Ac-YVAD-cmk

Caspase-1

Ac-YVAD-cmk（40 μM 或 80 μM）在体外可降低活化星形胶质细胞中 IL-1β 和 IL-18 的表达 [2]。

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胱天蛋白酶-1抑制剂抑制酒精诱导的焦亡和炎症[1]
由于酒精治疗可诱导焦亡，接下来我们检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1抑制剂N-Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲基酮（Ac-YVAD CMK）对食管炎焦亡和炎性细胞因子的影响。我们首先需要阐明Ac-YVAD CMK对胱天蛋白酶-1的抑制作用。因此，我们进行了免疫荧光测定[图4A]。结果表明，Ac-YVAD-CMK和caspase-1 siRNA均能显著抑制caspase-1的表达水平。Ac-YVAD CMK也抑制了由焦亡诱导的细胞死亡[图4B]。此外，qRT-PCR和蛋白质印迹显示，该试剂可以有效抑制胱天蛋白酶-1的表达，类似于siRNA[图4C&4D]。

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Ac-YVAD CMK在体外降低活化小胶质细胞中IL-1β和IL-18的表达[2]
通过摇动细胞培养瓶纯化小胶质细胞，导致细胞粘附差异，之后凝血酶可以通过处理24小时有效激活静息的小胶质细胞 h[17]。凝血酶激活的小胶质细胞中NLRP3和IL-1β/IL-18的mRNA表达增加（图1a）。高浓度Ac-YVAD CMK处理（40μmol/L或80 μmol/L）显著降低了IL-1β/IL-18的mRNA水平。此外，western blot显示，凝血酶激活的小胶质细胞组NLRP3、caspase-1（p20）、成熟IL-1β/IL-18的蛋白水平高于对照组。与此同时，40 与凝血酶激活的小胶质细胞组相比，μmol/L剂量的Ac-YVAD-CMK显著降低了胱天蛋白酶-1（p20）和成熟IL-1β/IL-18的蛋白水平（图1b-f）。

成熟 IL-1β/IL-18 对数秩分析显示，与 ICH 组相比，Ac-YVAD-CMK（ac-YVAD-cmk 接受剂量 12.5 μMol/kg）显着降低了测试结果，从 83% 降至 33% 。 Ac-YVAD-CMK 治疗（1 μg/staple；SD stack；注射到左心室）显着降低 caspase-1 (p20) 的蛋白质水平。

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酒精积聚会引发体内焦亡[1]
为了进一步证实饮酒可以通过焦亡作用于食管炎，我们完成了动物实验。我们选择了9只6到8周大的Balb/c小鼠，并将其分为三组。第一组给予生理盐水，第二组给予1%酒精，第三组给予相同酒精浓度和抑制剂Ac-YVAD CMK。所有三组均通过灌胃给药。首先，我们分离了这三组的食管上皮组织，形成苏木精和伊红（HE）染色[图5A]。在这三组中检测到炎性细胞逃逸，结果显示乙醇组小鼠食管黏膜炎症显著增加，然后胱天蛋白酶-1抑制剂治疗组减少。接下来，我们进行了免疫组织化学检测caspase-1、IL-1β和IL-18的表达，结果表明酒精处理激活了这三种蛋白的表达；然而，抑制剂显著逆转了表达的增加[图5B-D]。接下来，我们从所有三组中提取食管上皮细胞，收集全部核酸和蛋白质，检测胱天蛋白酶-1、IL-1β和IL-18的mRNA[图5E]和蛋白质表达水平[图5F]。结果表明，饮酒可诱导食管炎中caspase-1的激活；然而，Ac-YVAD-CMK可以显著抑制IL-1β和IL-18的激活，减少炎症反应，大大缓解食管炎的进展。

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Ac-YVAD CMK改善脑出血后的神经功能并减轻脑水肿[2]
为了评估ICH后Ac-YVAD CMK的效果，在24小时进行了mNSS h ICH后（图2a）。mNSS测试的结果显示，与ICH组相比，抑制剂治疗组（Ac-YVAD cmk）在24小时时的神经损伤程度显著降低 脑出血后h（9.33± 1.21 与ICH组相比，11.00 ± 1.79; P < 0.05),72岁时也得到了类似的结果 脑出血后h（7.17± 1.17 与ICH组相比，8.50 ± 1.52; P < 0.05). 同时，为了研究Ac-YVAD cmk是否可以减轻脑水肿，我们监测了实验组24小时的脑含水量 h ICH后。我们发现，与ICH组相比，抑制剂治疗组在24小时时脑水肿减轻 不同部位脑出血后h（81.20± 0.61% 与ICH组相比，82.53 ± 0.75%; P < 0.01) （图2b）。

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Ac-YVAD CMK减轻了脑出血后胱天蛋白酶-1介导的炎症反应[2]
为了研究Ac-YVAD-CMK的抗炎作用，我们在24小时时测量了受损半球中NLRP3、胱天蛋白酶-1（p20）、促炎因子（IL-1β和IL-18）的蛋白水平 h通过western blot检测ICH后。结果显示，与正常组或假手术组相比，血肿周围NLRP3、caspase-1（p20）、成熟IL-1β/IL-18的蛋白水平显著升高，而Ac-YVAD cmk治疗（Ac-YVAD-cmk剂量：1 μg/大鼠）与ICH组相比，显著降低了胱天蛋白酶-1（p20）、成熟IL-1β/IL-18的蛋白质水平（图3）。然后，我们通过免疫组织化学检测了24小时血肿周围胱天蛋白酶-1（p20）和成熟IL-1β/IL-18的蛋白水平 h和72 h ICH后，确认上述结果并进行长期观察（图4a-c）。此外，我们发现Ac-YVAD cmk可以通过24小时的H&E染色减少血肿周围炎性细胞的浸润 h和72 ICH后h（图4d-e）。

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Ac-YVAD CMK缓解脑出血后小胶质细胞浸润[2]
小胶质细胞活化是脑出血后病理变化的重要特征。如图5所示，我们发现，与ICH组相比，Ac-YVAD-cmk在24小时时可以通过免疫组织化学显著减轻血肿周围的小胶质细胞浸润 h（28.17± 3.82% 与ICH组相比，45.50 ± 4.39%; P < 0.05) or 72 ICH后h。 (38.83 ± 5.42% 与ICH组相比，75.00 ± 8.27%; P < 0.01) 两组在各时间点均与正常组进行比较（P < 0.01).

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在内毒素血症的双盲大鼠模型中，研究了乙酰酪基缬氨酸天冬氨酸氯甲基酮（Ac-YVAD-CMK）对死亡率、白细胞和血小板计数以及细胞因子水平的影响，这是一种不可逆的胱天蛋白酶-1（IL-1β转换酶，ICE）抑制剂。对麻醉大鼠静脉（i.v.）推注脂多糖（LPS）（25-75mg kg（-1），每组n=12），在8小时内诱导死亡率呈剂量依赖性增加（LD（50）=48mg kg（-1））。在此期间，动物出现白细胞减少和血小板减少。血清中的IL-β、IL-6和TNF-α水平显著上升。使用Log-Rank分析，用12.5微摩尔kg（-1）剂量的ac YVAD cmk预处理大鼠，死亡率从83%显著降低到33%。然而，与LPS药物载体组相比，Ac-YVAD CMK没有改变血细胞计数或细胞因子谱。这些数据证实了胱天蛋白酶-1抑制在改变内毒素炎症反应中的潜在重要性。在脓毒症的不同实验范式中，需要进一步研究胱天蛋白酶-1抑制、细胞因子产生和动物存活之间的关系[3]。

细胞处理和体外实验组[2]
小胶质细胞（1× 105) 用胱天蛋白酶-1抑制剂Ac-YVAD-CMK（用DMSO溶解）刺激1 h.以10μg/ml的终浓度加入凝血酶 U/mL激活小胶质细胞24小时 h.实验分为三组：（i）对照组，小胶质细胞单独培养。（ii）凝血酶激活组，用凝血酶培养24小时的小胶质细胞 h.（iii）抑制剂治疗组，用DMSO溶解的Ac-YVAD-CMK刺激小胶质细胞1小时 h、 然后用凝血酶激活24小时 h.

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MTT法[1]
将细胞接种到96孔板中，并如前所述进行处理。处理后，向每个孔中加入10μl MTT试剂（0.5mg/ml），并在37°C下孵育4小时。孔中的甲嗪颗粒用150μl二甲亚砜（DMSO）溶解，并使用酶标仪测量570nm处的吸光度。

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HE染色[1]
苏木精伊红（HE）染色观察组织学变化。组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。将样品切成5μm厚的切片，用HE染色。

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免疫荧光[1]
将细胞用PBS洗涤三次，然后在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。再次用PBS洗涤细胞三次，并在室温下使用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭30分钟。然后将细胞在4°C下与在阻断缓冲液中稀释的第一抗体和在室温下与第二抗体孵育1小时。通过稀释度为1:200的单克隆抗天冬氨酸蛋白酶1抗体和稀释度为1:1000的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG抗体检测Caspase-1。然后用PBS洗涤细胞三次。使用Axiovert 200荧光显微镜拍摄图像。

药物给药和脑室内注射[2]
caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK溶于DMSO，并用无菌生理盐水进一步稀释，使DMSO的最终浓度<0.2%。在诱导脑出血前30分钟，使用5 μL针头将药物Ac-YVAD-CMK注射到左侧脑室（坐标：前囟后1.0 mm，侧1.5 mm，腹侧4.5 mm）。对照组注射等体积的DMSO（溶于无菌生理盐水）。实验分为四组：（i）正常组。（ii）假手术组，假手术大鼠在左侧纹状体注射2 μL无菌生理盐水。（iii）脑出血组。 （iii）抑制剂治疗组，将Ac-YVAD-CMK以1 μg/只的剂量注射到ICH大鼠的左侧脑室，Ac-YVAD-CMK的浓度为1 μg/μL。

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动物被随机分为四组，每只动物分别接受含2.8% DMSO的PBS（第1组，对照组，n=12）、caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK，剂量分别为1.25 μmol kg−1（第2组，n=12）、6.25 μmol kg−1（第3组，n=12）或12.5 μmol kg−1（第4组，n=12）。注射Ac-YVAD-CMK 30分钟后，通过静脉注射65 mg kg−1脂多糖(LPS) (=LD80)诱导内毒素血症。采集最后一份血样后，将存活的动物处死。[3]

[1]. Alcohol accumulation promotes esophagitis via pyroptosis activation. Int J Biol Sci. 2018;14(10):1245-1255. Published 2018 Jul 13.

[2]. Ac-YVAD-cmk improves neurological function by inhibiting caspase-1-mediated inflammatory response in the intracerebral hemorrhage of rats. Int Immunopharmacol. 2019;75:105771.

[3]. Caspase-1-inhibitor ac-YVAD-cmk reduces LPS-lethality in rats without affecting haematology or cytokine responses. Br J Pharmacol. 2000;131(3):383-386.

Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-氯甲基酮是一种四肽，由L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸和L-天冬氨酸通过肽键连接而成，其氨基末端被乙酰基取代，羧基末端被氯甲基取代。它具有多种功能，包括作为EC 3.4.22.36（caspase-1）抑制剂、神经保护剂和肾脏保护剂。它是一种四肽，也是一种有机氯化合物。其功能与N-乙酰-L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸和L-天冬氨酸相关。

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胃食管反流会损害远端食管的黏膜屏障，使鳞状上皮长期暴露于多种刺激，从而诱发慢性炎症。食管炎是食管鳞状黏膜炎症的一种反应。我们的研究表明，酒精蓄积可通过诱导细胞焦亡加重食管炎的进展；然而，caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK可在体内外有效抑制IL-1β和IL-18的表达，从而减轻炎症反应，有望成为抑制食管炎进展的药物。此外，caspase-1介导的细胞焦亡也与食管癌的发生发展有关。[1]

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目的：脑出血（ICH）是一种公认的严重临床问题，目前尚缺乏有效的治疗方法。在脑出血的进展过程中，会发生caspase-1介导的炎症反应。因此，我们旨在研究caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk对脑出血（ICH）的影响。
材料与方法：分离小胶质细胞，并用凝血酶激活24小时。然后，通过RT-PCR和Western blotting检测NLRP3和炎症因子的转录和蛋白表达。此外，将Ac-YVAD-cmk注射到ICH模型中。在ICH后24小时检测mNSS评分和脑含水量。最后，通过免疫组织化学和HE染色方法观察ICH后小胶质细胞活化的病理变化。
结果：Ac-YVAD-cmk抑制了pro-caspase-1的活化，并减轻了脑水肿，同时在ICH后24小时观察到活化的小胶质细胞减少和炎症相关因子表达降低。因此，Ac-YVAD-cmk 可减少脑出血大鼠血肿周围成熟 IL-1β/IL-18 的释放，改善其行为表现，并减轻血肿周围区域的小胶质细胞浸润。
结论：这些结果表明 caspase-1 可放大脑出血中的多种炎症反应。Ac-YVAD-cmk 的给药可能成为脑出血的一种新型治疗策略。[2]

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本研究旨在探讨给予特异性 caspase-1 抑制剂 ac-YVAD-cmk 是否能减轻内毒素诱导的死亡率，以及这种作用是否可能归因于 IL-1β 水平的同步降低。在所检测的最高剂量下，ac-YVAD-cmk 显著降低了急性内毒素血症模型中的死亡率，且未改变循环 IL-1β 水平。此外，ac-YVAD-cmk 改善生存率与血液学参数的改变或 TNFα 或 IL-6 的产生无关。
既往研究表明，caspase-1 抑制剂能够部分抑制体外（Schumann 等，1998）和体内（Fletcher 等，1995；Mignon 等，1999）IL-1β 的释放。然而，IL-1β 产生的短暂下降并不影响死亡率（Fletcher 等，1995）。本研究中 ac-YVAD-cmk 对循环 IL-1β 缺乏影响可能归因于：（1）ac-YVAD-cmk 的剂量不足；（2）药物无法到达靶位点，例如单核细胞、巨噬细胞； （3）ac-YVAD-cmk 的半衰期短；以及（4）存在不依赖于 ICE 的 IL-1β 合成途径。证据表明，在炎症液中高浓度存在的多种蛋白酶（例如组织蛋白酶 G、弹性蛋白酶、金属蛋白酶）可使 pro IL-1-β 裂解为具有生物活性的形式（Irmler 等，1995；Hazuda 等，1988），这些蛋白酶存在于细胞浸润部位以及细胞外位点（Hazuda 等，1988）。此外，在用松节油刺激的ICE缺陷小鼠中，炎症仍然由高水平的生物活性IL-1β驱动（Fantuzzi等人，1997），而IL-1β缺陷小鼠中未观察到这种效应（Zheng等人，1995）。
本研究中12.5 μmol kg−1 ac-YVAD-cmk的存活率提高与ICE缺陷小鼠对致死性内毒素血症的存活率相似（Li等人，1995；Kuida等人，1995），而IL-1β（Fantuzzi等人，1996）或IL-18敲除小鼠（Sakao等人，1998）中未观察到这种效应。 IL-18在炎症反应中发挥着关键作用，能够在体外刺激趋化因子和细胞因子的产生（Puren等，1998）。然而，与野生型小鼠相比，IL-18基因敲除小鼠体内IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子的水平显著升高，表明IL-18对细胞因子的产生具有负反馈作用（Sakao等，1998）。本研究中caspase-1活性和IL-18产生的抑制可能是一种自分泌机制，通过一条不依赖于IL-18的途径产生具有生物活性的IL-1β。该假设应在特异性试剂（例如大鼠IL-18抗体）开发完成后进行验证。
已知半胱天冬酶参与体外（Fahy等人，1999）和体内（Mignon等人，1999）的细胞凋亡。在后一项研究中，Mignon及其同事发现，在用D-半乳糖胺致敏的TNFα依赖性内毒素血症小鼠模型中，ac-YVAD-cmk可预防死亡。基于正常的肝脏组织学和对caspase-3活性的选择性抑制，作者得出结论，存活是由于肝细胞凋亡受到抑制。相反，ac-YVAD-cmk并不能预防未致敏小鼠中LPS诱导的内毒素休克。本研究中ac-YVAD-cmk的保护作用可能是由于其预防了炎症诱导的细胞凋亡，而非多器官衰竭，因为本研究和Mignon等人的研究中死亡病例的发生时间相似。这种作用可能是由于FAS介导的、通过caspase-1依赖性途径的细胞凋亡所致，因为ICE基因敲除小鼠对FAS介导的细胞凋亡具有抵抗力，但仍然对其他细胞凋亡刺激敏感（Kuida等人，1995）。或者，ac-YVAD-cmk 可能是一种广谱 caspase 抑制剂，包括 caspase-3，这在 FAS（Enari 等，1995）和 TGF-β 介导的肝细胞凋亡（Inayat-Hassain 等，1997）中均有观察到。
目前的数据表明，caspase-1 抑制在改变实验性脓毒症的病理生理结果方面可能具有重要意义。应结合改进的非低动力性人类脓毒症动物模型（Mathiak 等，2000；Wichterman 等，1980）[3]，使用更具选择性的 caspase 抑制剂进行更多研究。

C24H33CLN4O8

540.99400

540.198

C, 53.28; H, 6.15; Cl, 6.55; N, 10.36; O, 23.66

178603-78-6

9915279

Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2Cl

YVAD

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

969.1±65.0 °C at 760 mmHg

539.9±34.3 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.554

0.9

191

6

8

14

37

845

4

CC([C@H](NC([C@@H](NC(C)=O)CC1=CC=C(O)C=C1)=O)C(N[C@H](C(N[C@H](C(CCl)=O)CC(O)=O)=O)C)=O)C

UOUBHJRCKHLGFB-DGJUNBOTSA-N

InChI=1S/C24H33ClN4O8/c1-12(2)21(24(37)26-13(3)22(35)28-17(10-20(33)34)19(32)11-25)29-23(36)18(27-14(4)30)9-15-5-7-16(31)8-6-15/h5-8,12-13,17-18,21,31H,9-11H2,1-4H3,(H,26,37)(H,27,30)(H,28,35)(H,29,36)(H,33,34)/t13-,17-,18-,21-/m0/s1

(3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-chloro-4-oxopentanoic acid

Ac-YVAD-CMK; 178603-78-6; Caspase-1 Inhibitor II; Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethylketone; acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethylketone; L-Alaninamide, N-acetyl-L-tyrosyl-L-valyl-N-[(1S)-1-(carboxymethyl)-3-chloro-2-oxopropyl]-; (4S,7S,10S,13S)-13-(2-chloroacetyl)-4-(4-hydroxybenzyl)-7-isopropyl-10-methyl-2,5,8,11-tetraoxo-3,6,9,12-tetraazapentadecan-15-oic acid; N-acetyl-tyr-val-ala-asp-chloromethyl ketone;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~184.85 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。