EGFR (IC50 = 3 nM); HCV; EMCV

在化学指定的 DMEM/F12 培养基中，培养人肺癌 (A549) 和前列腺 (DU145) 癌细胞系。 AG-1478 (AG1478) 对这些细胞系的生长调节是不可逆的。尽管 AG-1478 不能完全阻止 A549 细胞的增殖，但它在较低浓度下似乎更有效[1]。当 EGFR 被特异性酪氨酸激酶抑制剂 AG-1478 (AG1478) 抑制时，血管紧张素 II 介导的心脏成纤维细胞产生的 TGF-β 和纤连蛋白会显着减少。 AG-1478 是一种 IC50 为 4 nM 的小分子抑制剂，在药理学上抑制 EGFR[2]。使用流式细胞术确定 Polyfect (PF) 和 Superfect (SF) 处理对 HEK 293 细胞凋亡的促进程度。 Tempol 是一种抗氧化剂，可显着降低 PF 和 SF 树枝状聚合物介导的细胞凋亡。作为阳性对照，AG-1478（AG1478）的使用剂量比信号研究的剂量高10倍（100μM），它有效地引起HEK 293细胞凋亡[3]。

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体外活性：AG-1478（也称为 Tyrphostin AG-1478）是一种有效的选择性 EGFR（表皮生长因子受体）抑制剂，在无细胞测定中 IC50 为 3 nM。它可逆地抑制大鼠脑 Kv1.5 钾通道，IC50 为 9.8 µM，与蛋白酪氨酸激酶 (PTK) 活性无关。 AG-1478 还抑制平滑肌瘤和子宫肌层细胞培养物的生长，IC50 值分别为 5.6 和 5.7 µM。此前的研究表明，EGFR拮抗作用可能有效治疗多种疾病，如癌症、血管紧张素II诱导的心脏肥大和糖尿病心肌病。因此，AG-1478 有潜力用作这些疾病的治疗药物。激酶测定：AG-1478 对 ErbB2 和 PDGFR 具有高选择性，IC50 > 100 μM。与表达内源wt EGFR或过表达外源wt EGFR的细胞相比，AG-1478优先抑制表达截短EGFR的U87MG细胞，IC50为8.7μM，IC50分别为34.6μM和48.4μM，并抑制DNA合成，IC50为4.6μM，分别为 19.67 μM 和 35.2 μM。与内源性或过表达的外源性 wt EGFR 相比，AG-1478 还优先抑制 ΔEGFR 的酪氨酸激酶活性和自身磷酸化。 AG-1478 (0.25 μM) 消除由 Ang II（一种 Ca2+ 离子载体）以及 EGF 诱导的 MAPK 激活，但不能消除 VSMC 中佛波醇酯或血小板衍生生长因子-BB 诱导的 MAPK 激活。 AG-1478 抑制 EGF 诱导的 BaF/ERX 和 LIM1215 细胞有丝分裂，IC50 分别为 0.07 μM 和 0.2 μM。 AG1478 能够抑制 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白（例如 ABCB1 和 ABCG2）的功能，其中对 ABCG2 的影响更为明显。细胞测定：将细胞在 96 孔板中暴露于不同浓度的 AG-1478 中 72 小时。使用 Alamar Blue 测定法检查 AG-1478 对细胞生长的影响。将 20 μL 等份的 Alamar Blue 添加到每个孔中，并使用 Spectromax 扫描微孔板读数仪测定其吸光度。 AG-1478 的效果以生长抑制百分比表示，使用未处理的细胞作为对照（0% 抑制）。使用 [3H] 胸苷掺入测定法测定细胞 DNA 合成。

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我们使用了两种选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂：AG494（可逆）和AG1478（不可逆），用于在化学定义的DMEM/F12培养基中培养的人肺（A549）和前列腺（DU145）癌症细胞系的生长调节。两种测试的酪氨酸磷酸酶都显著抑制了所研究细胞系的自分泌生长。AG494的作用呈剂量依赖性，在最高浓度下可完全抑制生长。AG1478在较低浓度下似乎更有效，但无法完全抑制A549细胞的生长。与AG1478相比，AG494对EGFR激酶活性的抑制对两种细胞系中ERK的活性没有影响。两种EGFR抑制剂都诱导了所研究的肺癌和前列腺癌癌症细胞系的凋亡，但所研究的tyrphostins在A549中的促凋亡作用大于在DU145细胞中的促细胞凋亡作用。与其他已知的EGFR抑制剂类似，酪氨酸磷酸酶在G1期抑制了DU145和A549细胞的生长。AG494和AG1478对两种信号蛋白（AKT和ERK）活性的影响取决于所研究的细胞类型。在DU145细胞的情况下，两种激酶的酶活性都明显下降（AG1478更强），而在A549中，只有AG1478有效地抑制了Akt的磷酸化。Tyrphostins AG494和AG1478是ATP竞争对手，应该具有类似的作用机制，但我们的研究结果表明这并不完全正确。[1]

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EGFR抑制剂预防H9C2细胞PA诱导的损伤[2]
为了评估EGFR抑制剂对体外心肌细胞肥大的影响，H9C2细胞用AG1478或542预处理2小时，然后暴露于PA（100μM）6小时。使用罗丹明标记的Phalloidin评估细胞形态和细胞体积。PA的孵育显著增加了H9C2细胞的体积，而AG或542可以逆转细胞形态的变化（图6A，B）。同时，AG或542预处理显著降低了H9C2细胞中肥大标志物基因心钠素（ANP）和促纤维化基因TGF-β的mRNA水平（图6C，D），表明这些小分子抑制剂可以预防PA诱导的心肌细胞肥大和纤维化。

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基因敲除EGFR抑制的PA诱导的H9C2细胞炎症损伤[2]
为了避免小分子抑制剂的非特异性并验证EGFR的作用，我们用特异性小干扰RNA转染H9C2细胞以下调EGFR表达（si-EGFR）。如图7A所示，在100μM PA处理下转染si-EGFR显著降低了H9C2细胞中EGFR蛋白的表达，进一步导致TNF-α和ANP基因表达水平降低，PA刺激的H9C2细胞中caspase-3活性降低（图7B-D）。这些结果，再加上我们对542/AG1478细胞内效应的观察，证实了EGFR在介导高脂血症诱导的心脏损伤中起着重要作用。为了模拟临床环境，我们进一步评估了EGFR抑制对已经暴露于PA（作为治疗）的H9c2细胞中PA有害作用的保护作用。补充图S3中的结果显示，用EGFR抑制剂AG或542治疗后，PA也降低，TNF-α和ANP水平升高。

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脑心肌炎病毒（EMCV）与丙型肝炎病毒（HCV）一样，需要磷脂酰肌醇4-激酶IIIα（PI4KA）进行基因组复制。在这里，我们证明了已知的表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂tyrphostinAG1478也在体外和细胞内抑制PI4KA活性。AG1478会损害EMCV和HCV的复制，但不会损害先前证明可以逃避PI4KA抑制的EMCV突变体的复制。这项工作揭示了AG1478的新细胞和抗病毒特性，AG1478是一种以前仅被视为癌症化疗剂的化合物[4]。

在这两种肥胖小鼠模型中，给予 AG-1478 (AG1478) 可显着降低心肌炎症、纤维化、细胞凋亡和功能障碍。 ApoE-/- 小鼠在喂食 HFD 8 周（ApoE-HFD）后，口服 AG -1478（10 mg/kg/天）或 542（10 mg/kg/天）灌胃 8 周。在体内，AG-1478 或 542 疗法可阻断 HFD 诱导的心脏 EGFR 磷酸化，但对血浆总甘油三酯 (TG) 或低密度脂蛋白 (LDL) 水平没有影响[2]。施用 EGF (10 nM) 后，EGFR 磷酸化持续强烈升高，并且这种升高可以被已知的 EGFR 磷酸化抑制剂 AG-1478 (AG478) 抑制。尽管不如 AG1478 那么多，但增加 Polyfect (PF) 剂量可显着降低 EGF 诱导的 EGFR 磷酸化 (p<0.05)[3]。

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AG-1478的施用可阻断肿瘤部位EGFR的磷酸化，并抑制过表达WT EGFR的A431异种移植物和表达de2-7 EGFR的神经胶质瘤异种移植物的生长。即使是亚治疗剂量的 AG-1478 也能显着增强细胞毒性药物的功效，AG-1478 和替莫唑胺的组合对人神经胶质瘤异种移植物表现出协同抗肿瘤活性。 AG-1478 和抗 EGFR 抗体 (mAb 806) 的组合对过度表达 EGFR 的肿瘤异种移植物表现出相加的、在某些情况下协同的抗肿瘤活性。 AG-1478（0.4 mg）与单剂量 25 μCi 90Y-CHX-A-DTPA-hu3S193 的组合与单独使用任一药物相比，可显着增强疗效。

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使用喂食高脂肪饮食（HFD）的野生型（WT）和载脂蛋白E（ApoE）敲除小鼠的体内研究表明，小分子EGFR抑制剂AG1478和542对肥胖诱导的心肌损伤具有有益作用。AG1478和542的给药显著降低了两种肥胖小鼠模型的心肌炎症、纤维化、细胞凋亡和功能障碍。在体外，棕榈酸（PA）刺激的心肌细胞中，EGFR信号传导被siRNA沉默或小分子EGFR抑制剂阻断。EGFR抑制减弱了PA诱导的H9C2细胞炎症反应和凋亡。此外，我们发现PA诱导的EGFR激活是由上游TLR4和c-Src介导的。本研究证实了EGFR活化在实验小鼠肥胖诱导的心脏炎症损伤发病机制中的有害作用，并证明了TLR4/c-Src介导的PA诱导EGFR活化机制。我们的数据表明，EGFR可能是肥胖相关心血管疾病的治疗靶点[2]。

AG-1478 的 IC50 > 100 μM，对 ErbB2 和 PDGFR 具有高度选择性。在 U87MG 细胞中，AG-1478 优先抑制截短 EGFR 表达 (IC50 = 8.7 μM)，而不是内源 wt EGFR 表达（IC50 = 34.6 μM 和 48.4 μM，分别），并抑制 DNA 合成（IC50 = 4.6 μM、19.67 μM 和 35.2）分别为μM）。此外，与内源性或过表达的外源性 wt EGFR 相比，AG-1478 优先抑制 ΔEGFR 的酪氨酸激酶活性和自身磷酸化。在 VSMC 中，AG-1478 (0.25 μM) 可消除由 Ang II（一种 Ca2+ 离子载体）和 EGF 引起的 MAPK 激活，但不能消除由佛波醇酯或血小板衍生生长因子-BB 引起的 MAPK 激活。 AG-1478 的 IC50 值分别为 0.07 μM 和 0.2 μM，抑制 EGF 诱导的 BaF/ERX 和 LIM1215 细胞有丝分裂。 AG1478 可抑制 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白 ABCB1 和 ABCG2，其中对 ABCG2 的影响更大。

A549 (CCL-185) 和 DU145 (HTB-81) 细胞以 4×103 细胞/孔的密度接种在 DMEM（A549 细胞）或 MEM（DU145 细胞）中的 96-孔板。 24 小时孵育期后，用白蛋白 (0.5 mg/mL)、亚硒酸钠 (2 ng/mL) 和转铁蛋白 (5 mg/mL) 增强的无血清 DMEM/F12 (1:1) 替代培养基（DMEM/F12+）。孵育期第 0 天后，用含有浓度分别为 1-20 μM 和 0.1-8 μM 的酪氨酸激酶抑制剂（AG494、AG-1478）的无血清 DMEM/F12+ 更换培养基。在接下来的 24 小时内，孵化保持在 37°C 的潮湿环境中。使用 MTT 测定和改良的结晶紫染色法 (CV) 评估酪氨酸磷酸酶对靶细胞增殖的影响。 Tecan 多重扫描平板记录仪用于测量吸光度[1]。

小鼠：随机创建 4 组体重匹配的 28 只 C57BL/6 或 ApoE^-/- 小鼠。作为正常对照组（ApoE-LF），7只小鼠饲喂标准动物低脂饮食，该饮食包含10 kcal%的脂肪、20 kcal%的蛋白质和70 kcal%的碳水化合物。其余21只小鼠饲喂高脂饮食，该饮食包含60 kcal%的脂肪、20 kcal%的蛋白质和20 kcal%的碳水化合物，持续16周。从第9周开始，通过灌胃给予AG1478或AG542，每日剂量为10 mg/kg，持续8周。对照组和高脂饮食组的小鼠仅灌胃给予溶剂（1% CMC-Na溶液）。为了确定病理性心脏肥大，在处死 ApoE^-/- 小鼠前一天进行多普勒分析。

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大鼠：本研究使用了五组雄性 Wistar 大鼠，体重约 300g。第 1 组为非糖尿病动物（对照组，C）。第 2 组接受单次腹腔注射 C+PF（10 mg/kg）。第 4 组和第 3 组分别为 C+AG-1478（1 mg/kg 腹腔注射）和 C+SF（10 mg/kg 腹腔注射）。第 5 组：大鼠接受单次腹腔注射链脲佐菌素（55 mg/kg 体重），持续四周以诱导糖尿病（D）。第6组：D+PF（10 mg/kg，腹腔注射）。第7组和第8组分别为D+SF（10 mg/kg，腹腔注射）和D+AG-1478（1 mg/kg，腹腔注射）。树状聚合物和AG1478的给药均在处死前24小时单次给药。处死动物前，分别在给药前后测量大鼠的基础血糖水平和体重。血糖水平使用自动血糖分析仪测量，与之前的研究一致，血糖水平高于250 mg/dL（约14 mM）的大鼠被判定为糖尿病。

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高脂饮食喂养动物实验[2]
经过一周的适应期后，将28只C57BL/6或ApoE−/−小鼠随机分为四组，每组体重匹配。 7只小鼠饲喂标准动物低脂饲料（含10 kcal/%脂肪、20 kcal/%蛋白质和70 kcal/%碳水化合物），作为正常对照组（Control组或ApoE-LF组）；其余21只小鼠饲喂高脂饲料（含60 kcal/%脂肪、20 kcal/%蛋白质和20 kcal/%碳水化合物），持续16周。从第9周开始，每天通过灌胃给予AG1478或542，剂量为10 mg/kg/天，持续8周。Control组和HFD组的小鼠仅灌胃给予溶剂（1% CMC-Na溶液）。在处死ApoE−/−小鼠的前一天，进行多普勒分析以确定病理性心脏肥大。小鼠用异氟烷麻醉后，使用配备15 MHz线阵超声探头的SONOS 5500超声仪进行心脏超声检查。实验结束后，所有动物均采用颈椎断头法处死。记录体重。采集血样，并在4℃下以3000 rpm离心10分钟以收集血清。无菌取出心脏，吸干水分，称重后立即置于液氮中冷冻，然后储存于-80℃冰箱中，以备后续分析。

溶于 100 mM Captisol；1 mg/kg；腹腔注射

皮下接种 A431 或 U87MG.Δ2-7 肿瘤细胞的雌性 BALB/c nu/nu 小鼠

[1]. The effect of tyrphostins AG494 and AG1478 on the autocrine growth regulation of A549 and DU145 cells. Folia Histochem Cytobiol. 2012 Jul 5;50(2):186-95.

[2]. EGFR Inhibition Blocks Palmitic Acid-induced inflammation in cardiomyocytes and Prevents Hyperlipidemia-induced Cardiac Injury in Mice. Sci Rep. 2016 Apr 18;6:24580.

[3]. Cationic Polyamidoamine Dendrimers as Modulators of EGFR Signaling In Vitro and In Vivo. PLoS One. 2015 Jul 13;10(7):e0132215.

[4]. Tyrphostin AG1478 Inhibits Encephalomyocarditis Virus and Hepatitis C Virus by Targeting Phosphatidylinositol 4-Kinase IIIα. Antimicrob Agents Chemother. 2016 Sep 23;60(10):6402-6.

Tyrphostin AG1478 属于喹唑啉类化合物，其喹唑啉环在 6 位和 7 位被甲氧基取代，4 位被 (3-氯苯基)亚硝基取代。它是一种表皮生长因子受体拮抗剂。Tyrphostin AG1478 具有多种药理活性，包括表皮生长因子受体拮抗剂、抗肿瘤药、抗衰老药和抗病毒药。它属于喹唑啉类、芳香醚类和一氯苯类化合物。Tyrphostin AG1478 是酪氨酸激酶抑制剂 Tyrphostin 家族的成员，可选择性抑制表皮生长因子。阳离子聚酰胺胺 (PAMAM) 树状聚合物是一类分支状球形聚合物，目前正在研究其在纳米医学领域的多种应用，包括核酸药物递送。新出现的证据表明，它们具有内在的生物学和毒理学效应，但人们对它们与信号转导通路的相互作用知之甚少。我们之前已证明，活化的（片段化的）第6代（G）PAMAM树状聚合物Superfect（SF）能够刺激培养的人胚肾（HEK 293）细胞中的表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶信号传导——这是一个重要的信号级联，可调节细胞生长、存活和凋亡。本研究首先探讨了非活化（完整）G6 PAMAM 树状聚合物 Polyfect (PF) 对培养的 HEK 293 细胞中 EGFR 酪氨酸激酶信号通路（通过细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2) 和 p38 丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)）的影响，然后比较了单次腹腔注射 PF 或 SF 对正常和糖尿病雄性 Wistar 大鼠肾脏中 EGFR 信号通路的体内影响。结果表明，Polyfect 对 HEK-293 细胞中 EGFR、ERK1/2 和 p38 MAPK 的磷酸化具有剂量和时间依赖性的抑制作用，与选择性 EGFR 抑制剂 AG1478 的作用相似。将树状聚合物注射到非糖尿病或糖尿病动物体内24小时后发现，PF抑制了两组动物肾脏中的EGFR磷酸化，而SF则刺激了EGFR磷酸化。PF介导的EGFR磷酸化抑制以及SF或PF介导的HEK 293细胞凋亡均可被抗氧化剂（如替莫唑胺）的联合治疗显著逆转，表明这两种效应均涉及氧化应激依赖性机制。这些结果首次表明，SF和PF PAMAM树状聚合物可在体内差异性地调节重要的EGFR信号转导通路，并可能代表一类新型的EGFR调节剂。这些发现可能对PAMAM树状聚合物在纳米医学中的应用具有重要的临床意义。[3]综上所述，我们在此鉴定出PI4KA是酪氨酸激酶抑制剂AG1478的一个新的细胞靶点。AG1478此前仅被认为是一种EGFR抑制剂和高尔基体分散剂。我们发现AG1478对EMCV和HCV具有抗病毒活性，并证实其作用机制涉及抑制PI4KA活性。我们的体外实验数据表明AG1478是PI4KA的直接抑制剂；然而，我们不能排除AG1478间接或通过两种途径共同作用于PI4KA活性的可能性。AG1478的抗病毒活性很可能与其对EGFR信号通路的影响无关，因为AG1478在低纳摩尔浓度范围内即可抑制EGFR（31），而抑制病毒复制（以及PI4KA活性）则需要微摩尔浓度。尽管EGFR抑制不太可能是AG1478抗病毒活性的原因，但未来研究AL-9（以及其他结构相关的抑制剂）是否也具有抗EGFR特性将很有意义。总之，我们的研究揭示了酪氨酸激酶抑制剂AG1478的重要细胞效应和抗病毒特性，该化合物此前被认为是一种有前景的癌症化疗药物。[4]

C16H15CL2N3O2

352.21

351.054

C, 54.56; H, 4.29; Cl, 20.13; N, 11.93; O, 9.08

170449-18-0

AG-1478;153436-53-4

3035187

Typically exists as solid at room temperature

1.337g/cm3

458.5ºC at 760mmHg

231.1ºC

1.37E-08mmHg at 25°C

4.919

56.27

2

5

4

23

360

0

ClC1=C([H])C([H])=C([H])C(=C1[H])N([H])C1C2=C([H])C(=C(C([H])=C2N=C([H])N=1)OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H].Cl[H]

WDJDYIUSDDVWKB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H14ClN3O2.ClH/c1-21-14-7-12-13(8-15(14)22-2)18-9-19-16(12)20-11-5-3-4-10(17)6-11;/h3-9H,1-2H3,(H,18,19,20);1H

N-(3-chlorophenyl)-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amine;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)