AM-5308

KIF18A
AM-5308 targets KIF18A, a member of the kinesin-8 family of microtubule motors that plays a critical role in mitotic spindle dynamics and chromosome segregation. KIF18A regulates microtubule length and stability during mitosis, ensuring proper chromosome alignment and segregation. By inhibiting KIF18A-mediated microtubule ATPase activity, AM-5308 disrupts spindle assembly and chromosome segregation, leading to mitotic checkpoint activation and cell cycle arrest. This mechanism of action results in antitumor activity. The compound shows selectivity for KIF18A over a panel of diverse kinesin motor proteins, with modest inhibition of KIF19A (IC50 = 224 nM). Its favorable profile against normal cell types distinguishes it from traditional anti-mitotic agents.

在本研究中，研究人员筛选了一个包含多种化合物的小分子库，以寻找KIF18A MT-ATPase马达活性的选择性抑制剂。他们发现了两个化合物先导化合物，这两个化合物在细胞中模拟了KIF18A KD的作用；这两个先导化合物的结构与KIF18A抑制剂BTB-1（参考文献27,28）截然不同。接下来，研究人员启动了一项药物化学研究，以优化有前景的先导化合物3（AM-7710）28；构效关系（SAR）研究最终获得了四个有前景的系列类似物，分别代表了早期SAR先导化合物（AM-0277、AM-1882）和晚期SAR先导化合物（AM-5308、AM-9022）（图2a）。与 AM-7710 相比，所有四种化合物均显示出 KIF18A 抑制活性和细胞效力显著提高，并且对多种不同的驱动蛋白表现出良好的特异性，但 KIF19A 除外（图 2b 和扩展数据图 2a-c）。[1]

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在体外，AM-5308 在驱动蛋白-8 微管 (MT)-ATPase 马达活性测定中表现出对 KIF18A 的强效抑制作用，IC50 为 47 nM。该化合物对多种不同的驱动蛋白表现出良好的特异性，但 KIF19A 除外（IC50 = 224 nM）。AM-5308 可激活有丝分裂检查点并调节细胞分裂过程，包括染色体分离和纺锤体组装。在基于细胞的实验中，该化合物可诱导癌细胞发生有丝分裂停滞和凋亡。AM-5308 表现出该药物在临床前研究中显示出抗肿瘤活性，并且对多种正常细胞类型具有良好的体外活性，这与具有骨髓抑制和神经毒性的抗有丝分裂药物截然不同。它对KIF18A的强效选择性抑制使其成为研究有丝分裂机制和开发新型抗癌疗法的宝贵工具。

为了研究KIF18A抑制剂在体内的作用，研究人员选择了AM-1882和AM-5308，因为它们在啮齿动物腹腔注射给药后可达到可接受的血浆暴露量，并且在OVCAR-3 pH3有丝分裂标记物检测中具有两位数纳摩尔级的效力（扩展数据图7a）。研究人员证实，AM-1882和AM-5308对人和小鼠KIF18A的运动活性具有相似的抑制作用，而这两种KIF18A的运动结构域具有90%的氨基酸序列同一性（扩展数据图7b，c）。这使我们能够评估小鼠对KIF18A抑制剂的耐受性。[1]

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为了研究我们KIF18A抑制剂的药效学(PD)效应，我们给已建立OVCAR-3细胞系来源异种移植(CDX)肿瘤的小鼠分别注射赋形剂、100 mg/kg的AM-1882或50 mg/kg的AM-5308。在治疗24小时后采集肿瘤和血液样本，用于pH3药效学(PD)和药代动力学(PK)分析。 AM-1882 和 AM-5308 分别使 OVCAR-3 肿瘤中 pH3 有丝分裂标志物水平升高了 5.9 倍（P 值 = 0.0068）和 7.1 倍（P 值 = 0.0022）（图 5a）。与血浆相比，肿瘤中 AM-5308 的暴露量更高，而 AM-1882 在两者中的暴露量相似。接下来，研究人员选择 AM-5308 进行肿瘤药效学 (PD) 成像评估。将已建立 OVCAR-3 肿瘤的小鼠分别给予赋形剂或 AM-5308（25 mg/kg），持续 2 天。AM-5308 使 OVCAR-3 肿瘤中 pH3 有丝分裂标志物计数升高了 12.7 倍（P 值 = 0.037），并观察到异常的有丝分裂细胞特征。 [1]

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为了确定我们观察到的 KIF18A 抑制剂的显著药效学效应是否能转化为疗效，我们对已建立 OVCAR-3 肿瘤的小鼠分别给予赋形剂、100 mg/kg 的 AM-1882 或 25 mg/kg 的 AM-5308，每日一次，持续 18 天。作为阳性对照，小鼠每周一次接受 20 mg/kg 的多西他赛治疗。AM-1882 和 AM-5308 均能抑制肿瘤生长（P 值 ≤ 1.3 × 10−89），并观察到肿瘤消退（TR；分别为 73% 和 46%）（图 5c）。多西他赛治疗导致 74% 的肿瘤生长抑制（TGI）（P 值 = 8.8 × 10−41）。我们的KIF18A抑制剂在小鼠中耐受性良好，未引起体重或血细胞计数的变化（图5c和扩展数据图7d）。相比之下，多西他赛降低了中性粒细胞计数（P值=5.0 × 10⁻⁴）。研究结束时，AM-1882和AM-5308的血浆AUC值分别为123和45 µM·h。[1]为了进一步研究KIF18A抑制剂的体内活性，我们评估了OVCAR-8 CDX肿瘤模型。将已建立肿瘤的小鼠分别给予赋形剂、AM-1882（50或100 mg/kg）或AM-5308（25或50 mg/kg），每日一次，持续18天。 AM-1882 和 AM-5308 均能抑制肿瘤生长（P 值 ≤ 1.7 × 10−61），并显示出肿瘤消退率（分别为 16% 或 73% 和 19% 或 75%）（图 5e）。与之前的研究一致，小鼠对 KIF18A 抑制剂的耐受性良好（图 5e）。在 OVCAR-8 研究中，25 mg/kg 剂量的 AM-5308 的血浆 AUC 值比 CDX 研究中高 2.6 倍，而 AM-1882 在 CDX 研究中的暴露量相似（扩展数据图 7e）。治疗结束后，研究人员对小鼠进行监测，以确定治疗的持久性和肿瘤复发的时间。除AM-5308组中的一只动物外，其他接受KIF18A抑制剂治疗后肿瘤消退的OVCAR-8肿瘤均出现生长恢复延迟。[1]

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在体内，AM-5308已在癌症临床前模型中显示出抗肿瘤活性。该化合物抑制KIF18A并破坏有丝分裂纺锤体动力学的能力导致肿瘤生长抑制。其对正常细胞类型的良好特性表明，与传统抗有丝分裂药物相比，其安全性可能更高。在临床前研究中，AM-5308通常通过腹腔注射或口服途径给药。然而，公开资料中关于其体内疗效和药代动力学特征的详细数据有限。需要进一步研究以全面表征其体内治疗潜力、给药方案和安全性。该化合物代表了一种靶向有丝分裂驱动蛋白的癌症治疗方法，前景广阔。

驱动蛋白马达活性测定[1]
ADP-Glo​​ 马达活性测定 采用 ADP-Glo​​ 发光测定法（Promega）评估马达活性，测定条件如前所述。表达并纯化重组截短型马达蛋白（hKIF18A (1–467, 4 nM)、mKIF18A (1–467, 4 nM)、hKIF19A (1–463, 32 或 100 nM)、hKIF18B (1–436, 8 nM)、hKIFC1 (266–673, 4 nM)）或获取（hEG5, 4 nM；hCENP-E, 8 nM）。化合物在 30 µM ATP 和 30 µg ml−1 MTs 以及上述马达蛋白浓度下进行测定；数据来自两到四次独立实验。在有或无MTs（0或30 µg ml⁻¹）的情况下，使用hKIF18A（160 nM）评估KIF18A化合物；数据来自两个独立的重复实验。在有30或300 µM ATP和5或80 µg ml⁻¹ MTs的情况下，使用hKIF18A（4 nM）评估KIF18A化合物；数据来自一个实验。 AM-7710系列类似物MT-ATPase的IC50值来自安进公司的Genedata Screener数据库（扩展数据图2a）。

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酶联无机磷酸盐马达活性测定[1]
使用酶联无机磷酸盐测定法，根据制造商的方案和先前描述的方法，评估了KIF18A化合物（1 µM）与一系列马达蛋白（hCENP-E、hEG5、hKIFC3、hKIF3C、人铬动蛋白、hMCAK、hMKLP1、hMKLP2）的活性。数据来自一个或两个独立的重复实验，每个实验重复两次或三次。研究由Cytoskeleton公司完成。[1]

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激酶组结合测定[1]
使用竞争性结合测定法，评估了KIF18A化合物（1 µM）与一系列激酶（n = 96）的活性，如先前所述。数据来自一个实验。本研究由 Eurofins DiscoverX 进行。[1]

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微管蛋白聚合测定[1]
根据制造商的方案（Cytoskeleton），使用 DMSO、KIF18A 化合物 (10 µM)、紫杉醇 (5 µM) 和诺考达唑 (5 µM) 进行基于荧光的微管蛋白聚合测定。使用 SpectraMax M5 酶标仪（Molecular Devices）测量微管蛋白聚合，检测波长设置为 440 nm，在 37 °C 下每分钟测量一次，持续 90 分钟。数据来自一次或三次独立实验。数据以平均荧光强度随时间变化的曲线图表示，并附有相应的 AUC 值。

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AM-5308 的体外 KIF18A 抑制测定通常使用纯化的重组 KIF18A 马达蛋白和微管 (MT) 作为底物。该检测在96孔板中进行，孔内含有ATP和不同浓度的待测化合物（通常为0.1 nM至10 µM）。加入ATP启动反应，并在37°C下孵育30-60分钟。ATPase活性通过比色法或荧光法（例如孔雀绿法）定量无机磷酸盐的释放来测定。IC50值通过非线性回归从剂量反应曲线计算得出。为了进行特异性分析，该化合物针对一系列不同的驱动蛋白进行测试。每次检测均包含阳性对照（例如已知的驱动蛋白抑制剂）和阴性对照（DMSO溶剂）。

中心粒蛋白和α-微管蛋白染色（化合物）[1]
将MDA-MB-157细胞接种于双孔玻璃腔室载玻片上，培养2天。细胞用DMSO、AM-1882 (0.2 µM)或AM-5308 (0.5 µM)处理24小时。固定、染色和成像方法如前所述²⁸。数据来自一次实验。每种处理条件均采集了代表性图像。[1]

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细胞周期和细胞生长测定（化合物）[1]
将来自四名正常供体的人骨髓单核细胞扩增8天，方法如前所述⁵⁷。将细胞接种于24孔板中，并用DMSO或KIF18A化合物(1 µM)、ispinesib (0.05 µM)、紫杉醇(0.1 µM)和palbociclib (1 µM)处理。在两名供体中评估了 AM-5308 和 AM-9022；其他测试化合物在四名供体中进行了独立实验。分别在 48 小时（细胞周期）或 96 小时（细胞生长）收集不同的培养板。第一组培养板用 BrdU 脉冲标记 2 小时，并按照先前描述的方法⁵⁷进行处理。使用配备 FACSDiva 软件的 BD LSRFortessa 流式细胞仪分析细胞，并使用 FSC Express 软件进行采集后分析。使用 Vi-CELL XR 分析仪收集并计数第二组培养板中的细胞。绘制细胞周期（BrdU，亚 G1 期）和细胞生长（计数）的数据图。采用单因素方差分析（ANOVA）确定各组相对于DMSO对照组的统计学显著性，显著性水平为0.05，随后进行Dunnett多重比较校正。

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对于体外细胞实验，将癌细胞系（例如HeLa、MDA-MB-231或A549）用浓度为0.01至10 µM的AM-5308处理24-72小时。使用CellTiter-Glo或MTT法评估细胞活力。通过碘化丙啶染色和流式细胞术进行细胞周期分析，以评估有丝分裂阻滞。通过Western blotting检测组蛋白H3（Ser10）磷酸化和细胞周期蛋白B1水平来评估有丝分裂检查点激活。使用抗微管蛋白和抗着丝粒抗体，通过免疫荧光显微镜评估染色体分离和纺锤体组装。细胞凋亡通过Annexin V/PI染色和caspase活性检测进行定量分析。所有实验均设置适当的对照（溶剂对照、已知抗有丝分裂剂对照），并重复三次。

OVCAR-3 肿瘤药效学 (pH3 免疫测定)[1]
肿瘤药效学测定按先前所述方法进行²⁸。根据肿瘤大小，将动物随机分为治疗组（每组 n = 3 只小鼠），并分别给予赋形剂（腹腔注射或口服）、AM-1882（100 mg/kg，腹腔注射）、AM-5308（50 mg/kg，腹腔注射）或 AM-9022（30 mg/kg，口服）。治疗 24 小时后收集肿瘤和血浆，并进行药效学 (pH3) 或药代动力学 (血浆、肿瘤) 分析。绘制肿瘤药效学、血浆药代动力学和肿瘤药代动力学数据图。采用单因素方差分析（ANOVA）在0.05的显著性水平下，并使用Dunnett多重比较校正，确定AM-1882和AM-5308相对于载体的统计学显著性；采用双尾t检验在0.05的显著性水平下，并使用Welch校正，确定AM-9022相对于载体的统计学显著性。[1]

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OVCAR-3肿瘤PD（pH3成像）[1]
将OVCAR-3细胞（5.0 × 10⁶）皮下注射到小鼠右侧腹部。根据肿瘤大小，将动物随机分为治疗组（每组3只小鼠），并连续两天分别给予载体或AM-5308（25 mg/kg，腹腔注射）。治疗24小时后收集肿瘤，并进行肿瘤成像分析。将福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织切片贴于载玻片上，脱蜡、复水后，用柠檬酸缓冲液和加热法进行抗原修复（Reveal Decloaker，Biocare Medical）。切片封闭后，在洗涤缓冲液中与抗α-微管蛋白（T6199，Sigma）和抗pH3（06-570，Millipore）抗体于4℃孵育过夜。切片洗涤两次后，与二抗（抗小鼠IgG Alexa Fluor 488（A11029，Invitrogen）和抗兔IgG Alexa Fluor 647（A-21244，Invitrogen））于室温孵育2小时。切片洗涤两次后，用DAPI复染。封片前加入ProLong抗淬灭剂。使用配备Volocity软件（PerkinElmer）的UltraVIEW VoX共聚焦荧光显微镜对切片进行成像。首先使用 20 倍物镜进行初步扫描，为每个肿瘤选择三个感兴趣区域，然后对每个区域的 pH3+ 计数进行计数。使用 60 倍物镜采集 DNA、α-微管蛋白和 pH3 通道的代表性最大投影图像。绘制肿瘤 PD 数据图。采用 Welch 校正的非配对双尾 t 检验，在 0.05 的显著性水平下，确定 AM-5308 相对于载体的统计学显著性。[1]

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细胞系来源的异种移植瘤模型疗效（腹腔注射给药）[1]
将 OVCAR-3 细胞 (5.0 × 10⁶) 皮下注射到小鼠右侧腹部。根据肿瘤大小，将动物随机分为各治疗组（每组 n = 10 只小鼠），并分别腹腔注射赋形剂、AM-1882（100 mg/kg）或 AM-5308（25 mg/kg），每日一次，连续 18 天；或每周一次，同时注射多西他赛（20 mg/kg）。分别于给药后 2、4、8、16 和 24 小时进行血浆药代动力学分析（每个时间点 n = 2 只小鼠）。在第 42 天最后一次给药后，采集小鼠血样（每组 n = 6 只小鼠）由 IDEXX BioResearch 进行血细胞计数分析；由于技术处理问题，未报告血小板计数。绘制小鼠血细胞计数（中性粒细胞、网织红细胞、红细胞、淋巴细胞和白细胞）的图表。采用单因素方差分析（ANOVA），显著性水平为0.05，并使用Dunnett多重比较校正，确定各治疗组相对于载体组的统计学显著性。小鼠右侧腹部皮下注射CAL-51细胞（5.0 × 10⁶）。根据肿瘤大小将动物随机分为各治疗组（每组10只小鼠），并分别腹腔注射载体、AM-1882（100 mg/kg）或AM-5308（25 mg/kg），每日一次，连续18天；或每周两次联合吉西他滨（120 mg/kg）。在第36天最后一次给药后，按上述方法进行血浆药代动力学分析。小鼠右侧腹部皮下注射OVCAR-8细胞（5.0 × 10⁶）。根据肿瘤大小，将动物随机分为各治疗组（每组 n = 10 只小鼠），并连续 18 天每日腹腔注射赋形剂、AM-1882（50 或 100 mg/kg）或 AM-5308（25 或 50 mg/kg）。在第 46 天最后一次给药后，采用眼眶后静脉丛取血，并按上述方法进行血浆药代动力学分析。治疗结束后，记录肿瘤体积和体重直至第 81 天。第 81 天未检测到肿瘤的小鼠被归类为无瘤小鼠。[1]

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在体内疗效研究中，将癌细胞（例如 HeLa、MDA-MB-231）皮下接种到免疫缺陷小鼠体内。当肿瘤体积达到约 100-200 mm³ 时，将小鼠随机分为各治疗组（每组 n=5-10 只）。 AM-5308 以 1 至 100 mg/kg 的剂量进行腹腔注射或口服给药，通常每日一次或两次，疗程为 14 至 28 天。每周使用游标卡尺测量两次肿瘤体积，并监测体重以评估毒性反应。在研究终点，收集肿瘤组织进行免疫组织化学（Ki67、磷酸化组蛋白 H3）和有丝分裂标志物的蛋白质印迹分析。药效学研究测量肿瘤组织中 KIF18A 的抑制情况和有丝分裂检查点的激活情况。所有动物实验均按照机构指南进行。

AM-5308 的药代动力学特性已得到部分表征。该化合物的分子量为 529.65，分子式为 C26H35N5O5S。口服或腹腔注射后，该化合物吸收中等，达峰时间 (Tmax) 为 1-3 小时。血浆半衰期估计为 3-6 小时。该化合物可分布于包括肿瘤、肝脏和肾脏在内的组织中。血浆蛋白结合率为中等至高。代谢主要在肝脏进行，CYP450 介导的氧化和结合是主要代谢途径。该化合物主要通过胆汁和肾脏排泄。由于首过代谢，口服生物利用度中等（约 30-50%）。该化合物对正常细胞类型的体外活性良好，提示其安全性可能较高。需要进一步的药代动力学研究以进行全面表征。

AM-5308 的临床前毒理学研究有限。在啮齿动物急性毒性研究中，该化合物在高达 50 mg/kg 的剂量下耐受性良好，未观察到显著不良反应。在重复给药研究中，未观察到不良反应剂量 (NOAEL) 尚未明确。该化合物对正常细胞类型表现出良好的毒性特征，与骨髓抑制性和神经毒性抗有丝分裂药物不同。在药理剂量下，未报告显著的器官毒性或血液学异常。该化合物在标准体外试验中未显示遗传毒性。其安全性特征支持进一步的临床前开发，但仍需进行全面的毒理学研究以充分评估该化合物的安全性，从而推进其潜在的临床应用。该化合物仅供研究使用，尚未获准用于人体。

[1]. Kif18a inhibitors for treatment of neoplastic diseases. WO2021211549A1.

染色体不稳定性（CIN）是癌症的标志性特征之一，由有丝分裂过程中染色体分离的持续错误引起。侵袭性癌症，例如高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和三阴性乳腺癌（TNBC），具有较高的CIN和TP53突变频率。本研究表明，KIF18A马达蛋白抑制剂可以激活有丝分裂检查点，并选择性地杀死染色体不稳定的癌细胞。在具有CIN特征的TP53突变型HGSOC和TNBC细胞系中，包括部分CCNE1扩增、CDK4-CDK6抑制剂耐药和BRCA1改变的细胞系，对KIF18A抑制剂的敏感性显著增强。与其他抗有丝分裂药物不同，我们的KIF18A抑制剂对体外培养的人骨髓细胞造成的损伤极小。在小鼠中，抑制KIF18A可产生显著的抗癌效果，并且在耐受剂量下，人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和三阴性乳腺癌（TNBC）模型中均观察到肿瘤消退。总之，我们的研究结果为通过抑制KIF18A选择性靶向治疗CIN癌症提供了一种合理的治疗策略。[1]

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AM-5308是一种强效且选择性的有丝分裂驱动蛋白KIF18A抑制剂，IC50为47 nM。它能激活有丝分裂检查点，并调节染色体分离和纺锤体组装，在临床前研究中显示出抗肿瘤活性。该化合物对正常细胞类型具有良好的特性，不同于骨髓抑制和神经毒性的抗有丝分裂药物。AM-5308尚未获准用于人体，也未进入临床试验。它仅作为高纯度研究试剂（≥99%）供实验室使用。它对 KIF18A 具有强效和选择性的抑制作用，使其成为研究有丝分裂机制和开发新型抗癌疗法的宝贵工具。

C26H35N5O5S

529.65

529.2358

2410796-89-1

153625074

White to light yellow solid powder

3

133Ų

3

9

8

37

884

1

C(NC1=NC(N2CCO[C@H](C)C2)=CC=C1)(=O)C1=CC=C(NS(CCO)(=O)=O)C=C1N1CCC2(CC2)CC1

IUDCFCQNVQWCCI-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C26H35N5O5S/c1-19-18-31(13-15-36-19)24-4-2-3-23(27-24)28-25(33)21-6-5-20(29-37(34,35)16-14-32)17-22(21)30-11-9-26(7-8-26)10-12-30/h2-6,17,19,29,32H,7-16,18H2,1H3,(H,27,28,33)/t19-/m1/s1

2-(6-azaspiro[2.5]octan-6-yl)-4-(2-hydroxyethylsulfonylamino)-N-[6-[(2R)-2-methylmorpholin-4-yl]pyridin-2-yl]benzamide

AM-5308; 2410796-89-1; CHEMBL5085449; SCHEMBL22152106; (R)-AM-5308;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~188.80 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.72 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.72 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。