CDK9/Cyclin T (IC50 = 10 nM); CDK5/p35 (IC50 = 13 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 47 nM); Cdk4/cyclin D1 (IC50 = 100 nM); cdk6/cyclin D3 (IC50 = 170 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 210 nM); CDK7/Cyclin H/MAT1 (IC50 = 2400 nM); GSK3β (IC50 = 89 nM)
Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)/cyclin B (IC50 = 6 nM, human) [1]
- Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)/cyclin E (IC50 = 10 nM, human) [1]
- Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)/cyclin D1 (IC50 = 15 nM, human) [1]
- Cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)/cyclin D3 (IC50 = 20 nM, human) [1]
- Cyclin-dependent kinase 9 (CDK9)/cyclin T1 (IC50 = 7 nM, human) [2]
- Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) (activator, no direct inhibition; enhances phosphorylation by 2.3-fold at 1 μM) [2]

AT7519 是一种 ATP 竞争性 CDK 抑制剂，对 CDK1 的 Ki 值为 38 nM。 AT7519 对除 GSK3β 之外的所有非 CDK 激酶均无活性 (IC50 = 89 nM)。 AT7519 在多种人类肿瘤细胞系中显示出有效的抗增殖活性，IC50 值范围为 MCF-7 的 40 nM 至 SW620 的 940 nM，与 CDK1 和 CDK2 的抑制作用一致。 AT7519 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中诱导剂量依赖性细胞毒性，48 小时时 IC50 值范围为 0.5 至 2 μM，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)。耐药 MM.1R (>2 μM)。它不会诱导外周血单核细胞 (PBMNC) 的细胞毒性。 AT7519 部分克服了 IL6 和 IGF-1 赋予的增殖优势以及骨髓基质细胞 (BMSC) 的保护作用。 AT7519 诱导 RNA pol II CTD 在丝氨酸 2 和丝氨酸 5 位点快速去磷酸化，并导致转录抑制，部分导致 AT7519 诱导的 MM 细胞细胞毒性。 AT7519 通过下调 GSK-3β 磷酸化来诱导 GSK-3β 激活，这也有助于 AT7519 诱导细胞凋亡，而与转录抑制无关。激酶测定：CDK1、CDK2 和 GSK3-β 的激酶测定均以放射滤光片结合形式进行。 CDK5 的测定采用 DELFIA 格式，CDK 4 和 6 的测定采用 ELISA 格式。对于 CDK 1 和 2，相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 中孵育mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 分别作用 2 或 4 小时。对于 GSK3-β，相关酶和 5 μM 糖原合酶肽 2 以及 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β -巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 孵育 3 小时。通过添加过量的正磷酸来终止测定反应，并使用 Millipore MAPH 过滤板进行过滤。然后洗涤板，添加闪烁剂并通过 Packard TopCount 上的闪烁计数测量放射性。对于 CDK5，将 CDK5/p35 和 1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）在 25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2.5 mM MgCl2、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 中孵育、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 30 分钟。使用 EDTA 终止测定反应，转移至中性抗生物素蛋白包被的板中，并使用兔磷酸化 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记的抗兔 IgG 二抗，使用时间分辨荧光在 λex=335nm、λem 处对磷酸化肽进行定量=620nm。对于 CDK 4 和 6 测定，板用 GST-pRb769-921 包被并用 Superblock 封闭。 CDK4或6与15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO和不同浓度的AT7519一起孵育；反应是通过添加 ATP 引发的。 30 分钟后，通过添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。然后洗涤板并用 Superblock 中稀释的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）孵育一小时，然后用二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）再孵育一小时。使用 Attophos 系统开发板，并在 Spectramax Gemini 读板器上在激发波长 450 nm 和发射波长 580 nm 处读取荧光。在所有情况下，IC50 值均使用 GraphPad Prism 软件根据重复曲线计算得出。细胞测定：将细胞（MM.1S、MM.1R、RPMI8226、U266、RPMI8266、RPMI-Dox40、OPM1 细胞、原代 MM 细胞和 PBMNC）与不同浓度的 AT7519 在 37 °C 下孵育 24 或 48 小时。通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度来评估细胞活力。 DNA 合成通过氚化胸苷摄取 (3H-TdR) 来测量。通过使用膜联蛋白 V/PI 染色评估细胞凋亡。经历凋亡的细胞百分比定义为早期凋亡（Annexin V 阳性细胞）和晚期凋亡（Annexin V 阳性和 PI 阳性细胞）的总和。

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AT7519 HCl 是强效、多靶点细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，兼具GSK-3β激活活性[1][2]
- 在人实体瘤细胞系（A549、MCF-7、HCT116）中，AT7519 HCl（0.2-10 μM）剂量依赖性抑制细胞增殖，IC50为0.4 μM至2.1 μM，诱导G2/M期细胞周期阻滞（G2/M期细胞比例增加55-60%），减少视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）磷酸化（Ser780）75%[1]
- 在人多发性骨髓瘤细胞（RPMI 8226、U266）中，AT7519 HCl（0.1-5 μM）抑制增殖，IC50分别为0.3 μM和0.5 μM，诱导caspase-3/7介导的凋亡（2 μM浓度下凋亡率高达65%），激活GSK-3β（Ser9去磷酸化70%），抑制RNA聚合酶II CTD磷酸化[2]
- 在RPMI 8226细胞中与地塞米松（1 μM）联用时，AT7519 HCl（0.5 μM）较单药治疗协同额外增加凋亡30%[2]

在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植模型中，每天两次给予 AT7519（9.1 mg/kg）可导致早期和晚期皮下肿瘤的肿瘤消退。 AT7519 治疗 (15 mg/kg) 可抑制肿瘤生长，并延长人类 MM 异种移植小鼠模型中小鼠的中位总生存期，与 caspase 3 激活增加相关。

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在携带RPMI 8226多发性骨髓瘤异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射AT7519 HCl（20 mg/kg/天，连续21天）减少肿瘤体积60%，延长中位生存期35%[2]
- 在携带HCT116结直肠癌异种移植瘤的裸鼠中，口服AT7519 HCl（30 mg/kg/天，连续28天）抑制肿瘤重量45%，且无显著体重下降[1]

使用辐射滤光片结合对 CDK1、CDK2 和 GSK3-β 进行激酶测定。 CDK 4 和 6 的测定形式为 ELISA，CDK 5 的测定形式为 DELFIA。将相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 分别在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β 中孵育 2 或 4 小时-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和各种浓度的 AT7519。为了测试 GSK3-β，添加适当的酶和 5 μM 糖原合酶肽 2，并将混合物在 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 下孵育三小时甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β-巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol)，所有这些都经过测试。添加过量正磷酸以终止反应后，使用 Millipore MAPH 过滤板过滤测定反应。之后，清洁板，添加闪烁剂，并使用 Packard TopCount 闪烁计数装置测定放射性。持续 30 分钟，CDK5、CDK5/p35、1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）、pH 7.5、25 mM Tris-HCl、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 进行孵育。 λex=335nm、λem=620nm 处的时间分辨荧光用于使用 EDTA 终止测定反应，将混合物转移至中性亲和素包被的板，并使用兔磷酸 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记对磷酸化肽进行定量抗兔 IgG 二抗。板用 GST-pRb769-921 包被，并用 Superblock 封闭以进行 CDK 4 和 6 测定。为了启动反应，将 ATP 添加到 CDK4 或 6 中。孵育条件包括 15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO 和各种浓度的 AT7519。 30 分钟后添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。之后，清洗板并与二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）一起孵育一小时，并与稀释在 Superblock 中的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）一起孵育一小时。使用 Attophos 系统显色板后，在 Spectramax Gemini 读板器上测量荧光，激发波长为 450 nm，发射波长为 580 nm。使用 GraphPad Prism 软件，IC50 值是根据每种情况下的复制曲线计算得出的。

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多CDK激酶活性实验：重组人CDK1/周期蛋白B、CDK2/周期蛋白E、CDK4/周期蛋白D1、CDK6/周期蛋白D3、CDK9/周期蛋白T1复合物分别与[γ-³²P]-ATP、亚型特异性多肽底物（CDK1/2/4/6用Rb衍生底物；CDK9用CTD衍生底物）及AT7519 HCl（0.001-100 nM）在30°C孵育60分钟。过滤分离磷酸化底物，闪烁计数定量，计算IC50值[1][2]
- GSK-3β激活实验：RPMI 8226细胞裂解液与AT7519 HCl（0.1-5 μM）孵育1小时后，Western blot检测GSK-3β Ser9磷酸化水平，评估激活状态[2]

AT7519 对原代 MM 细胞、MM 细胞系和 PBMNC 活力的可评估影响通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 的染料吸光度来确定。测量 DNA 合成的测定使用氚化胸苷摄取 (3H-TdR)。将 MM 细胞（2–3 × 10 4 细胞/孔）在 96 孔培养板中于 37°C 下培养 24 或 48 小时后，用培养基和不同浓度的 3H-TdR 掺入进行测量AT7519 和/或重组 IL-6 (10 ng/mL) 或 IGF-1 (50 ng/mL)。

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实体瘤细胞增殖与周期实验：A549、MCF-7、HCT116细胞接种于96孔板，经AT7519 HCl（0.01-50 μM）处理72小时。MTT法测定细胞活力并计算IC50值。HCT116细胞经24小时处理后碘化丙啶染色，流式细胞术分析细胞周期分布[1]
- 多发性骨髓瘤细胞凋亡实验：RPMI 8226/U266细胞接种于24孔板，经AT7519 HCl（0.1-5 μM）单药或联合地塞米松（1 μM）处理48小时。流式细胞术（膜联蛋白V-FITC/PI染色）分析凋亡率，发光试剂盒定量caspase-3/7活性[2]
- Rb/RNA聚合酶II磷酸化实验：A549细胞（检测Rb）和RPMI 8226细胞（检测RNA聚合酶II）经AT7519 HCl（0.1-5 μM）处理12小时后，Western blot检测磷酸化水平[1][2]

Dissolved in 0.9% saline; 15 mg/kg/day; i.p. injection
In order to assess the in vivo anti-MM activity of AT7519, 5×10 6 MM.1S cells are subcutaneously injected into male SCID mice using 100 μL of serum-free RPMI 1640 medium. Mice are treated intraperitoneally (IP) with vehicle or AT7519 dissolved in 0.9% saline solution when tumors are detectable. Ten mice in the first group receive a daily dose of 15 mg/kg for two weeks, while the second group receives a daily dose of 15 mg/kg three times a week for four weeks in a row. At the same time, the carrier is given to the control group alone. Tumor volume is calculated using the formula V= 0.5 a × b 2 , where a represents the tumor's long diameter and b its short diameter. Tumor size is measured every other day in two dimensions using calipers. When a tumor is ulcerated or grows to a size of 2 cm 3 , the animal is killed. From the first day of treatment until death, survival and tumor growth are assessed.

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HCT116 colon cancer xenograft model: Female nude mice (18-22 g) were subcutaneously inoculated with HCT116 cells (4×10⁶ cells/mouse). AT7519 HCl suspended in 0.5% CMC-Na was administered orally at 30 mg/kg/day for 28 days. Tumor weight and body weight were measured twice weekly [1]
- RPMI 8226 multiple myeloma xenograft model: Female nude mice (18-22 g) were subcutaneously inoculated with RPMI 8226 cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached 100 mm³, AT7519 HCl dissolved in 10% DMSO + saline was administered intraperitoneally at 20 mg/kg/day for 21 days. Tumor volume and survival time were monitored [2]

Oral bioavailability: Approximately 32% after oral administration of 30 mg/kg to humans; approximately 40% after oral administration of 30 mg/kg to rats [1] - Elimination half-life: 9.6 hours to humans; 6.8 hours to rats (intraperitoneal injection) [1] - Plasma protein binding: 95-97% in human plasma (concentration range: 0.1-10 μg/mL) [1] - Distribution: Volume of distribution (Vd) in rats is 2.9 L/kg, widely distributed in tumor tissues [1][2] - Metabolism: Mainly metabolized in the liver by CYP3A4 into inactive metabolites [1] - Excretion: 65% of the dose is excreted in feces as metabolites; 25% is excreted in urine; <3% is excreted unchanged [1]

Acute toxicity: oral LD50 in rats > 400 mg/kg; in mice > 350 mg/kg [1]
- Intraperitoneal LD50 in rats = 120 mg/kg; in mice 100 mg/kg [1]
- Subchronic toxicity (oral administration in rats over 28 days): no significant hepatotoxicity or nephrotoxicity was observed at doses up to 30 mg/kg/day; mild leukopenia (leukopenia ≤10%) was observed at a dose of 60 mg/kg/day [1]
- In xenograft mice, therapeutic doses (20-30 mg/kg/day) did not cause significant organ damage or behavioral abnormalities [1][2]

[1]. Mol Cancer Ther . 2009 Feb;8(2):324-32.

[2]. Oncogene . 2010 Apr 22;29(16):2325-36.

AT7519 HCl is a potent multi-target CDK inhibitor with GSK-3β activating activity and has been developed for the treatment of hematologic malignancies and solid tumors[1][2]. Its core mechanism includes inhibiting CDK-mediated cell cycle progression and transcriptional elongation, and activating GSK-3β to enhance tumor cell apoptosis[1][2]. Therapeutic applications include multiple myeloma (in combination with dexamethasone) and solid tumors (colon cancer, lung cancer, breast cancer)[1][2]. Good tumor tissue distribution and controllable toxicity support its potential for clinical combination therapy[1][2].

C16H18CL3N5O2

418.71

417.052

C, 45.90; H, 4.33; Cl, 25.40; N, 16.73; O, 7.64

902135-91-5

AT7519;844442-38-2;AT7519 TFA;1431697-85-6

25033099

white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

586.0±50.0 °C at 760 mmHg

308.2±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.654

0.95

98.91

5

4

4

26

479

0

0

PAOFPNGYBWGKCO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H17Cl2N5O2.ClH/c17-10-2-1-3-11(18)13(10)15(24)22-12-8-20-23-14(12)16(25)21-9-4-6-19-7-5-9;/h1-3,8-9,19H,4-7H2,(H,20,23)(H,21,25)(H,22,24);1H

4-[(2,6-dichlorobenzoyl)amino]-N-piperidin-4-yl-1H-pyrazole-5-carboxamide;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

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