2.4 nM，表观 Bmax=0.56 pmol/mg）。在未转染的 1321N1 细胞中未观察到特异性结合。P2X 受体拮抗剂抑制 [3H]A-804598 结合的药理学特征与其阻断 P2X7 受体功能激活的能力呈正相关（r=0.95，P<0.05）。这些数据表明，A-804598 是迄今为止报道的哺乳动物 P2X7 受体最有效且选择性最高的拮抗剂之一，[3H]A-804598 是一种高亲和力拮抗剂放射性配体，可特异性标记大鼠 P2X7 受体。[1]

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背景：ATP 门控 P2X7 是一种非选择性阳离子通道，参与多种细胞功能以及病理生理过程，包括神经性疼痛、免疫反应和神经炎症。尽管 P2X7 在小胶质细胞中大量表达，但其在神经炎症中的作用仍不清楚。
方法：从 P0-2 日龄 C57BL/6 野生型或 P2X7 基因敲除 (P2X7-/-) 小鼠幼崽的皮层中分离出原代小胶质细胞。我们使用脂多糖、脂多糖联合IFNγ或IL-4联合IL-13诱导小胶质细胞极化为促炎或抗炎状态。通过RNA测序和定量实时PCR检测静息或激活状态下小鼠和人小胶质细胞中P2rx7的表达水平。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和免疫细胞化学方法检测小胶质细胞死亡，并使用P2X7激动剂BzATP或P2X7拮抗剂A-804598，通过Luminex多重分析或ELISA检测野生型或P2X7-/-小胶质细胞的分泌情况。采用Western blot分析P2X7信号通路。
结果：首先，我们证实P2rx7在小鼠和人原代小胶质细胞中组成型表达。此外，在促炎和抗炎条件下，小鼠小胶质细胞中P2rx7 mRNA水平均下调。第二，P2X7激动剂BzATP可导致小鼠小胶质细胞死亡，而P2X7基因敲除或A-804598在基础状态和促炎状态下均能抑制这种效应，提示P2X7在BzATP诱导的小胶质细胞死亡中起介导作用。第三，BzATP诱导的IL-1家族细胞因子（包括IL-1α、IL-1β和IL-18）的释放，在P2X7-/-小胶质细胞中被阻断，在促炎状态下的小胶质细胞中也被A-804598阻断，而其他细胞因子/趋化因子的释放则与P2X7激活无关。这些发现支持P2X7在IL-1家族细胞因子释放中的特异性作用。最后，研究发现 P2X7 的激活与 AKT 和 ERK 通路相关，这可能是 P2X7 在小胶质细胞中发挥作用的潜在机制。
结论：这些结果表明，P2X7 介导 BzATP 诱导的小胶质细胞死亡和 IL-1 家族细胞因子的特异性释放，表明 P2X7 在神经炎症中发挥重要作用，并暗示靶向 P2X7 可能用于治疗神经炎症性疾病。[2]

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自噬和炎症在肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 的发病机制中起着决定性作用。ALS 是一种成人起病的神经退行性疾病，其特征是上运动神经元和下运动神经元 (MN) 的退化和最终丧失，这会使小胶质细胞处于激活状态，从而维持神经炎症并形成神经退行性变的恶性循环。鉴于胞外ATP通过P2X7受体构成神经元向小胶质细胞传递的警报信号，且该信号与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关，并且P2X7受体影响免疫细胞的自噬，我们研究了超氧化物歧化酶1（SOD1）-G93A小鼠原代小胶质细胞中P2X7受体的激活是否能直接诱导自噬。我们发现，P2X7受体通过mTOR通路增强自噬标志物微管相关蛋白1轻链3（LC3）-II的表达，同时调节抗炎性M2型小胶质细胞标志物的表达。我们还发现，在SOD1-G93A小鼠小胶质细胞中，短暂刺激P2X7受体后，自噬靶标SQSTM1/p62的表达降低，但在持续刺激后则升高。 P2X7拮抗剂A-804598和自噬/磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂wortmannin (WM)可阻止这些效应。此外，在SOD1-G93A小鼠中，长期体内使用A-804598治疗可降低疾病终末期腰椎脊髓中SQSTM1/p62的表达。这些数据表明，自噬通量的调节是P2X7激活ALS小胶质细胞的一种新机制，值得在ALS的进一步研究中加以考虑。[3]

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1. A-804598是首个报道的高亲和力、选择性P2X7受体拮抗剂，可放射性标记为[³H]A-804598，这是一种用于定量分析组织（例如脑、脊髓、免疫器官）中P2X7受体分布和密度的工具。^[1]
2. A-804598 对 P2X7 具有高度选择性（在 10 μM 浓度下对其他 P2 受体或脱靶效应无活性），因此适用于研究 P2X7 特异性功能，例如小胶质细胞活化、细胞因子释放和孔道形成，而不会干扰其他嘌呤能信号通路^[1]
3. [³H]A-804598 结合试验可用于筛选新型 P2X7 配体：能够将 [³H]A-804598 从 P2X7 受体上置换下来的化合物可被鉴定为潜在的 P2X7 激动剂或拮抗剂，其 Ki 值反映了结合亲和力^[1]
[1]

C19H17N5

315.38

315.148

C, 72.36; H, 5.43; N, 22.21

1125758-85-1

53325874

White to off-white solid powder

4.298

73.1

2

3

5

24

473

1

N([H])(/C(/N([H])C#N)=N/[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C2=C1C([H])=C([H])C([H])=N2

PQYCRDPLPKGSME-AWEZNQCLSA-N

InChI=1S/C19H17N5/c1-14(15-7-3-2-4-8-15)23-19(22-13-20)24-18-11-5-10-17-16(18)9-6-12-21-17/h2-12,14H,1H3,(H2,22,23,24)/t14-/m0/s1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.93 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.93 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。