AM-5308

KIF18A

在这项研究中，研究人员筛选了多种化合物的小分子文库，用于选择性抑制KIF18A mt - atp酶运动活性。在细胞中发现了两个化合物hit，它们表型复制了KIF18A KD的作用;这些hit在结构上不同于KIF18A抑制剂BTB-1)。接下来，研究人员发起了一项药物化学筛选，以优化有希望的Hit，化合物3 (AM-7710);结构-活性关系(SAR)研究产生了四个有希望的系列类似物，分别代表早期SAR导联(AM-0277, AM-1882)和晚期SAR导联(AM-5308 ， AM-9022 )(图(Fig.2a).2a)。与AM-7710相比，这四种化合物在kif18a抑制活性和细胞效力方面均有显著改善，并且对多种运动蛋白表现出良好的特异性，除了KIF19A运动蛋白(图1)。2b2b和扩展数据图2a-c)。[1]

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5株细胞株对AM-0277、AM-1882和AM-9022 敏感，平均半最大有效浓度(EC50)分别为0.047µM、0.021µM和0.045µM。[1]

为了研究KIF18A在体内的抑制作用，研究人员选择了AM-1882和AM-5308 ，基于它们在啮齿动物中通过腹腔(i.p)给药获得的可接受血浆暴露，以及它们在OVCAR-3 ph -3有丝分裂标记物测定中的两位数纳摩尔效价(扩展数据图Fig. Fig.7a)。研究人员证实，AM-1882和AM-5308 对人和小鼠KIF18A的运动活性具有相似的抑制作用，它们在运动结构域中具有90%的氨基酸同源性(扩展数据图7b,c)。这使我们能够评估小鼠对kif18a抑制剂的耐受性。[1]

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为了研究我们的KIF18A抑制剂的药效学(PD)效果，我们给患有OVCAR-3细胞系来源的异种移植瘤(CDX)肿瘤的小鼠注射了载药AM-1882(每公斤100毫克)或AM-5308 (每公斤50毫克)。治疗24 h后采集肿瘤及血液样本进行ph - 3 PD及药代动力学(PK)分析。AM-1882和AM-5308 分别使OVCAR-3肿瘤中pH3有丝分裂标志物水平升高5.9倍(P值= 0.0068)和7.1倍(P值= 0.0022)(图(Fig.5a).5a)。AAM-5308 在肿瘤中的暴露量高于血浆，而AM-1882在两者中的暴露量相似。接下来，研究人员选择AM-5308 进行肿瘤PD成像评估。已建立OVCAR-3肿瘤的小鼠以25 mg / kg的剂量给药给药或AM-5308  2 d。AM-5308 使OVCAR-3肿瘤中pH3有丝分裂标志物计数增加12.7倍(P值= 0.037)，有丝分裂细胞特征异常。[1]

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为了确定我们的KIF18A抑制剂所观察到的强大PD效应是否会产生疗效，我们给患有OVCAR-3肿瘤的小鼠注射了载药AM-1882(每公斤100毫克)或AM-5308 (每公斤25毫克)，每天18天。作为阳性对照，小鼠给予多西紫杉醇20 mg / kg，每周1次。AM-1882和AM-5308 抑制肿瘤生长(P值≤1.3 × 10−89)，有肿瘤消退的证据(TR;分别为73%和46%)(图(Fig.5c)。多西紫杉醇治疗导致74%的肿瘤生长抑制(TGI) (P值= 8.8 × 10−41)。我们的KIF18A抑制剂对小鼠具有良好的耐受性，体重或血细胞计数没有变化(图1)。图7d).7d)。相比之下，多西紫杉醇降低中性粒细胞计数(P值= 5.0 × 10−4)。研究结束时，AM-1882和AM-5308 的血浆AUC值分别为123和45µM·h。[1]

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为了进一步研究KIF18A抑制剂的体内活性，我们评估了OVCAR-8 CDX肿瘤模型。已建立肿瘤的小鼠每天给药50或100 mg / kg AM-1882或25或50 mg / kg AM-5308 ，持续18 d。AM-1882和AM-5308 抑制肿瘤生长(P值≤1.7 × 10−61)，具有TR作用(分别为16%或73% TR和19%或75% TR)(图(Fig.5e)。与之前一样，小鼠对KIF18A的抑制具有良好的耐受性(图(Fig.5e)。在OVCAR-8研究中，25 mg / kg AM-5308 的血浆AUC值高出2.6倍，而AM-1882在CDX研究中也显示出类似的暴露(扩展数据图7e)。停止治疗后，研究人员对小鼠进行监测，以确定治疗的持久性和肿瘤再生的时间。除了AM-5308 组的一只动物外，在kif18a抑制剂治疗下消退的OVCAR-8肿瘤表现出延迟恢复生长。[1]

运动蛋白测定[1]
使用ADP-Glo发光法(Promega)评估运动活性，使用先前描述的分析条件。表达和纯化重组截断的马达蛋白(hKIF18A (1 - 467,4 nM)， mKIF18A (1 - 467,4 nM)， hKIF19A(1 - 463,32或100 nM)， hKIF18B (1 - 436,8 nM)， hKIFC1 (266 - 673,4 nM))或获得(hEG5, 4 nM;hCENP-E, 8 nM)。化合物用30µM ATP和30µg ml - 1 MTs和上述运动蛋白浓度进行评估;数据来自两个或四个独立的实验。KIF18A化合物用hif18a (160 nM)检测或不检测MTs(0或30µg ml−1);数据来自两个独立的实验，一式两份。KIF18A化合物用30或300µM ATP和5或80µg ml - 1 mt的hKIF18A (4 nM)进行评估;数据来自一个实验。am -7710系列模拟mt - atp酶IC50值来自Amgen的Genedata Screener数据存储(扩展数据图Fig. Fig.2a2a)。

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酶联无机磷酸盐马达测定[1]
KIF18A化合物(1µM)与一组运动蛋白(hCENP-E, hEG5, hKIFC3, hKIF3C，人染色体动力学蛋白，hMCAK, hMKLP1, hMKLP2)进行酶联无机磷酸盐测定，根据制造商的方案和前面所述。数据来自一个或两个独立的实验，有两份或三份。研究由Cytoskeleton进行[1]

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Kinome结合试验[1]
KIF18A化合物(1µM)与一组激酶(n = 96)使用上文所述的竞争结合法进行评估。数据来自一个实验。研究由Eurofins DiscoverX进行。[1]

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Tubulin-polymerization化验[1]
荧光微管蛋白聚合实验根据制造商的方案(Cytoskeleton)，用DMSO、KIF18A化合物(10µM)、紫杉醇(5µM)和诺可达唑(5µM)进行。微管蛋白聚合使用SpectraMax M5平板阅读器(Molecular Devices)进行检测，检测波长为440 nm，在37°C下每分钟测量一次，持续90分钟。数据来自一个或三个独立的实验。数据以平均荧光强度与时间的关系以及相应的AUC值作图。

周心蛋白和α-微管蛋白染色(复合)[1]
将MDA-MB-157细胞接种于双孔玻片，培养2 d。细胞分别用DMSO、AM-1882(0.2µM)或AM-5308 (0.5µM)处理24 h。固定、染色和成像如前所述28。数据来自一个实验。为每个治疗条件捕获代表性图像。[1]

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细胞周期和细胞生长测定(化合物)[1]
如前所述，将4个正常供体的人骨髓单个核细胞扩增8 d。细胞接种于24孔板，分别用DMSO或KIF18A化合物(1µM)、ispinesib(0.05µM)、紫杉醇(0.1µM)和palbociclib(1µM)处理。两名供者的AM-5308 和AM-9022进行评估;其他测试化合物在四个供体的独立实验中进行评估。在48 h(细胞周期)或96 h(细胞生长)时收集分离板。第一组板用BrdU脉冲处理2小时，并按前面描述的方法处理57。使用运行FACSDiva软件的BD LSRFortessa流式细胞仪分析细胞，使用FSC Express软件进行采集后分析。用Vi-CELL XR分析仪从第二组板上收集细胞并计数。绘制细胞周期(BrdU, sub-G1)和细胞生长(计数)数据。采用单因素方差分析确定各组相对于DMSO对照组的显著性水平为0.05，并进行Dunnett多重性校正。

OVCAR-3 肿瘤药效学 (pH3 免疫测定)[1]
\n肿瘤药效学测定按先前所述方法进行²⁸。根据肿瘤大小，将动物随机分为治疗组（每组 n = 3 只小鼠），并分别给予赋形剂（腹腔注射或口服）、AM-1882（100 mg/kg，腹腔注射）、AM-5308（50 mg/kg，腹腔注射）或 AM-9022（30 mg/kg，口服）。治疗 24 小时后收集肿瘤和血浆，并进行药效学 (pH3) 或药代动力学 (血浆、肿瘤) 分析。绘制肿瘤药效学、血浆药代动力学和肿瘤药代动力学数据图。采用单因素方差分析（ANOVA）在0.05的显著性水平下，并使用Dunnett多重比较校正，确定AM-1882和AM-5308相对于载体的统计学显著性；采用双尾t检验在0.05的显著性水平下，并使用Welch校正，确定AM-9022相对于载体的统计学显著性。[1]

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\n\nOVCAR-3肿瘤PD（pH3成像）[1]
\n将OVCAR-3细胞（5.0 × 10⁶）皮下注射到小鼠右侧腹部。根据肿瘤大小，将动物随机分为治疗组（每组3只小鼠），并连续2天分别给予载体或AM-5308（25 mg/kg，腹腔注射）。治疗24小时后收集肿瘤，并进行肿瘤成像分析。将福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片贴于载玻片上，脱蜡、复水后，用柠檬酸缓冲液和加热法进行抗原修复（Reveal Decloaker，Biocare Medical）。切片封闭后，在洗涤缓冲液中与抗α-微管蛋白（T6199，Sigma）和抗pH3（06-570，Millipore）抗体于4℃孵育过夜。切片洗涤两次后，与二抗（抗小鼠IgG Alexa Fluor 488（A11029，Invitrogen）和抗兔IgG Alexa Fluor 647（A-21244，Invitrogen））于室温孵育2小时。切片洗涤两次后，用DAPI复染。封片前加入ProLong抗淬灭剂。使用配备Volocity软件（PerkinElmer）的UltraVIEW VoX共聚焦荧光显微镜对切片进行成像。首先使用 20 倍物镜进行初步扫描，为每个肿瘤选择三个感兴趣区域，然后对每个区域的 pH3+ 计数进行计数。使用 60 倍物镜采集 DNA、α-微管蛋白和 pH3 通道的代表性最大投影图像。绘制肿瘤 PD 数据图。采用 Welch 校正的非配对双尾 t 检验，在 0.05 的显著性水平下，确定 AM-5308 相对于载体的统计学显著性。[1]

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\n\n细胞系来源的异种移植瘤模型疗效（腹腔注射给药）[1]
\n将 OVCAR-3 细胞 (5.0 × 10⁶) 皮下注射到小鼠右侧腹部。根据肿瘤大小，将动物随机分为各治疗组（每组 n = 10 只小鼠），并分别腹腔注射赋形剂、AM-1882（100 mg/kg）或 AM-5308（25 mg/kg），每日一次，连续 18 天；或每周一次，同时注射多西他赛（20 mg/kg）。分别于给药后 2、4、8、16 和 24 小时进行血浆药代动力学分析（每个时间点 n = 2 只小鼠）。在第 42 天最后一次给药后，采集小鼠血样（每组 n = 6 只小鼠）由 IDEXX BioResearch 进行血细胞计数分析；由于技术处理问题，未报告血小板计数。绘制小鼠血细胞计数（中性粒细胞、网织红细胞、红细胞、淋巴细胞和白细胞）的图表。采用单因素方差分析（ANOVA），显著性水平为0.05，并使用Dunnett多重比较校正，确定各治疗组相对于载体组的统计学显著性。小鼠右侧腹部皮下注射CAL-51细胞（5.0 × 10⁶）。根据肿瘤大小将动物随机分为各治疗组（每组10只小鼠），并分别腹腔注射载体、AM-1882（100 mg/kg）或AM-5308（25 mg/kg），每日一次，连续18天；或每周两次联合吉西他滨（120 mg/kg）。在第36天最后一次给药后，按上述方法进行血浆药代动力学分析。小鼠右侧腹部皮下注射OVCAR-8细胞（5.0 × 10⁶）。根据肿瘤大小，将动物随机分为各治疗组（每组 n = 10 只小鼠），并连续 18 天每日腹腔注射赋形剂、AM-1882（50 或 100 mg/kg）或 AM-5308（25 或 50 mg/kg）。在第 46 天最后一次给药后，采用眼眶后静脉丛取血，并按上述方法进行血浆药代动力学分析。治疗结束后，记录肿瘤体积和体重直至第 81 天。第 81 天未检测到肿瘤的小鼠被归类为无瘤小鼠。[1]

[1]. Kif18a inhibitors for treatment of neoplastic diseases. WO2021211549A1.

染色体不稳定性（CIN）是癌症的标志性特征之一，由有丝分裂过程中染色体分离的持续错误引起。侵袭性癌症，例如高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和三阴性乳腺癌（TNBC），具有较高的CIN和TP53突变频率。本文研究表明，KIF18A马达蛋白抑制剂能够激活有丝分裂检查点，并选择性地杀死染色体不稳定的癌细胞。在具有CIN特征的TP53突变型HGSOC和TNBC细胞系中，KIF18A抑制剂的敏感性显著增强，其中包括部分CCNE1扩增、CDK4-CDK6抑制剂耐药和BRCA1改变的细胞系模型。与其他抗有丝分裂药物不同，我们的KIF18A抑制剂对体外培养的人骨髓细胞的损害极小。在小鼠中，抑制 KIF18A 可产生显著的抗癌效果，在耐受剂量下，人类 HGSOC 和 TNBC 模型中均观察到肿瘤消退。总而言之，我们的研究结果为通过抑制 KIF18A 选择性靶向 CIN 癌症提供了一种合理的治疗策略。[1]

C26H35N5O5S

529.65

529.2358

2410796-89-1

153625074

White to light yellow solid powder

3

133Ų

3

9

8

37

884

1

C(NC1=NC(N2CCO[C@H](C)C2)=CC=C1)(=O)C1=CC=C(NS(CCO)(=O)=O)C=C1N1CCC2(CC2)CC1

IUDCFCQNVQWCCI-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C26H35N5O5S/c1-19-18-31(13-15-36-19)24-4-2-3-23(27-24)28-25(33)21-6-5-20(29-37(34,35)16-14-32)17-22(21)30-11-9-26(7-8-26)10-12-30/h2-6,17,19,29,32H,7-16,18H2,1H3,(H,27,28,33)/t19-/m1/s1

2-(6-azaspiro[2.5]octan-6-yl)-4-(2-hydroxyethylsulfonylamino)-N-[6-[(2R)-2-methylmorpholin-4-yl]pyridin-2-yl]benzamide

AM-5308; 2410796-89-1; CHEMBL5085449; SCHEMBL22152106; (R)-AM-5308;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~188.80 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.72 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.72 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。