Secondary/microbial metabolite from Aspergillus flavus and A. parasiticus

在世界上黄曲霉毒素B1 （AFB1）食品污染严重的地区，大约一半的肝细胞癌（HCC）含有p53肿瘤抑制基因密码子249的突变。该突变几乎完全由该密码子第三位的G- >T翻转组成，导致突变蛋白的第249位插入丝氨酸。为了深入了解这一引人注目的突变热点在肝癌发生过程中的形成机制，我们采用限制性片段长度多态性/聚合酶链反应基因型分析方法研究了大鼠肝微粒体激活AFB1对人肝癌细胞HepG2中p53密码子247-250的诱变作用。AFB1优先诱导密码子249第3位G- >T的翻转。然而，AFB1也诱导G- >T和C- >A转化为相邻的密码子，尽管频率较低。由于在HCC中未观察到后一种突变，因此在afb1污染区域的HCC中，DNA水平的突变和突变丝氨酸249 p53蛋白的功能改变是导致p53突变热点的原因。我们的研究结果与AFB1在世界上受AFB1污染食品的地区的肝癌发生中的病因学作用一致。

使用黄曲霉毒素 B1 可以在动物体内建立肿瘤模型。

HPLC分析黄曲霉毒素[2]
采用高效液相色谱（HPLC）和荧光检测器自动进样器对样品中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2进行检测和定量。HPLC设备为Shimadzu系统，配备Shimadzu LC-20AD泵、Shimadzu SIL-20 ADHT自动进样器、CTO-20AC柱式烤箱、Shimadzu RF-10AXL荧光检测器（FLD），激发波长为360 nm，发射波长为460 nm。色谱柱为ODS3柱（ODS3 250 mm × 5 μm × 4.6 mm）。流动相为蒸馏水/乙腈（90:10），流速为1 ml/min；注射量为100 μl （AOAC, 999.07）。

真菌培养[1]
以产黄曲霉毒素B1 （AFB1）的两株黄曲霉（Aspergillus flavus, NRRL 3357）和寄生曲霉（A. parasiticus, NRRL 465）为研究对象，在27 ℃条件下分别在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养5 d。每个菌株的孢子悬浮液制备于0.05% Tween 80的5 ml水溶液中，调整为0.25 (OD540nm)，含有约106-7个 分生孢子/ml。使用自动细胞计数器（tc20, ....）验证接种物中的孢子数

吸收、分布和排泄
猴子腹腔注射后四天，仍有5.6%的剂量保留在肝脏中，主要与肝脏蛋白结合。恒河猴口服黄曲霉毒素B1后，在第1-4天以黄曲霉毒素M1的形式排泄约20%；未代谢的黄曲霉毒素B1仅占一小部分，而黄曲霉毒素B1β-葡萄糖醛酸苷占5%（其中3.3%为葡萄糖醛酸苷，1.2%为硫酸盐结合物）。另有5%的剂量以黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素M1的形式从粪便中排出。
在饲喂估计LD50剂量黄曲霉毒素B1（0.1 mg/kg体重，以黄曲霉稻米培养物形式提供）的育肥猪以及饲喂含400 ng/g黄曲霉毒素B1（来自玉米）的天然污染饲料14天的上市体重猪的肾脏、肝脏和肌肉组织中均检测到了黄曲霉毒素醇、黄曲霉毒素B1和M1。在饲喂试验中，除肾脏外，所有组织中黄曲霉毒素B1和M1的含量大致相同，在肾脏中，黄曲霉毒素M1是最主要的黄曲霉毒素。
黄曲霉毒素以其代谢产物黄曲霉毒素M1的形式从泌乳动物的乳汁中排出。在单次口服黄曲霉毒素的牛中，85%的毒素总量在给药后的前48小时内于牛奶和尿液中检出。4天后牛奶中未检出黄曲霉毒素，6天后尿液和粪便中也未检出。牛奶中黄曲霉毒素总量占摄入量的0.39%。……摄入的黄曲霉毒素B1中，不足0.6%通过牛奶排出。乳汁中黄曲霉毒素的排泄量与产奶量无关，停止喂食有毒食物后三到四天内即可从乳汁中清除。
使用环标记或甲氧基标记的（¹⁴碳）黄曲霉毒素B1，研究表明大鼠在24小时内可排出单次腹腔注射剂量的70-80%。
有关黄曲霉毒素B1（共18种）的更多吸收、分布和排泄（完整）数据，请访问HSDB记录页面。

---

代谢/代谢物
黄曲霉毒素预计通过以下4种途径进行生物转化：(i) 通过两个稠合呋喃环连接处的碳原子羟基化，黄曲霉毒素B1转化为黄曲霉毒素M1，这种转化在哺乳动物肝脏中会在一定程度上发生；(ii) 单个芳香环的氧化O-去甲基化。甲氧基取代基生成黄曲霉毒素 P1……（iii）乙烯基醚双键的水合反应生成半缩醛，黄曲霉毒素 B1……在豚鼠、小鼠和禽类肝脏中转化为黄曲霉毒素半缩醛 B2a，（iv）环戊烯酮环还原生成二氢黄曲霉毒素醇，但这种生物转化似乎仅限于禽类，可能与哺乳动物无关。
在恒河猴中，腹腔注射……尿液中氯仿可溶性排泄物包括黄曲霉毒素 M1（占剂量的 2.3%）和至少 3 种其他未鉴定的化合物，以及未改变的黄曲霉毒素 B1（0.01-0.10%）。尿液中氯仿不溶性代谢物通过离子交换法分离；主要亚组分是黄曲霉毒素 P1 β-葡萄糖醛酸苷。尿液中黄曲霉毒素P1β-葡萄糖醛酸苷约占给药剂量的20%；其中17%为葡萄糖醛酸苷，3%为硫酸酯，1%为非结合酚。
对人肝匀浆体外代谢黄曲霉毒素B1的研究表明，黄曲霉毒素B1-2,3-环氧化物的产生……。
在虹鳟分离的肝细胞中检测了黄曲霉毒素B1的代谢。细胞内DNA加合物的形成与黄曲霉毒素B1的剂量呈线性相关，且与体内形成的加合物性质相似。加合物积累的代谢速率在最初一小时内保持恒定，之后通常先升高后逐渐降低。在制备后的前1小时内，主要游离黄曲霉毒素B1代谢物（黄曲霉毒素醇、黄曲霉毒素M1及其极性结合物）的相对生成速率保持不变，但随后发生变化，其变化方式与DNA结合的变化一致。
有关黄曲霉毒素B1（共23种）的更多代谢/代谢物（完整）数据，请访问HSDB记录页面。
黄曲霉毒素B1已知的代谢物包括黄曲霉毒素B1-外-8,9-氧化物、黄曲霉毒素M1和黄曲霉毒素Q1。

相互作用
胡椒碱已知能改变药物的生物转化。已有研究描述了胡椒碱对大鼠体内(3)H-黄曲霉毒素B1代谢活化和分布的影响。体外实验表明，胡椒碱能以剂量依赖的方式显著抑制肝微粒体催化的(3)H AFB1与小牛胸腺DNA的结合。与对照组相比，预先用胡椒碱处理的大鼠血浆和所检测的组织中(3)H AFB1放射性显著升高。然而，胡椒碱对体内肝脏(3)H AFB1-DNA结合没有影响，这可能是由于胡椒碱对肝胞质谷胱甘肽5-转移酶活性没有影响。体内实验表明，胡椒碱处理的大鼠肝微粒体有增强(3)H AFB1与小牛胸腺DNA结合的趋势。胡椒碱对 AFB1 代谢的影响与 SKF 525-A 对外源化合物生物转化的作用机制非常相似。
……本研究采用北京鸭模型，探讨先天性鸭乙型肝炎病毒感染和黄曲霉毒素 B1 (AFB1) 暴露对肝癌发生发展的影响。从孵化后第三个月开始，每周一次腹腔注射 AFB1，分别给予感染或未感染鸭乙型肝炎病毒的鸭和未感染鸭，直至处死（2.3 年后）。同时观察两个未接受 AFB1 处理的对照组鸭（其中一组感染了鸭乙型肝炎病毒），观察期相同。每个实验组包含 13-16 只鸭。结果显示，感染鸭乙型肝炎病毒并接受 AFB1 处理的鸭的死亡率高于未感染鸭并接受 AFB1 处理的对照组鸭和其他对照组鸭。在未感染鸭组中，分别用高剂量和低剂量黄曲霉毒素B1（AFB1）处理后，10只鸭中有3只出现肝肿瘤；在感染鸭组中，高剂量AFB1处理组6只鸭中有3只出现肝肿瘤，而低剂量AFB1处理组未观察到肝肿瘤。两个对照组均未观察到肝肿瘤。与其它组相比，感染鸭乙型肝炎病毒并接受AFB1处理的鸭表现出更明显的门静脉周围炎症改变、纤维化和局灶性坏死。所有携带鸭乙型肝炎病毒的鸭在整个观察期内均表现出持续性病毒血症。与感染对照组相比，AFB1处理组动物肝脏和血清中的病毒DNA滴度经常升高。虽然在一例经黄曲霉毒素B1（AFB1）处理的鸭的肝细胞癌中检测到了病毒多聚体DNA形式的积累，但未观察到鸭乙型肝炎病毒DNA整合到宿主基因组中。
吲哚-3-甲醇（(I3)C）是十字花科蔬菜的次生代谢产物，在致癌物AFB1处理前或处理时，可抑制鳟鱼和大鼠的AFB1肝癌发生；但在AFB1处理后持续给予(I3)C，则会促进这两种动物的肝癌发生。由于人类(I3)C的摄入可能并非持续性的，且这种促进作用可能是可逆的，因此我们采用延迟和间断暴露方案评估了(I3)C的促进作用。在AFB1处理后，我们给鳟鱼饲喂不同时间的(I3)C，并在处理后设置了不同长度的延迟，以及连续或间歇的(I3)C处理模式。研究发现，在首次黄曲霉毒素B1（AFB1）感染后数周或数月再给予碘-3-环己基（I3C）治疗，可显著促进肿瘤发生。此外，I3C治疗时间越长，促进作用越强；而隔月或隔周给予I3C，或每周仅给予两次，则促进作用虽有所减弱但仍存在。这些结果不支持肝癌发生过程中I3C促进作用是可逆的观点。为了量化I3C的促癌效力及其与膳食浓度的关系，研究人员建立了一系列AFB1肿瘤剂量-反应曲线，每条曲线均在AFB1感染后持续给予不同浓度的I3C。结果表明，随着I3C浓度的增加，肿瘤剂量-反应曲线（以发生率的logit百分比对AFB1剂量的log值作图）平行向较低的AFB1半数致癌浓度（TD50）值方向移动。计算得出，使黄曲霉毒素B1 (AFB1) 剂量减半以达到50%肿瘤发生率的(I3)C浓度约为1000 ppm，且持续饲喂，无明显的促进阈值。相比之下，在饲喂AFB1之前和同时饲喂I3时，虹鳟鱼的50%抑制值（使AFB1剂量加倍以达到50%肿瘤发生率的(I3)C浓度）为1400 ppm。因此，(I3)C作为膳食添加剂，持续饲喂时促进先前肝脏肿瘤起始事件的潜力与其抑制同时发生的AFB1肿瘤起始事件的潜力大致相当。
……本研究探讨了不同蛋白质水平饲喂引起的产热指标变化与γ-谷氨酰转肽酶阳性病灶发展之间的关联。在完成 AFB1 给药五天后，将动物随机分为四组，分别饲喂 4%、8%、12%、16% 或 22% 的膳食蛋白质，持续 6 周。低蛋白组（4%、8%）动物的肝脏病灶形成（占肝脏体积的百分比）显著减少，但每 100 克体重的热量消耗量却更高。随着膳食蛋白质摄入量的增加，耗氧量呈轻微的负线性趋势。饲喂 4% 和 8% 蛋白质组的动物尿去甲肾上腺素水平升高；棕色脂肪组织中尿多巴胺和去甲肾上腺素的周转率在饲喂 4% 蛋白质的动物中最高。这些结果表明，当膳食蛋白质摄入量达到“临界水平”（约 12%）时，γ-谷氨酰转肽酶阳性病灶就会出现。蛋白质摄入量较低时，抑制病灶形成与多种产热增加的指标相关。
有关黄曲霉毒素B1（共40项）的更多相互作用（完整）数据，请访问HSDB记录页面。

---

非人类毒性值
大鼠口服LD50：4800 μg/kg
大鼠腹腔注射LD50：6 mg/kg
猫口服LD50：550 μg/kg
小鼠口服LD50：9 mg/kg
有关黄曲霉毒素B1（共14项）的更多非人类毒性值（完整）数据，请访问HSDB记录页面。

[1]. Aflatoxin B1 (AFB1) production by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus on ground Nyjer seeds: The effect of water activity and temperature. Int J Food Microbiol. 2019 May 2;296:8-13.

[2]. Aflatoxin B1 induces the transversion of G-->T in codon 249 of the p53 tumor suppressor gene in human hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Sep 15;90(18):8586-90.

黄曲霉毒素B1呈无色至淡黄色晶体或白色粉末状，具有蓝色荧光。(NTP, 1992)
黄曲霉毒素B1是一种黄曲霉毒素，其骨架为四氢环戊并[c]呋喃并[3',2':4,5]呋喃并[2,3-h]色烯，在1、4和11位具有氧官能团。它既是人体代谢产物，也是一种致癌物。它是一种黄曲霉毒素、芳香醚和芳香酮。
据报道，黄曲霉毒素B1存在于甘草、黄曲霉和其他一些有相关数据的生物体中。
黄曲霉毒素B1是黄曲霉和寄生曲霉产生的一类真菌毒素的成员。黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素中肝毒性和肝致癌性最强的一种，常见于多种食品中。
它是一种强效的肝毒性和肝致癌性真菌毒素，由黄曲霉属真菌产生。它还具有致突变性、致畸性，并可导致动物免疫抑制。花生、棉籽粕、玉米和其他谷物中均含有黄曲霉毒素B1。该真菌毒素需要环氧化生成黄曲霉毒素B1 2,3-氧化物才能被激活。微粒体单加氧酶将毒素生物转化为毒性较低的代谢物黄曲霉毒素M1和Q1。

---

作用机制
强效肝癌致癌真菌成分黄曲霉毒素B1需要代谢活化才能发挥其生物学效应，并且在大鼠体内与肝脏大分子共价结合。
在测试的4种主要黄曲霉毒素中，对RNA聚合酶II的抑制作用顺序为：B1 > G1 > B2 > G2。
疑似人类肝癌致癌物黄曲霉毒素B1 (AFB1) 是虹鳟（Oncorhynchus mykiss）肝脏肿瘤的已知强效诱发剂。AFB1可诱发虹鳟发生肝细胞癌和混合型肝细胞/胆管细胞癌，其中混合型更为常见。此前已从鳟鱼肝脏cDNA中分离出两个c-ras基因。本研究分析了14例黄曲霉毒素B1（AFB1）诱导的鳟鱼肝脏肿瘤的DNA，检测这两个基因外显子1中的点突变。利用聚合酶链式反应（PCR）和寡核苷酸杂交方法，发现高比例（10/14）AFB1诱导的肿瘤DNA中存在鳟鱼c-Ki-ras基因的激活点突变。在这10个突变型ras基因中，7个为密码子12的GGA-GTA颠换，2个为密码子13的GGT-GTT颠换，1个为密码子12的GGA-AGA转换。对来自这四个肿瘤DNA的克隆聚合酶链式反应产物进行核苷酸序列分析，提供了确凿的证据，表明存在两个密码子12的GGA-GTA突变、一个密码子12的GGA-AGA突变和一个密码子13的GGT-GTT突变，这与寡核苷酸杂交结果完全一致。在肝脏中表达的第二个鳟鱼ras基因的外显子1中，以及在对照肝脏的DNA中，均未检测到突变。这是首次报道在低等脊椎动物鱼类模型中实验诱导ras基因点突变。结果表明，肝癌致癌物AFB1在鳟鱼中诱导的c-Ki-ras基因突变与大鼠肝肿瘤中的突变相似。
黄曲霉毒素B1被认为是导致南非和中国启东地区人类肝细胞癌中p53基因249密码子G到T突变的致病因子。为了验证这一假设，我们分析了由黄曲霉毒素B1诱导的非人灵长类动物的9个肿瘤中p53基因的突变情况。这些肿瘤包括4个肝细胞癌、2个胆管癌、1个胆管梭形细胞癌、1个肝血管内皮肉瘤和1个胫骨骨肉瘤。通过对249号密码子处HaeIII酶切位点的切割分析，所有肿瘤均未发现249号密码子第三位点的突变。通过对p53基因四个保守结构域（II至V）的测序分析，我们在1个肝细胞癌中发现了175号密码子第二位点的点突变（G到T颠换）。这些数据表明，在非人灵长类动物中，黄曲霉毒素B1诱导的肝癌发生并不一定需要p53基因突变。在特定人类肝细胞癌样本中，p53 基因 249 号密码子发生突变可能表明，除黄曲霉毒素 B1 外，还有其他环境致癌物参与其中，或者乙型肝炎病毒相关性肝炎是黄曲霉毒素 B1 诱导 249 号密码子发生 G 到 T 颠换的先决条件。
有关黄曲霉毒素 B1（共 11 项）的更多作用机制（完整）数据，请访问 HSDB 记录页面。

C17H12O6

312.28

312.063

C, 65.39; H, 3.87; O, 30.74

1162-65-8

Aflatoxin B1-13C17;1217449-45-0

186907

White to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

528.2±50.0 °C at 760 mmHg

268-269 °C

237.7±30.2 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.687

0.45

74.97

0

6

1

23

650

2

COC1=C2C3=C(C(=O)CC3)C(=O)OC2=C4[C@@H]5C=CO[C@@H]5OC4=C1

OQIQSTLJSLGHID-WNWIJWBNSA-N

InChI=1S/C17H12O6/c1-20-10-6-11-14(8-4-5-21-17(8)22-11)15-13(10)7-2-3-9(18)12(7)16(19)23-15/h4-6,8,17H,2-3H2,1H3/t8-,17+/m0/s1

(3S,7R)-11-methoxy-6,8,19-trioxapentacyclo[10.7.0.02,9.03,7.013,17]nonadeca-1,4,9,11,13(17)-pentaene-16,18-dione

NSC-529592; AFLATOXIN B1; 1162-65-8; AFB1; AFBI; (-)-Aflatoxin B1; NSC 529592; CCRIS 12; EINECS 214-603-3; NSC 529592; Aflatoxin B1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMF : 33.33 mg/mL (~106.73 mM)
DMSO : ~30 mg/mL (~96.07 mM)

配方 1 中的溶解度: 3 mg/mL (9.61 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 30.0 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。