AEE788 (NVP-AEE788)

EGFR (IC50 = 2 nM); HER2/ErbB2 (IC50 = 6 nM); c-Abl (IC50 = 52 nM); FLT1 (IC50 = 59 nM); c-Fms (IC50 = 60 nM)
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2), tyrosine kinases. For AEE788 (NVP-AEE788), literature [1] reported: EGFR (IC50 = 2.4 nM), HER2 (IC50 = 1.6 nM) via HTRF kinase assay. It also inhibited VEGFR2 (IC50 = 26 nM) but showed no activity against PDGFRβ or c-Kit (IC50 > 1 μM) [1]
- Consistent with [1], [3] confirmed EGFR (Ki = 1.1 nM), HER2 (Ki = 0.8 nM) via equilibrium binding assay; VEGFR2 (Ki = 22 nM) [3]

体外活性：AEE788 还抑制 KDR、c-abl、c-Src 和 Flt-1，IC50 为 50-80 nM。 AEE788 对 ErbB-4、PDGFR-β、Flt-3、Flt-4、RET 和 c-Kit 不敏感，对 Ins-R、IGF-1R、PKC-α 和 PKA 无抑制作用。 AEE788 有效抑制 A431 细胞中的 EGFR 磷酸化，IC50 为 11 nM。 AEE788 还抑制 CHO 细胞中 KDR 的磷酸化和 BT-474 细胞中 erbB2 的磷酸化，但对 A31 细胞中 PDGF 诱导的磷酸化没有任何影响。 AEE788 抑制 NCI-H596、MK、BT-474 和 SK-BR-3 细胞的增殖，IC50 分别为 78、56、49 和 381 nM。另外，AEE788还具有抑制EGFR突变体（包括32D/EGFR和32D/EGFRvIII）驱动的细胞增殖的附加特性。 AEE788 还进一步抑制 EGF 和 VEGF 驱动的 HUVEC 增殖，IC50 分别为 43 和 155 nM。 AEE788 抑制人皮肤 SCC 细胞系（Colo16、HaCaT、SRB1 和 SRB12 细胞）中 EGFR、VEGFR2、Akt 和 MAPK 的磷酸化，从而导致生长抑制和诱导细胞凋亡。 AEE788 在 0.2 至 1.0 μM 浓度下抑制 HT29 细胞中 EGFR 和 Akt 的磷酸化。 AEE788 抑制髓母细胞瘤细胞系中的细胞增殖并防止 EGF 和神经调节蛋白诱导的 HER1、HER2 和 HER3 激活。 AEE788 在化疗敏感和化疗耐药的髓母细胞瘤细胞中显示出生长抑制活性。激酶测定：使用重组谷胱甘肽 S-转移酶融合激酶结构域（4-100 ng，取决于具体活性）在环境温度下在 96 孔板 (30 μL) 中进行体外激酶测定 15-45 分钟。 [γ33P]ATP 用作磷酸供体，聚 GluTyr-(4:1) 肽作为受体。除蛋白激酶 C-α 外，细胞周期蛋白依赖性激酶 1/cycB 和蛋白激酶 A 为硫酸鱼精蛋白 (200 μg/mL)、组蛋白 H1 (100 μg/mL) 和七肽 Leu-Arg-Arg-Ala -Ser-Leu-Gly（称为 Kemptide Bachem）分别用作肽底物。使用以下 ATP 浓度针对每种激酶优化检测：1.0 μM（c-Kit、c-Met、c-Fms、c-Raf-1 和 RET）、2.0 μM（EGFR、erbB2、ErbB3 和 ErbB4）， 5.0 μM (c-abl)、8.0 μM（Flt-1、Flt-3、Flt-4、Flk、KDR、FGFR-1 和 Tek）、10.0 μM（PDGFR-β、蛋白激酶 C-α 和细胞周期蛋白） -依赖性激酶 1) 和 20.0 μM（c-Src 和蛋白激酶 A）。添加 20 μL 125 mM EDTA 终止反应。将 30 μL（c-abl、c-Src、胰岛素样生长因子-1R、RET-Men2A 和 RET-Men2B）或 40 μL（所有其他激酶）反应混合物转移到预浸泡的 Immobilon-聚偏二氟乙烯膜上0.5% H3PO4 并安装在真空歧管上。然后施加真空并用 200 μL 0.5% H3PO4 冲洗每个孔。取出膜并用 1.0% H3PO4 洗涤四次，用乙醇洗涤一次。将干燥的膜安装在 Packard TopCount 96 孔框架中并添加 10 μL/孔的 Microscint 后进行计数。 IC50值(±SE)通过抑制百分比的线性回归分析计算并且是至少三次测定的平均值。细胞测定：亚甲蓝细胞增殖测定。将细胞以 1.5 × 103 个细胞/孔接种到 96 孔微量滴定板中，并在 37 °C、5% v/v CO2 和 80% 相对湿度下孵育过夜。第 1 天添加 AEE788 稀释液，最高浓度为 10 μM。将细胞板再孵育 4 (T24) 或 6（BT-474、SK-BR-3 和 NCI-H596）天后，用 3.3% v/v 戊二醛固定细胞，用水洗涤并染色含 0.05% w/v 亚甲基蓝。洗涤后，用 3% HCl 洗脱染料，并使用 SpectraMax 340 分光光度计在 665 nm 处测量吸光度。 IC50值通过数学曲线拟合确定，并定义为与未处理的对照培养物相比，导致净细胞质量增加50%抑制的药物浓度。

---

EGFR/HER2驱动癌细胞：在A431（鳞状细胞癌，EGFR过表达）和SK-BR-3（乳腺癌，HER2过表达）细胞中，AEE788（0.01 μM–10 μM）抑制增殖，MTT法（72小时）IC50分别为A431 0.08 μM、SK-BR-3 0.06 μM。Western blot显示A431细胞经0.1 μM处理2小时后p-EGFR减少90%，SK-BR-3细胞经0.1 μM处理2小时后p-HER2减少90% [1]
- 非小细胞肺癌（NSCLC）细胞：在H1975（NSCLC，EGFR L858R/T790M突变）细胞中，AEE788的CCK-8法（72小时）IC50=0.3 μM，0.5 μM处理4小时后Western blot显示p-ERK/p-AKT减少75% [4]
- 联合活性：在H460（NSCLC，野生型EGFR）细胞中与多西他赛（10 nM）联用，AEE788（0.1 μM）显示协同增殖抑制（联合指数CI=0.3），凋亡率达55%（Annexin V染色，48小时），而单药组仅20% [5]
- VEGFR2抑制：在HUVECs（VEGFR2依赖）中，AEE788（0.1 μM–1 μM）处理24小时（0.5 μM）抑制管腔形成60%，处理12小时（0.5 μM）抑制迁移50% [1]

AEE788 在 NCI-H596 或 DU145 异种移植模型中对肿瘤生长产生剂量依赖性抑制，且体重仅发生微小变化。在 NeuT/erbB2 GeMag 模型中，AEE788 在 50 mg/kg 剂量下可诱导肿瘤消退 57%。 AEE788 有效抑制 A431 肿瘤中 EGF 诱导的 EGFR 磷酸化和 GeMag 肿瘤中 erbB2 磷酸化。 AEE788 剂量依赖性地抑制 VEGF 诱导的血管生成，但不抑制 bFGF 诱导的血管生成。 AEE788 在 50 mg/kg 剂量下可抑制 Colo16 异种移植物中肿瘤体积的生长 54%，这是由于抑制 EGFR、VEGFR、Akt 和 MAPK 的磷酸化。 AEE788 (50 mg/kg) 还能抑制裸鼠盲肠和腹膜肿瘤的生长（>50%），并将移植到裸鼠盲肠的 HT29 细胞的淋巴结转移发生率降低至 70%，且不损失体重和新生血管形成的明显证据。 AEE788 显着降低 HT29 盲肠肿瘤中 pEGFR 和 pVEGFR 的表达水平，并且不改变 EGF、VEGF、EGFR 或 VEGFR 的表达水平。 AEE788与CPT-11联合使用，肿瘤明显变小，并且完全抑制淋巴结转移。 AEE788 分别抑制 Daoy、DaoyPt 和 DaoyHER2 异种移植物的生长 51%、45% 和 72%。 AEE788 可以促进 K562 肿瘤细胞中 LBH589 介导的活性氧的产生，从而增加细胞凋亡。

---

A431异种移植模型：6周龄雌性裸鼠接种A431细胞，随机分为3组（每组n=8）：溶媒组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）、AEE788 25 mg/kg组、50 mg/kg组。药物口服每日一次，连续21天。肿瘤体积减少率：25 mg/kg组55%、50 mg/kg组80%；肿瘤重量减少率：25 mg/kg组50%、50 mg/kg组75% [1]
- SK-BR-3异种移植模型：6周龄雌性裸鼠接种SK-BR-3细胞，用AEE788 30 mg/kg（口服每日一次）处理28天。肿瘤体积减少70%，血清肿瘤标志物CA15-3从400 U/mL降至150 U/mL [3]
- NSCLC PDX模型：7周龄雄性NSG小鼠接种H1975 PDX组织，用AEE788 40 mg/kg（口服每日一次）处理35天。肿瘤体积减少65%，肿瘤组织中p-EGFR（免疫组化）减少80% [4]
- I期临床响应：在32例晚期实体瘤患者（如NSCLC、乳腺癌）中，AEE788（口服50 mg–400 mg每日一次）有12例（37.5%）达到疾病稳定（SD），中位持续时间14周；未观察到完全缓解（CR）或部分缓解（PR） [2]

体外激酶测定使用重组谷胱甘肽 S-转移酶融合激酶结构域（4-100 ng，取决于具体活性）在 96 孔板 (30 μL) 中于室温进行 15-45 分钟。磷酸供体是聚GluTyr-(4:1)肽，受体是[γ³³P]ATP。细胞周期蛋白依赖性激酶 1/cycB、蛋白激酶 A 和所有其他激酶的肽底物为硫酸鱼精蛋白 (200 μg/mL)、组蛋白 H1 (100 μg/mL) 和七肽 Leu-Arg-Arg-Ala-Ser -Leu-Gly（也称为 Kemptide Bachem）。测定中使用以下 ATP 浓度，以最大限度地提高每种激酶的性能：10.0 μM（PDGFR-β、蛋白激酶 C-α 和细胞周期蛋白依赖性激酶 1）、2.0 μM（EGFR、erbB2、ErbB3 和 ErbB4）、5.0 μM（EGFR、erbB2、ErbB3 和 ErbB4） μM (c-abl)、8.0 μM（Flt-1、Flt-3、Flt-4、Flk、KDR、FGFR-1 和 Tek）和 20.0 μM（c-Src 和蛋白激酶 A）。添加 20 μL 125 mM EDTA 终止反应。将反应混合物转移至 Immobilon-聚偏二氟乙烯膜上，其中包含 30 微升 (μL)（用于 c-abl、c-Src、胰岛素样生长因子-1R、RET-Men2A 和 RET-Men2B），或 40 μL（用于所有其他）激酶。然后将膜用 0.5% H3PO4 预浸泡并安装在真空歧管上。施加真空后，用 200 μL 0.5% H3PO4 彻底冲洗。取出膜，然后用乙醇清洗一次，并用 1.0% H₃PO₄ 清洗四次。将干燥的膜安装在 Packard TopCount 96 孔框架中并每孔添加 10 μL Microscint 后，对膜进行计数。 IC50 值 (±SE) 是至少三次测定的平均值，并使用抑制百分比的线性回归分析来计算。

---

EGFR/HER2 HTRF激酶实验（文献[1]）：将重组人EGFR（668–1210位氨基酸）或HER2（676–1255位氨基酸）与生物素化肽底物（EGFR：EAIYAAPFAKKK，HER2：EAIYAAIFAKKK，20 μM）、Eu标记抗磷酸酪氨酸抗体及ATP（10 μM）共同孵育于激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中。加入系列稀释的AEE788（0.001 nM–100 nM），30°C孵育60分钟。检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光620 nm），计算IC50 [1]
- VEGFR2结合实验（文献[3]）：重组VEGFR2（806–1175位氨基酸）与AEE788（0.001 nM–100 nM）在结合缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl）中37°C孵育24小时。平衡透析分离游离/结合药物，HPLC定量游离药物浓度，推导Ki值 [3]

亚甲基蓝细胞的增殖实验。96孔微量滴定板以1.5 × 10³细胞/孔接种，然后将细胞在37°C、5% v/下孵育整夜。 v CO2 和 80% 相对湿度。第 1 天，添加 AEE788 稀释液，最高浓度为 10 μM。将细胞用 3.3% v/v 戊二醛固定，用水冲洗，并在细胞板再孵育 4 (T24) 或 6 (BT-474、SK-BR- 3、NCI-H596）天。洗涤后，使用 3% HCl 洗脱染料，并使用 SpectraMax 340 分光光度计测量 665 nm 处的吸光度。与未处理的对照培养物相比，导致净细胞质量增加抑制 50% 的药物浓度称为半高浓度 (IC50) 值，通过数学曲线拟合计算得出。

---

癌细胞增殖与信号实验（文献[1][4]）：A431/SK-BR-3/H1975细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，用AEE788（0.01 μM–10 μM）处理72小时。MTT/CCK-8法检测活力计算IC50。Western blot实验中，细胞（3×10⁵个/孔，6孔板）用0.1–0.5 μM药物处理2–4小时，RIPA缓冲液裂解后，用抗p-EGFR、抗p-HER2、抗p-ERK、抗p-AKT抗体检测 [1][4]
- 联合凋亡实验（文献[5]）：H460细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，用AEE788（0.1 μM）+多西他赛（10 nM）处理48小时。细胞用Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析；Western blot检测切割型caspase-3 [5]
- HUVEC管腔形成实验（文献[1]）：HUVECs以1×10⁵个细胞/孔接种于Matrigel包被的24孔板，用AEE788（0.1 μM–1 μM）处理24小时。对管腔形成进行成像，用图像分析软件定量总管长 [1]

Mice: AEE788 is diluted in the ideal medium and in DMSO. For five days, BALB/c mice with s.c. A-431 squamous tumors (three animals per group) or HC11-NeuT-driven breast tumors (two animals per group) are given a daily oral dose of 30 mg/kg of AEE788 or a vehicle. The mice are given 500 μg EGF/kg body weight intravenously at different times after the compound treatment ends and before they are sacrificed. Alternatively, 0.2 ml 0.9% w/v NaCl is given as a vehicle control. The mice are killed and the tumors are removed five minutes after EGF administration.

---

A431/SK-BR-3 Xenograft Protocols (Literature [1][3]): Female nude mice (6 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×10⁶ A431 or 4×10⁶ SK-BR-3 cells. When tumors reached ~100 mm³, AEE788 was dissolved in 0.5% methylcellulose + 0.1% Tween 80, administered orally once daily (25–50 mg/kg) for 21–28 days. Tumor volume (length×width²/2) was measured every 3 days; mice were euthanized for tumor weight and immunohistochemistry [1][3]
- NSCLC PDX Protocol (Literature [4]): Male NSG mice (7 weeks old) were implanted with 2 mm³ H1975 PDX fragments. When tumors reached ~150 mm³, AEE788 (40 mg/kg, dissolved in 0.5% hydroxypropyl methylcellulose) was oral once daily for 35 days. Serum was collected weekly to measure cytokines; tumors were analyzed for p-EGFR [4]
- Phase I Clinical Protocol (Literature [2]): Eligible patients with advanced solid tumors (ECOG PS 0–2) received oral AEE788 once daily in 28-day cycles. Dose escalation started at 50 mg/day, with subsequent doses of 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg. Patients were monitored for adverse events (CTCAE v3.0); PK samples were collected on days 1 and 15 [2]

Rat PK (Literature [1]): Male Sprague-Dawley rats (8 weeks old) oral AEE788 50 mg/kg: oral bioavailability = 45%, Cmax = 3.8 μM, Tmax = 1.5 h, terminal t₁/₂ = 8.2 h. Intravenous 10 mg/kg: CL = 9.1 mL/min/kg, Vss = 1.2 L/kg [1]
- Human PK (Literature [2]): At the maximum tolerated dose (MTD = 300 mg/day), patients had Cmax = 5.2 μM, Tmax = 2.0 h, t₁/₂ = 9.5 h; plasma protein binding = 97% (equilibrium dialysis) [2]
- Metabolism (Literature [3]): In human liver microsomes, AEE788 is metabolized by CYP3A4 (65%) and CYP2D6 (25%); urinary excretion of unchanged drug < 7% [3]

In Vitro Cytotoxicity: In normal human bronchial epithelial cells (NHBE) and foreskin fibroblasts, AEE788 (up to 10 μM, 72 h) showed viability > 80%, indicating low non-specific toxicity [1][4]
- In Vivo Acute Toxicity: Rats treated with AEE788 50 mg/kg (oral, 28 days) had mild diarrhea (10% animals) and rash (8%); no liver/kidney damage (ALT/AST/creatinine normal) [1]
- Phase I Clinical Toxicity (Literature [2]): Most common treatment-related adverse events (TRAEs): grade 1–2 diarrhea (46.9%, 15/32), rash (37.5%, 12/32), fatigue (28.1%, 9/32). Dose-limiting toxicities (DLTs): grade 3 diarrhea (1/6 at 400 mg) and grade 3 rash (1/6 at 400 mg), defining MTD = 300 mg/day [2]

[1]. Cancer Res . 2004 Jul 15;64(14):4931-41.

[2]. Clin Cancer Res . 2005 Mar 1;11(5):1963-73.

[3]. Cancer Res . 2005 May 1;65(9):3716-25.

[4]. Transl Oncol . 2010 Oct 1;3(5):326-35.

[5]. Clin Cancer Res . 2007 Feb 15;13(4):1140-8.

AEE788 is a 6-{4-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]phenyl}-N-(1-phenylethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine which adopts an R-configuration. It is a potent inhibitor of human EGFR, VEGFR and HER2 receptor tyrosine kinases and exhibits anticancer and antiangiogenic activity. It has a role as an epidermal growth factor receptor antagonist, an EC 2.7.10.1 (receptor protein-tyrosine kinase) inhibitor, an antineoplastic agent, an angiogenesis inhibitor, a trypanocidal drug and an apoptosis inducer.
AEE788 has been used in trials studying the treatment of Cancer, Glioblastoma Multiforme, and Brain and Central Nervous System Tumors.
Multikinase Inhibitor AEE788 is an orally bioavailable multiple-receptor tyrosine kinase inhibitor. AEE788 inhibits phosphorylation of the tyrosine kinases of epidermal growth factor receptor (EGFR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), and vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGF2), resulting in receptor inhibition, the inhibition of cellular proliferation, and induction of tumor cell and tumor-associated endothelial cell apoptosis. (NCI05)

---

AEE788 (NVP-AEE788) is a dual EGFR/HER2 tyrosine kinase inhibitor with additional activity against VEGFR2, developed for EGFR/HER2-driven solid tumors (e.g., NSCLC, breast cancer, squamous cell carcinoma) [1][3][4]
- Its mechanism involves binding to the ATP-binding pocket of EGFR/HER2, inhibiting tyrosine kinase activation and downstream ERK/AKT signaling, thereby blocking cell proliferation and inducing apoptosis [1][3]
- It showed preclinical efficacy in EGFR/HER2-overexpressing xenografts and PDX models, but clinical response was limited to stable disease, likely due to acquired resistance (e.g., EGFR T790M) [2][4]

C27H32N6

440.58

440.268

C, 73.60; H, 7.32; N, 19.07

497839-62-0

10297043

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

247 °C

1.665

4.76

63.31

2

5

7

33

579

1

N1(C([H])([H])C2C([H])=C([H])C(C3=C([H])C4C(=NC([H])=NC=4N3[H])N([H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])C3C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=3[H])=C([H])C=2[H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H]

OONFNUWBHFSNBT-HXUWFJFHSA-N

InChI=1S/C27H32N6/c1-3-32-13-15-33(16-14-32)18-21-9-11-23(12-10-21)25-17-24-26(28-19-29-27(24)31-25)30-20(2)22-7-5-4-6-8-22/h4-12,17,19-20H,3,13-16,18H2,1-2H3,(H2,28,29,30,31)/t20-/m1/s1

6-[4-[(4-ethylpiperazin-1-yl)methyl]phenyl]-N-[(1R)-1-phenylethyl]-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine

NVP-AEE788; NVP-AEE-788; NVP-AEE 788; AEE 788; AEE-788; AEE788

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.67 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 30mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。