Retinoic Acid Receptors (RARs) - α, β, and γ subtypes (antagonist) [1]

Kd: 2 nM (RARα), 2 nM (RARβ), 3 nM (RARγ)[1]

AGN 193109 是一种非常有效的维甲酸受体拮抗剂，对 RARα、RARβ 和 RARγ 等受体的 Kd 值分别为 2 nM、2 nM 和 3 nM。由于它不与任何 RXR 结合或通过其进行反式激活，因此 AGN 193109 具有完全的 RAR 特异性[1]。在 ECE16-1 细胞中，AGN 193109 (100 nM) 可抑制 TTNPB（一种维甲酸受体激动剂）诱导的形态学改变。在 ECE16-1 细胞中，AGN 193109 在 100 nM 浓度下完全抑制了维甲酸依赖的生长，但在 10 nM 浓度下则部分逆转了这种抑制作用。此外，TTNPB诱导的K5、K6、K14、K16和K17水平降低以及K7、K8和K19水平升高可被AGN193109 (100 nM)消除[2]。

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类维生素A是重要的生理因子，可调节上皮细胞的分化和增殖。这些因子在调节生长、发育和分化中的重要性促使人们寻找新的类维生素A激动剂和拮抗剂。在本研究中，我们发现类维生素A类似物AGN193109是人宫颈上皮细胞中类维生素A作用的有效拮抗剂。用天然或合成的维甲酸类药物处理ECE16-1细胞可降低细胞角蛋白K5、K6、K14、K16和K17的水平，增加细胞角蛋白K7、K8和K19的水平，增加维甲酸受体β (RARβ) mRNA的水平，抑制细胞增殖并改变细胞形态。与AGN193109联合处理可阻止这些反应。AGN193109与维甲酸激动剂的摩尔比分别为1:1和10:1时，分别观察到半数最大和最大拮抗作用。单独使用AGN193109时，不具有激动剂活性。因此，AGN193109 能分别以 2、2 和 3 nM 的 Kd 值与 RARα、RARβ 和 RARγ 结合，但不能与视黄醇 X 受体结合，是 ECE16-1 细胞中视黄醇作用的高效拮抗剂[2]。

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在使用杆状病毒表达的 RAR 进行的受体结合实验中，AGN 193109 对所有三种 RAR 亚型均具有极高的亲和力，RARα、RARβ 和 RARγ 的 Kd 值分别为 2 nM、2 nM 和 3 nM。这比天然激素全反式视黄酸 (RA) 的亲和力高约 4-6 倍。 [1]
- AGN 193109 具有完全的 RAR 特异性，因为它不与任何视黄酸 X 受体（RXRα、β 或 γ）结合或通过它们进行转录激活。[1]
- 在用共转染了 RAR 全受体和 TREpɑl-荧光素酶报告基因的 CV-1 细胞进行的转录激活实验中，AGN 193109 在任何三种 RAR 亚型上均未显示出任何激动剂活性，即使在受体饱和浓度下也是如此。[1]
- AGN 193109 能有效拮抗 RA 诱导的转录活性。在等摩尔浓度 (10⁻⁸ M) 下，它对 RARα、RARβ 和 RARγ 的 RA 活性分别抑制约 85%、62% 和 100%。 10倍过量的AGN 193109（10⁻⁷ M）完全抑制了RA在所有三种RAR上的转录激活活性。[1] 在其他实验中也进一步证实了AGN 193109的拮抗活性，包括在嵌合雌激素受体-RAR转录激活实验中对RA活性的剂量依赖性抑制，以及在稳定转染RARβ和RARγ的3T3细胞中对RAR激动剂诱导的转谷氨酰胺酶的抑制。[1]

AGN 193109 (1.15 μmol/kg) 可降低 TTNPB 诱导的小鼠脾脏重量增加，但不会引起明显的毒性反应，也不会影响动物的脾脏重量。此外，AGN 193109 可显著减轻 ATRA 引起的皮肤毒性。局部应用 AGN 193109 (0.30 或 1.20 μmol/kg) 可有效降低口服 TTNPB 联合治疗引起的皮肤毒性和体重减轻[3]。

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AGN 193109 近期被鉴定为一种有效的体外维甲酸受体 (RAR) 拮抗剂。本研究旨在确定 AGN 193109 是否在体内发挥 RAR 拮抗剂的作用，从而预防和/或治疗维甲酸类药物毒性。雌性无毛小鼠连续5天局部涂抹合成的维甲酸受体激动剂(E)-4-[2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)丙烯-1-基]苯甲酸(TTNPB)，单独使用或与1倍、4倍或16倍摩尔过量的AGN 193109联合使用。TTNPB引起皮肤脱屑、皮肤擦伤和脾肿大，而AGN 193109联合治疗可剂量依赖性地阻断这些效应。在同一模型中，AGN 193109还能减轻天然RAR激动剂全反式维甲酸引起的局部刺激。为了确定局部应用 AGN 193109 是否能阻断口服维甲酸引起的毒性，研究人员给小鼠灌胃给予 TTNPB（0.75 μmol/kg/天），并局部应用 0、0.3 或 1.2 μmol/kg/天的 AGN 193109，连续 4 天。单独使用 TTNPB 治疗可引起皮肤刺激和体重减轻，而 AGN 193109 联合治疗可抑制这些效应。为了确定 AGN 193109 是否可用于治疗已存在的维甲酸中毒，研究人员在第 1-2 天对小鼠进行局部预处理，使用 TTNPB（0.72 μmol/kg/天），然后在第 3-5 天分别使用 0、1.44、7.2 或 36.0 μmol/kg 的 AGN 193109 进行局部治疗。TTNPB 预处理导致小鼠体重急剧下降，且在未进行 AGN 193109 干预的情况下，死亡率高达 60%。所有剂量水平的 AGN 193109 治疗均显著加速了 TTNPB 中毒小鼠的体重恢复，并阻止了其死亡。这些数据表明，AGN 193109 是一种有效的 RAR 拮抗剂，并且是一种潜在的体内维甲酸中毒解毒剂。除了在预防和治疗维甲酸毒性方面的潜在临床应用外，AGN 193109 还应成为阐明维甲酸生物学的有力实验工具[3]。

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在雌性无毛小鼠中，局部联合使用AGN 193109可剂量依赖性地阻断 RAR 特异性激动剂 TTNPB 诱导的皮肤毒性（皮肤脱屑和擦伤）和脾肿大。等摩尔剂量的AGN 193109可显著降低局部刺激，而 16 倍摩尔过量的剂量则可完全阻断刺激。此外，它还能逆转 TTNPB 诱导的体重减轻。 [3] - 在同一小鼠模型中，AGN 193109 显著降低了天然 RAR 激动剂全反式维甲酸 (ATRA) 引起的局部刺激（皮肤毒性评分从 6 ± 1 降至 2 ± 1）。[3] - 当口服 TTNPB（0.75 μmol/kg/天，连续 4 天）诱导全身毒性时，局部应用 AGN 193109（0.30 或 1.20 μmol/kg/天）以剂量依赖的方式显著降低了由此产生的体重减轻和皮肤毒性。较高剂量的 AGN 193109 几乎完全阻断了这些作用。 [3] 在预先建立的毒性模型中，小鼠预先接受高剂量局部TTNPB（0.72 μmol/kg/天）治疗2天，导致严重体重下降和60%的死亡率。随后在第3-5天局部应用AGN 193109（1.44、7.2或36.0 μmol/kg/天）治疗，显著加速了体重恢复，并阻止了所有治疗组的死亡（0%死亡率），表明其具有作为维甲酸中毒解毒剂的潜力。[3]

蛋白质和核酸方法[2]
按照先前描述的方法制备poly(A)+ RNA，进行电泳，转移至尼龙膜，并与编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶、细胞角蛋白K6或RARβ的32P标记的cDNA进行杂交。为了检测细胞角蛋白，用[35S]甲硫氨酸标记ECE16-1细胞，并按照先前描述的方法制备细胞角蛋白，进行二维电泳。

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将细胞（10,000 个/cm²）接种于完全培养基中，并使其过夜贴壁。然后将细胞转移至限定培养基（DM）中，平衡 24 小时后，加入新鲜的 DM 或含有表皮生长因子 (EGF) 或类视黄醇的 DM 开始处理。每日用类视黄醇处理 3 天后，用 0.025% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 消化收集细胞，用含 4% 甲醛的等渗缓冲液固定，并使用计数器进行计数[2]。

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RAR 转录激活分析：将 CV-1 细胞与荧光素酶报告质粒 (ΔMTV-TREp-LUC) 和指定类视黄醇受体（RARα、RARβ 或 RARγ）的表达载体共转染。随后，用不同浓度的全反式维甲酸 (RA) 或 AGN 193109 处理细胞，以评估激动剂活性。对于拮抗剂活性测定，用固定浓度的 RA (10⁻⁸ M) 处理细胞，该浓度可诱导显著的转录活性，同时加入递增浓度的 AGN 193109。通过测定荧光素酶活性来量化转录激活。[1] - 受体结合实验：通过竞争性结合实验测定 AGN 193109 与 RAR 的结合亲和力 (Kd)。将杆状病毒表达的 RAR（α、β 和 γ）与 5 nM 的 [³H]-(all-E)-维甲酸和递增浓度的未标记测试类视黄醇 (AGN 193109) 孵育。利用 Cheng 和 Prusoff 的方程，根据竞争曲线计算 Kd 值。[1]

动物：**本研究使用5-11周龄的雌性无毛小鼠（Crl:SKH1-hrBR）。实验期间，小鼠单独饲养，可自由摄取食物和水。[3]
- **药物配制和给药：**将维甲酸类药物溶解于含有丙酮和DMSO的溶剂中（不同比例，例如97.6%丙酮/2.4% DMSO、92.5%丙酮/7.5% DMSO或70%丙酮/30% DMSO），用于局部外用。口服给药时，将TTNPB溶解于玉米油中。局部外用药物以4或6 mL/kg的剂量涂抹于整个背部皮肤表面。口服药物通过灌胃给药。所有给药均每日一次。 [3] - **实验 1（局部联合治疗）：** 小鼠（每组 n=5-6）局部接受为期 5 天的治疗，治疗药物分别为赋形剂、TTNPB（0.072 μmol/kg）、AGN 193109（1.15 μmol/kg）或 TTNPB（0.072 μmol/kg）联合递增剂量的 AGN 193109（0.072、0.288 或 1.15 μmol/kg）。于第 8 天处死小鼠。测量小鼠的体重、皮肤毒性（每日记录脱屑和擦伤情况）以及脾脏重量。 [3]
- **实验 2（口服 TTNPB + 局部应用 AGN 193109）：** 小鼠（每组 n=5-6）连续 4 天口服 TTNPB（0.75 μmol/kg/天）或赋形剂（玉米油），同时局部应用 AGN 193109（0.3 或 1.20 μmol/kg/天）或赋形剂。第 5 天处死小鼠。评估体重变化和皮肤毒性。[3]
- **实验 3（治疗预先存在的毒性）：** 小鼠（每组 n=5）在第 1-2 天局部预先应用高剂量 TTNPB（0.72 μmol/kg/天）。在第3-5天，小鼠局部涂抹赋形剂或AGN 193109（1.44、7.2或36.0 μmol/kg/天）。对照组全程涂抹赋形剂。每日监测小鼠体重并记录死亡率。小鼠于第8天安乐死。[3]
- **皮肤毒性评分：**采用半定量评分法每日对皮肤脱屑（0-5分）和擦伤（0-4分）进行评分。将这些评分合并计算综合“皮肤毒性评分”（范围0-17分），该评分考虑了最大严重程度、平均严重程度和发病时间。[3]

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动物：使用5-11周龄的雌性无毛小鼠（Crl:SKH1-hrBR）。实验期间，小鼠单独饲养，可自由获取食物和水。 [3]
- 药物配制和给药：将维甲酸类药物溶解于含有丙酮和二甲基亚砜（DMSO）的溶剂中（不同比例，例如97.6%丙酮/2.4% DMSO、92.5%丙酮/7.5% DMSO或70%丙酮/30% DMSO），用于局部外用。口服给药时，将TTNPB溶解于玉米油中。局部外用药物以4或6 mL/kg的剂量涂抹于整个背部皮肤表面。口服药物采用灌胃给药。所有给药均每日一次。 [3] - 实验 1（局部联合治疗）：小鼠（每组 n=5-6）局部用药 5 天，分别用赋形剂、TTNPB（0.072 μmol/kg）、AGN 193109（1.15 μmol/kg）或 TTNPB（0.072 μmol/kg）联合递增剂量的 AGN 193109（0.072、0.288 或 1.15 μmol/kg）进行治疗。第 8 天处死小鼠。测量体重、皮肤毒性（每日记录脱屑和擦伤情况）和脾脏重量。 [3]
- 实验 2（口服 TTNPB + 局部应用 AGN 193109）：小鼠（每组 n=5-6 只）连续 4 天口服 TTNPB（0.75 μmol/kg/天）或赋形剂（玉米油），同时局部应用 AGN 193109（0.3 或 1.20 μmol/kg/天）或赋形剂。第 5 天处死小鼠。评估体重变化和皮肤毒性。[3]
- 实验 3（治疗预先存在的毒性）：小鼠（每组 n=5 只）在第 1-2 天局部预先应用高剂量 TTNPB（0.72 μmol/kg/天）。在第3-5天，小鼠局部涂抹赋形剂或AGN 193109（1.44、7.2或36.0 μmol/kg/天）。对照组全程涂抹赋形剂。每日监测小鼠体重并记录死亡率。小鼠于第8天处死。[3]
- 皮肤毒性评分：采用半定量评分法每日对皮肤脱屑（0-5分）和擦伤（0-4分）进行评分。将这些评分合并计算综合“皮肤毒性评分”（范围0-17分），该评分考虑了最大严重程度、平均严重程度和发病时间。[3]

在预先进行的毒性实验中，小鼠先用TTNPB（0.72 μmol/kg/天，连续2天）预处理，然后给予溶剂对照，死亡率达60%。随后，用AGN 193109进行所有剂量水平（1.44、7.2或36.0 μmol/kg/天）的治疗，完全阻止了这种死亡（死亡率为0%）。[3] 单独使用AGN 193109，局部给药剂量高达8 μmol/kg，连续5天，或36 μmol/kg，连续3天，均未引起明显的体重减轻、死亡或可检测到的皮肤刺激（皮肤毒性评分0-1），表明其在该模型中具有良好的耐受性。高剂量组（1.15 μmol/kg）中有一只小鼠死亡，但由于其他动物未出现毒性反应，且后续实验中更高剂量也未出现毒性反应，因此该死亡被认为与治疗无关。[3]

[1]. Synthesis and characterization of a highly potent and effective antagonist of retinoic acid receptors. J Med Chem. 1995 Nov 24;38(24):4764-7.

[2]. AGN193109 is a highly effective antagonist of retinoid action in human ectocervical epithelial cells. J Biol Chem. 1996 May 24;271(21):12209-12.

[3]. Specific antagonist of retinoid toxicity in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 1996 May;138(1):169-75.

基于已知的拮抗剂 AGN 193109 (2)，制备了一系列高亲和力视黄酸受体 (RAR) 拮抗剂。引入不同的苯基后发现，对位取代比间位取代更具优势。对 RAR 具有最高亲和力的拮抗剂含有疏水基团，但极性官能团的存在也表现出良好的耐受性。Bioorg Med Chem Lett. 1999 Feb 22;9(4):573-6. doi: 10.1016/s0960-894x(99)00047-5.

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AGN193109 拮抗 ECE16-1 细胞中的一系列反应[2]
视黄醇对组织和细胞产生多种作用，不同类型的视黄醇在细胞系内和细胞系间可能产生不同的作用。在ECE16-1细胞中，RAR特异性配体的视黄醇活性强于RXR特异性配体。本研究探讨了一种新型合成类视黄醇AGN193109对ECE16-1细胞中多种类视黄醇依赖性反应的影响。我们发现AGN193109能够消除类视黄醇诱导的细胞形态变化，并阻止类视黄醇对细胞增殖的抑制作用。此外，在生化水平上，AGN193109也阻止了类视黄醇诱导的标志基因表达变化。我们检测了类视黄醇处理后上调的基因（K7、K8、K19、RARβ）和下调的基因（K5、K6、K14、K16、K17）。结果表明，AGN193109能够拮抗类视黄醇依赖性反应。因此，AGN193109能够抑制刺激性和抑制性反应。总之，这些结果表明AGN193109可能是ECE16-1细胞中类视黄醇作用的全局拮抗剂（即，它可能拮抗大部分甚至全部类视黄醇依赖性反应）。
AGN193109是一种高效的拮抗剂，不具有激动剂活性[2]
受体拮抗剂可能存在一些问题。首先，它们可能具有部分激动剂活性。这使得解释它们在体内系统中的作用变得复杂。为了确定AGN193109是否具有内在的激动剂或拮抗剂活性，我们在不添加类视黄醇激动剂的情况下评估了其对ECE16-1细胞功能的影响。浓度范围为0.01至1000 nM的AGN193109未引起细胞形态、细胞增殖或类视黄醇反应标志基因表达的任何可检测变化。基于这些结果，我们得出以下结论：(i) AGN193109 是这些细胞中类视黄醇活性的高效拮抗剂；(ii) 它本身不具有激动剂活性。其次，拮抗剂可能对靶受体的亲和力较低。此类配体必须以极高的浓度使用才能发挥其拮抗作用。然而，AGN193109 对 RAR 的亲和力为 2–3 nM。考虑到 tRA、13-cRA 和 9-cRA 的受体亲和力范围为 7 至 141 nM，而 TTNPB 的亲和力范围为 20 至 51 nM，AGN193109 是一种高亲和力配体。这体现在其抑制生物效应末端反应的有效性上。该化合物在 10 倍摩尔过量浓度下对类视黄醇激动剂活性表现出最佳抑制效果。在等摩尔浓度下，其抑制作用为最大抑制作用的一半。因此，AGN193109 是一种高亲和力拮抗剂。
与 RAR 和 RXR 受体相互作用的天然配体[2]
我们最初的研究表明，合成类视黄醇 AGN193109 仅与 RAR 受体相互作用，并能有效拮抗 RAR 特异性类视黄醇激动剂 TTNPB。然而，AGN193109 是否会抑制天然配体的活性尚不清楚。因此，我们测试了 AGN193109 拮抗 tRA、13-cRA 和 9-cRA 作用的能力。13-cRA、9-cRA 和 tRA 均与 RAR 相互作用，而 9-cRA 对 RXR 也具有高亲和力。结果表明，AGN193109 是这些配体活性的有效拮抗剂。因此，尽管 AGN193109 仅与 RAR 形式相互作用，但它也能拮抗一种对 RAR 和 RXR 均具有高亲和力的药物（9-cRA）的作用。由于 AGN193109 不与 RXR 相互作用，因此它不太可能直接阻断 9-cRA 与 RXR 受体之间的相互作用。此外，RXR 特异性配体在 ECE16-1 细胞中的活性相对较低 (37)。由于 9-cRA 可以有效地与 RAR 结合，AGN193109 的作用机制可能是通过抑制 RAR 介导的 9-cRA 效应。[2] 受体拮抗剂是非常有用的配体，既可用于理解作用机制，也可用于设计新的治疗方法。在本研究中，我们利用人宫颈上皮外细胞系ECE16-1证实，AGN193109是一种高活性、高亲和力的类视黄醇拮抗剂，且似乎不具有内在的类视黄醇激动剂活性。[2]

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AGN 193109（化合物4）是一种基于二芳基乙炔的类视黄醇，代表了一类新型的RAR拮抗剂。据描述，它是当时（1995年）已知的所有三种RAR亚型中最有效、最强效的拮抗剂。[1]
- 其作用机制涉及与RAR的高亲和力结合，但与全反式视黄酸等激动剂不同，它会诱导受体发生不同的构象变化。这会阻止辅激活蛋白的募集，并阻断信号转导至转录机制，从而抑制基因转录。 [1]
- 该化合物被开发为一种强大的研究工具，用于明确 RAR 激素通路在发育和成年动物中的精确生理功能，并阐明 RAR 介导的转录调控的分子机制。[1]
- AGN 193109 也被认为是一种极具价值的先导化合物，可用于探索 RAR 拮抗剂在疾病模型中的潜在药理学应用。其一项拟议的治疗应用是预防和治疗与全身性维甲酸治疗相关的副作用，例如皮肤黏膜毒性。[1]

C28H24O2

392.498

392.178

C, 85.68; H, 6.16; O, 8.15

171746-21-7

AGN 193109;171746-21-7;AGN 193109-d7;1216429-25-2

177238

Off-white to light yellow solid powder

1.21 g/cm3

564.5ºC at 760 mmHg

257.1ºC

6.206

37.3

1

2

4

30

716

0

NCEQLLNVRRTCKJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C28H24O2/c1-19-4-11-22(12-5-19)24-16-17-28(2,3)26-15-10-21(18-25(24)26)7-6-20-8-13-23(14-9-20)27(29)30/h4-5,8-16,18H,17H2,1-3H3,(H,29,30)

4-[2-[5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-6H-naphthalen-2-yl]ethynyl]benzoic acid

AGN-193109; AGN 193109; 171746-21-7; AGN193109; AGN-193109; 4-[2-[5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-6H-naphthalen-2-yl]ethynyl]benzoic acid; CHEMBL358145; ZC6062V1O9; AGN 193109 (GMP); AGN193109

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~2 mg/mL (~5.10 mM)

配方 1 中的溶解度: 12.5 mg/mL (31.85 mM) in 15% Cremophor EL 85% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5 mg/mL (12.74 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。