ACP-5862

Brutons tyrosine kinase (BTK)
BTK (Bruton‘s Tyrosine Kinase). ACP-5862 is a major active metabolite of acalabrutinib, retaining the ability to irreversibly bind to Cys481 in the ATP-binding pocket of BTK, inhibiting its kinase activity. It is approximately 1.7-fold less potent than the parent drug acalabrutinib (IC50 = 3 nM for acalabrutinib). ACP-5862 also acts as a time-dependent weak inhibitor of CYP3A4 and CYP2C8, which has implications for drug-drug interactions when acalabrutinib is co-administered with other drugs metabolized by these enzymes.

在血浆中，ACP-5862 被鉴定为阿卡替尼的主要且具有药理活性的代谢产物。ACP-5862 对 BTK 的失活效力约为母体药物阿卡替尼的 50%，且具有相似的激酶选择性。体外研究表明，阿卡替尼是 P-糖蛋白 (P-gp) 的底物，主要由 CYP3A 酶代谢。ACP-5862 的进一步代谢也主要由 CYP3A 介导。[2]

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ACP-5862 对 BTK 的抑制作用 IC50 为 5.0 nM（相比之下，acalabrutinib 的 IC50 为 3 nM）。作为主要的循环活性代谢物，ACP-5862 有助于 acalabrutinib 的整体 BTK 抑制和药理活性。它也是 CYP3A4 和 CYP2C8 的弱效、时间依赖性抑制剂。该代谢物的半衰期比母体药物长，并且在重复给药期间会发生蓄积。ACP-5862 对 B 细胞恶性肿瘤和 BTK 信号通路的研究具有重要价值。

单次口服100 mg阿卡替尼后，ACP-5862的半衰期为6.9小时，其平均暴露量约为阿卡替尼的2～3倍[2]。在雄性和雌性大鼠血浆中，ACP-5862 (M27) 分别占总AUC0-t放射性的42.1%和57.4%，是体循环中的主要单一代谢物。在雄性和雌性犬血浆中，ACP-5862分别占总AUC0-t放射性的6.1%和8.1%，是人体的重要代谢物，但在体循环中所占比例相对较小[1]。在小鼠、大鼠、狗和人血浆中，ACP-5862（1 或 10 μM）的可逆蛋白结合率分别为 98.6%、99.8%、94.3% 和 98.6% [1]。

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ACP-5862 并非作为治疗药物给药，而是阿卡替尼的代谢产物。在体内，阿卡替尼被迅速吸收并广泛代谢为 ACP-5862。该代谢产物有助于阿卡替尼的药效学活性，因为在稳态下，ACP-5862 的血浆浓度高于母体药物。在小鼠异种移植模型中，阿卡替尼（及其活性代谢产物 ACP-5862）可抑制 BTK 磷酸化 (pBTK) 并抑制肿瘤生长。

在重组CYP酶中对acalabrutinib代谢为ACP-5862的过程进行了表征，结果表明CYP3A4是唯一负责acalabrutinib转化为ACP-5862的酶。将已报道的CYP3A4最大代谢生成速率(Vmax) 4.13 pmol/分钟/pmol和Km 2.78 μM纳入模型，以描述acalabrutinib转化为ACP-5862的过程。因此，acalabrutinib经CYP3A4的清除(9.63 μL/分钟/pmol)进一步分为两条清除途径：一条途径清除活性代谢物ACP-5862（Vmax为4.13 pmol/分钟/pmol，Km为2.78 μM），另一条途径清除其他代谢物（8.14 μL/分钟/pmol）。体外研究还表明，CYP3A酶负责ACP-5862的进一步代谢，并设定CYP3A4在人肝微粒体中清除ACP-5862的清除率为23.6 μL/分钟/mg蛋白。模型中采用了ACE-HV-00917中报道的ACP-5862肾清除率为0.3 L/小时。该设定表明，ACP-5862相关代谢物约占阿卡替尼总清除量的12%，这与人体质量平衡研究中观察到的10%的总剂量非常接近。[2]

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采用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 法测定 BTK 抑制活性。将重组人 BTK (1-5 nM) 与不同浓度的 ACP-5862 (0.01-1000 nM) 在反应缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl2、2 mM MnCl2、1 mM DTT、0.01% BSA、10-100 uM ATP）中于 30℃ 孵育 30-60 分钟。加入生物素标记的肽底物，并使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体和链霉亲和素-XL665 检测磷酸化。测量荧光强度（激发波长 340 nm，发射波长 665 nm），并计算 IC50 值。

将 Ramos B 细胞（人 Burkitt 淋巴瘤细胞，1 × 10⁶ 个细胞/mL）接种于含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基的 6 孔板中。在 37℃、5% CO₂ 条件下，用不同浓度的 acalabrutinib 或 ACP-5862（0.1-1000 nM）处理细胞 2-4 小时。收集细胞，用 PBS 洗涤，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液中裂解。取 20-40 μg 裂解液进行 SDS-PAGE 电泳分离，转移至 PVDF 膜，并用抗 pBTK (Tyr223) 和抗总 BTK 抗体进行免疫印迹分析。通过密度分析计算 pBTK 抑制的 IC50 值。对于 CYP 抑制试验，将人肝微粒体与 ACP-5862 (0.1-100 μM) 和 CYP 特异性底物一起孵育。

不适用（代谢物标准品，未作为疗效研究中的试验药物）。在药代动力学研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠或比格犬口服acalabrutinib（5-20 mg/kg）。分别在给药前和多个时间点（0.5-24 h）采集血样。使用含有适当内标（例如ACP-5862 D4或其结构类似物）的乙腈对血浆进行蛋白沉淀。采用LC-MS/MS定量分析acalabrutinib和ACP-5862的浓度。计算母体药物及其代谢物的药代动力学参数（Cmax、Tmax、AUC、t½）。

ACP-5862 是主要活性代谢物，其终末半衰期（约 6-8 小时）比母体药物阿卡替尼（t½ ≈ 1-2 小时）更长。在稳态下，ACP-5862 的血浆浓度高于阿卡替尼。ACP-5862 主要通过肝脏代谢和胆汁排泄消除。它是 CYP3A4 和 CYP2C8 的时间依赖性弱抑制剂，可能会影响合用药物的代谢。血浆蛋白结合率高（>95%）。

ACP-5862 是一种研究用代谢物标准品，不供人体服用。其母体药物阿卡替尼（Calquence®）通常耐受性良好。常见不良反应包括头痛、腹泻、疲劳、恶心和出血风险增加。严重但罕见的副作用包括房颤、感染（包括机会性感染）和第二原发性恶性肿瘤。ACP-5862 预计具有类似的安全性，但并非作为治疗药物使用。

[1]. The Bruton's tyrosine kinase (BTK) inhibitor acalabrutinib demonstrates potent on-target effects and efficacy in two mouse models of chronic lymphocytic leukemia. Clin Cancer Res. 2016 Nov 30.

[2]. Evaluation of the Drug-Drug Interaction Potential of Acalabrutinib and Its Active Metabolite, ACP-5862, Using a Physiologically-Based Pharmacokinetic Modeling Approach. CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol. 2019 Jul;8(7):489-499.

总之，PBPK模型能够有效捕捉acalabrustinib及其活性代谢物ACP-5862的药代动力学特征，以及在存在CYP3A抑制剂和诱导剂相互作用的情况下，母体药物、代谢物和总母体药物及代谢物（总活性成分）的暴露量。该模型显示，在强效或中效CYP3A抑制剂存在的情况下，总活性成分的暴露量几乎不变；而在强效CYP3A诱导剂存在的情况下，总活性成分的暴露量仅下降50%。PBPK模型可指导CYP3A抑制剂和诱导剂药品说明书中的剂量调整建议，并表明acalabrustinib不太可能与敏感的CYP2C8或CYP3A底物发生相互作用。 [2]

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阿卡拉替尼是一种选择性共价布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，也是CYP3A的底物和弱CYP3A/CYP2C8抑制剂。本研究建立了一个基于生理的药代动力学（PBPK）模型，用于预测阿卡拉替尼与其活性代谢物ACP-5862之间潜在的药物相互作用（DDI）。该模型显示，阿卡拉替尼与罗格列酮或咪达唑仑等敏感的CYP底物之间不存在CYP2C8或CYP3A药物相互作用。该模型准确预测了阿卡拉替尼与CYP3A抑制剂伊曲康唑（预测值4.80倍，观察值5.21倍）和利福平（预测值0.21倍，观察值0.23倍）之间临床观察到的药物相互作用。该模型预测，当阿卡替尼与中效CYP3A抑制剂联合用药时，其药时曲线下面积（AUC）将增加2至3倍。当同时考虑母体药物和活性代谢物（总活性成分）时，CYP3A药物相互作用的程度显著降低。生理药代动力学（PBPK）药物相互作用（DDI）的给药建议应考虑母体药物浓度波动范围（相对于安全母体药物暴露量）和总活性成分浓度波动范围，以最大限度地确保安全有效的药效学覆盖。[2]

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阿卡替尼（ACP-196）是一种新型、高效且选择性的布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，它与BTK ATP结合口袋中的Cys481共价结合。我们旨在评估阿卡替尼治疗在两种已建立的慢性淋巴细胞白血病（CLL）小鼠模型中的抗肿瘤作用。实验设计：我们使用了两种不同的小鼠模型，一种是TCL1过继转移模型（将来自Eμ-TCL1转基因小鼠的白血病细胞移植到C57BL/6小鼠体内），另一种是人NSG原发性CLL异种移植模型。小鼠分别接受溶于饮用水的载体或阿卡替尼制剂。结果：生化分析证实，与伊布替尼相比，阿卡替尼是一种高选择性的BTK抑制剂。在人CLL NSG异种移植模型中，阿卡替尼治疗显示出靶向作用，包括降低PLCγ2和ERK的磷酸化水平以及显著抑制CLL细胞增殖。此外，与载体治疗组小鼠相比，阿卡替尼治疗组小鼠的脾脏肿瘤负荷显著降低。同样，在TCL1过继转移模型中也观察到BTK、PLCγ2和S6磷酸化水平的降低。最值得注意的是，与载体对照组相比，接受acalabrutinib治疗的小鼠生存期显著延长。结论：acalabrutinib在体内有效抑制BTK，从而靶向并降低包括BTK、PLCγ2、S6和ERK在内的关键信号分子的激活。在两种互补的CLL小鼠模型中，与载体治疗相比，acalabrutinib显著降低了肿瘤负荷并延长了生存期。总体而言，与ibrutinib相比，acalabrutinib表现出更高的BTK选择性，同时在体内展现出相当的显著抗肿瘤疗效。(Clin Cancer Res; 23(11); 2831-41)

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ACP-5862 是 BTK 抑制剂阿卡替尼（Calquence®）的主要活性循环吡咯烷环开环代谢物。阿卡替尼是一种第二代高选择性共价 BTK 抑制剂，已获 FDA 批准用于治疗套细胞淋巴瘤 (MCL)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 和小淋巴细胞淋巴瘤 (SLL)。ACP-5862 可用作药代动力学 (PK) 研究、代谢物分析以及涉及 CYP3A4 和 CYP2C8 的药物相互作用 (DDI) 研究中的参考标准。该代谢物仅供研究使用。

C26H23N7O3

481.505924463272

481.18623

C, 64.85; H, 4.81; N, 20.36; O, 9.97

2230757-47-6

ACP-5862-d4

135177281

White to off-white solid powder

2.8

144Ų

3

7

8

36

860

0

O=C(CCCNC(C#CC)=O)C1=NC(C2C=CC(C(NC3C=CC=CN=3)=O)=CC=2)=C2C(N)=NC=CN21

XZAATUBTUPPERZ-UHFFFAOYSA-N

XZAATUBTUPPERZ-UHFFFAOYSA-N

4-(8-amino-3-(4-(but-2-ynamido)butanoyl)imidazo[1,5-a]pyrazin-1-yl)-N-(pyridin-2-yl)benzamide

ACP-5862; ACP 5862; ACP-5862; 2230757-47-6; 4-[8-Amino-3-[4-(but-2-ynoylamino)butanoyl]imidazo[1,5-a]pyrazin-1-yl]-N-pyridin-2-ylbenzamide; 4-[8-Amino-3-[1-oxo-4-[(1-oxo-2-butyn-1-yl)amino]butyl]imidazo[1,5-a]pyrazin-1-yl]-N-2-pyridinyl-benzamide; SCHEMBL20327799; BDBM474105; GLXC-26720; US10858364, formula (I); ACP5862

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~250 mg/mL (~519.20 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。