Integrin CD11b/CD18

ADH-503（(Z)-Leukadherin-1 胆碱；4 μM；8 天）可减少 CD11b+ 单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞亚群的数量以及肿瘤浸润 CD11b+ 细胞的总数 [1] 。

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ADH-503结合CD11b并减少髓系细胞向PDAC组织的募集[1]
为了克服先前研究中CD11b阻断的剂量限制，我们开发了一种小分子激动剂ADH-503，其结合实现了部分活性的CD11b构象。 ADH-503直接改变PDAC激活的巨噬细胞的细胞因子谱。

减少肿瘤负荷可提高总生存率。 ADH-503（(Z)-Leukadherin-1 胆碱；口服管饲；30、60 或 120 mg/kg；每天两次，持续 60 天）延迟肿瘤进展，导致时间点分析和治疗存在显着差异 [1] 。 ADH-503（口服管饲；30、100 mg/kg；每天两次；第 1 天和第 5 天）在 mg/kg 和 100 mg/kg 剂量下的 AUC0-t 30，血浆浓度为 6950 ng.h/mL和 13962 ng.h/mL，分别。其最高浓度为1716和2594 ng/mL。平均半衰期为 4.68 和 3.95 小时。

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ADH-503治疗诱导CD103+cDCs在肿瘤中的积聚[1]
由于肿瘤内T细胞数量和增殖的增加，我们探讨了这些影响是否是由树突状细胞的变化驱动的。正如预期的那样，基于它们的CD11b表达，我们观察到在ADH-503治疗12天后，肿瘤浸润的CD11b+cDC2s和单核细胞衍生的DC数量减少（图4H和S4D）。相比之下，在ADH-503治疗的小鼠中，肿瘤浸润的CD103+cDC1s（以极低水平表达CD11b）的数量和MCH-I和MHC-II的表达都显著增加（图4H）。这些数据表明，ADH-503减少了潜在的耐受性和/或CD4+T细胞启动DC的数量，同时增强了CD103+cDC1s的交叉呈递。使用Zbtb46gfp/+报告小鼠证实了这些cDC群体的身份（图S1D）。为了确定cDC1s的变化是否是ADH-503治疗的小鼠中观察到的CTL反应增加所必需的，我们使用了缺乏功能性cDC1的BATF3−/-小鼠。与野生型对照组相比，ADH-503治疗对BATF3缺陷小鼠的T细胞浸润没有影响（图4I）。综上所述，这些发现表明，ADH-503对髓系细胞的重新编程会驱动cDC1的浸润和功能，从而导致抗肿瘤T细胞反应的重新激活。

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ADH-503损害肿瘤生长并提高原位模型和KPC-GEMM的存活率[1]
为了确定CD11b激动剂对肿瘤进展的影响，我们评估了三种同基因原位PDAC模型和KPC-GEMM（图5A-D）。在所有模型中，ADH-503延缓了肿瘤进展，在时间点分析中显著降低了肿瘤负担，提高了总体生存率（图5C和D）。重要的是，ADH-503对体外PDAC细胞生长没有直接影响（图S5A）。为了进一步证实ADH-503对CD11b的特异性，我们利用了CD11b缺失（ITGAM缺失）小鼠，发现与野生型小鼠不同，CD11b缺失小鼠的肿瘤生长相似，无论治疗如何（图5E）。

Leukadherin-1，也称为 LA1，是补体受体 3 (CR3) 和白细胞表面整合素 CD11b/CD18 的新型特异性激动剂，可增强白细胞对配体和血管内皮的粘附，从而减少白细胞跨内皮迁移和流入损伤网站。补体受体 3（CR3、CD11b/CD18）是一种多功能受体，主要表达于骨髓细胞和自然杀伤 (NK) 细胞。 Leukadherin-1 (LA1) 不调节信号转导子和转录激活子 (STAT)-4 磷酸化。 Leukadherin-1 调节 TLR-2 和 TLR-7/8 诱导的单核细胞细胞因子分泌。使用整合素激动剂 LA1 靶向白细胞运输，有助于预防肺部炎症并在高氧状态下保护肺泡和血管结构。因此，针对整合素介导的白细胞募集和炎症可能为预防和治疗早产儿 BPD 提供新策略。

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αA结构域配体结合分析[2]
MaxiSorp 96孔板在10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中用纤维蛋白原（每孔1μg）涂覆过夜，并用PBS中的1%BSA封闭。纯化的GST标记的αA结构域（5μg/ml溶液的每孔50μl）与固定的纤维蛋白原的结合在基于TBS的测定缓冲液（TBS含有0.1%BSA、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2和0.05%吐温20）（TBS Ca/Mg缓冲液）中在室温下进行1小时。αA结构域也被添加到板上的未涂覆孔中，以估计每个孔中可以捕获和检测的最大蛋白质量，从而进行数据归一化。通过用TBS Ca/Mg缓冲液洗涤孔两次来去除未结合的αA结构域。随后，通过与辣根过氧化物酶偶联的抗GST抗体（GE，1:2000稀释）孵育1小时来测定结合蛋白的量。通过用TBS Ca/Mg缓冲液洗涤孔两次来去除未结合的抗体。根据制造商的方案，用3,3′，5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物试剂盒检测结合蛋白。用SpectraMax M5分光光度计读取吸光度）。吸光度值被归一化，使得输入αA结构域孔的平均吸光度设置为100%，结果以野生型αA结构区总输入量的百分比表示。在三个重复的井中进行了分析，显示的数据来自至少三个独立实验中的一个。

用补体iC3b包被的绵羊红细胞（EiC3bs）进行吞噬试验[2]
如前所述，制备了涂有补体iC3b的绵羊红细胞，并将其用于吞噬试验。将包被的红细胞（EiC3bs）稀释至1.5×107至6×107个细胞/ml的浓度。将K562 CD11b/CD18细胞在TBS中洗涤两次，并重新悬浮至1×106/ml，其中40μl（4×104个细胞）与总体积为100μl的EiC3bs（1.2×106）在37°C下悬浮培养25分钟，CaCl2和MgCl2各有1 mM（在没有或存在50至100μM白细胞粘附素-1（LA1）、LA2或LA3的情况下），在1 mM MnCl2或10 mM EDTA中。如前所述，通过相差显微镜目视分析玫瑰花结的形成[多个红细胞（EiC3bs）与单个K562细胞的结合]来检测结合。对于评分，只有与≥3个EiC3bs结合的K562细胞被评为阳性，在每种情况下，在多个领域检查了>200个细胞。结合结果显示了田间所有显示玫瑰花结的细胞的百分比，以直方图的形式报告，表示三次实验的平均值±SEM；所示数据来自至少三个独立实验中的一个。

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细胞活力测定[2]
使用市售试剂和试剂盒进行细胞活力测定。简而言之，将1×104 K562 CD11b/CD18细胞或野生型B6中性粒细胞在96孔板的每个孔中与越来越多的指定化合物一起孵育，根据制造商的说明，在孵育4小时（中性粒细胞）或24小时（K562细胞）后，用MTS试剂测定活细胞的数量。使用SpectraMaxM5分光光度计读取测定板。数据代表至少两个独立的实验。

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蛋白质印迹分析[2]
将K562 CD11b/CD18细胞与白细胞粘附素-1（LA1）、LA2或LA3（15μM）或纤维蛋白原（200μg）在37°C的无血清培养基中孵育1小时。细胞裂解物在10%SDS-PAGE凝胶上分离，并通过既定的方案转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与1:1000稀释的抗磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抗体（Thr202/Tyr204）一起孵育，用Reblot温和剥离溶液剥离，然后孵育，首先用抗总ERK1/2抗体，然后用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体，并根据制造商的说明进行开发。所提供的数据代表了至少三个独立的实验。

Animal/Disease Models: KPC mouse [p48-CRE/Lox-stop-Lox(LSL)-KrasG12D/p53flox/flox][1]
Doses: 30, 60 or 120 mg/kg
Route of Administration: po (oral gavage); 60-day
Experimental Results: Delays tumor progression, results in Dramatically lower tumor burden in time point analysis, and improves overall survival.

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Animal/Disease Models: Male rat[1]
Doses: 30, 100 mg/kg (pharmacokinetic/PK/PK analysis)
Route of Administration: po (oral gavage), twice (two times) daily; results on days 1 and 5: 30 mg and 100 mg, the average half-lives were 4.68 and 3.95 hrs (hrs (hours)), respectively, the maximum concentrations were 1716 and 2594 ng/mL, and the AUC0-t in plasma were 6950 and 13962 ng.h/mL/kg respectively.

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For animal experiments, ADH-503 was given at 30, 60, or 120 mg/kg and is specified in the text when not at 60mg/kg. ADH-503 was formulated for treatment in 0.5% carboxymethyl cellulose and 0.1 % Tween-80 in sterile water and administered by oral gavage twice a day (BID).

In rats the mean half-life of ADH503 at 30 and 100mg/kg dosing was 4.68 and 3.95 hours with a Cmax and AUC0-t in the plasma of 1716 and 2594 ng/mL and 6950 and 13962 ng.h/mL, respectively. Repeat dosing in rats was similar for these parameters as doses progressed (Fig. 2C, S2C–E). Dosing in C57/B6 mice has similar PK properties (Fig. S2D).[1]

Studies showed that ADH503 is well tolerated and displayed no adverse effects or toxicity after single dose or after repeated-dose for 28 days at doses up to 1500 mg/kg/d in rats and up to 1359 mg/kg/d in dogs. There was no mortality, clinical signs or body weight changes associated with ADH503 administrations and the compound was well-tolerated.[1]

[1]. Agonism of CD11b reprograms innate immunity to sensitize pancreatic cancer to immunotherapies. Sci Transl Med. 2019 Jul 3;11(499).

[2]. Small molecule-mediated activation of the integrin CD11b/CD18 reduces inflammatory disease. Sci Signal. 2011;4(189):ra57.

CD11b Agonist GB1275 is an orally bioavailable small molecule agonist of CD11b (integrin alpha-M; ITGAM; integrin alpha M chain), with potential immunomodulating activity. Upon administration, CD11b agonist GB1275 targets and binds to CD11b, thereby activating CD11b. This leads to CD11b-mediated signaling and promotes pro-inflammatory macrophage polarization while suppressing immunosuppressive macrophage polarization. This reduces influx of tumor-associated macrophages (TAMs) and myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in the tumor microenvironment (TME), promotes anti-tumor immune responses, induces cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and suppresses tumor growth. CD11b, a member of the integrin family of cell adhesion receptors highly expressed on immune system cells, is a negative regulator of immune suppression and activates anti-tumor innate immunity.

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Although checkpoint immunotherapies have revolutionized the treatment of cancer, not all tumor types have seen substantial benefit. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly lethal malignancy in which very limited responses to immunotherapy have been observed. Extensive immunosuppressive myeloid cell infiltration in PDAC tissues has been postulated as a major mechanism of resistance to immunotherapy. Strategies concomitantly targeting monocyte or granulocyte trafficking or macrophage survival, in combination with checkpoint immunotherapies, have shown promise in preclinical studies, and these studies have transitioned into ongoing clinical trials for the treatment of pancreatic and other cancer types. However, compensatory actions by untargeted monocytes, granulocytes, and/or tissue resident macrophages may limit the therapeutic efficacy of such strategies. CD11b/CD18 is an integrin molecule that is highly expressed on the cell surface of these myeloid cell subsets and plays an important role in their trafficking and cellular functions in inflamed tissues. Here, we demonstrate that the partial activation of CD11b by a small-molecule agonist (ADH-503) leads to the repolarization of tumor-associated macrophages, reduction in the number of tumor-infiltrating immunosuppressive myeloid cells, and enhanced dendritic cell responses. These actions, in turn, improve antitumor T cell immunity and render checkpoint inhibitors effective in previously unresponsive PDAC models. These data demonstrate that molecular agonism of CD11b reprograms immunosuppressive myeloid cell responses and potentially bypasses the limitations of current clinical strategies to overcome resistance to immunotherapy.[1]

C27H28N2O5S2

524.651624679565

524.143

C, 61.81; H, 5.38; N, 5.34; O, 15.25; S, 12.22

2055362-74-6

Leukadherin-1;344897-95-6;(Z)-Leukadherin-1;2055362-72-4; 2055362-74-6 (choline)

145711124

Brown to reddish brown solid powder

151

1

7

6

36

721

0

S1C(N(C(/C/1=C/C1=CC=C(C2C=CC(C(=O)[O-])=CC=2)O1)=O)CC1C=CC=CC=1)=S.OCC[N+](C)(C)C

GOWDQYRMBCOOJR-JHMJKTBASA-M

InChI=1S/C22H15NO4S2.C5H14NO/c24-20-19(29-22(28)23(20)13-14-4-2-1-3-5-14)12-17-10-11-18(27-17)15-6-8-16(9-7-15)21(25)261-6(2,3)4-5-7/h1-12H,13H2,(H,25,26)7H,4-5H2,1-3H3/q+1/p-1/b19-12-

2-hydroxy-N,N,N-trimethylethan-1-aminium (Z)-4-(5-((3-benzyl-4-oxo-2-thioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoate

ADH-503 choline; ADH-503; ADH 503; ADH503; Leukadherin-1 choline; 2-Hydroxy-N,N,N-trimethylethan-1-aminium (Z)-4-(5-((3-benzyl-4-oxo-2-thioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoate; THN3VQ67CA; UNII-THN3VQ67CA; 4-[5-[(Z)-(3-benzyl-4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-5-ylidene)methyl]furan-2-yl]benzoate;2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium; LA1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

MEthanol : ~100 mg/mL (~190.60 mM)
DMSO : ~21.43 mg/mL (~40.85 mM)
Ethanol : ~3.33 mg/mL (~6.35 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.14 mg/mL (4.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 21.4mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.14 mg/mL (4.08 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 21.4 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 2.08 mg/mL (3.96 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。