CDK9/Cyclin T (IC50 = 10 nM); CDK5/p35 (IC50 = 13 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 47 nM); Cdk4/cyclin D1 (IC50 = 100 nM); cdk6/cyclin D3 (IC50 = 170 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 210 nM); CDK7/Cyclin H/MAT1 (IC50 = 2400 nM); GSK3β (IC50 = 89 nM)

体外活性：AT7519 是一种 ATP 竞争性 CDK 抑制剂，对 CDK1 的 Ki 值为 38 nM。 AT7519 对除 GSK3β 之外的所有非 CDK 激酶均无活性 (IC50 = 89 nM)。 AT7519 在多种人类肿瘤细胞系中显示出有效的抗增殖活性，IC50 值范围为 MCF-7 的 40 nM 至 SW620 的 940 nM，与 CDK1 和 CDK2 的抑制作用一致。 AT7519 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中诱导剂量依赖性细胞毒性，48 小时时 IC50 值范围为 0.5 至 2 μM，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)。耐药 MM.1R (>2 μM)。它不会诱导外周血单核细胞 (PBMNC) 的细胞毒性。 AT7519 部分克服了 IL6 和 IGF-1 赋予的增殖优势以及骨髓基质细胞 (BMSC) 的保护作用。 AT7519 诱导 RNA pol II CTD 在丝氨酸 2 和丝氨酸 5 位点快速去磷酸化，并导致转录抑制，部分导致 AT7519 诱导的 MM 细胞细胞毒性。 AT7519 通过下调 GSK-3β 磷酸化来诱导 GSK-3β 激活，这也有助于 AT7519 诱导细胞凋亡，而与转录抑制无关。激酶测定：CDK1、CDK2 和 GSK3-β 的激酶测定均以放射滤光片结合形式进行。 CDK5 的测定采用 DELFIA 格式，CDK 4 和 6 的测定采用 ELISA 格式。对于 CDK 1 和 2，相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 中孵育mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 分别作用 2 或 4 小时。对于 GSK3-β，相关酶和 5 μM 糖原合酶肽 2 以及 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β -巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 孵育 3 小时。通过添加过量的正磷酸来终止测定反应，并使用 Millipore MAPH 过滤板进行过滤。然后洗涤板，添加闪烁剂并通过 Packard TopCount 上的闪烁计数测量放射性。对于 CDK5，将 CDK5/p35 和 1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）在 25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2.5 mM MgCl2、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 中孵育、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 30 分钟。使用 EDTA 终止测定反应，转移至中性抗生物素蛋白包被的板中，并使用兔磷酸化 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记的抗兔 IgG 二抗，使用时间分辨荧光在 λex=335nm、λem 处对磷酸化肽进行定量=620nm。对于 CDK 4 和 6 测定，板用 GST-pRb769-921 包被并用 Superblock 封闭。 CDK4或6与15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO和不同浓度的AT7519一起孵育；反应是通过添加 ATP 引发的。 30 分钟后，通过添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。然后洗涤板并用 Superblock 中稀释的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）孵育一小时，然后用二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）再孵育一小时。使用 Attophos 系统开发板，并在 Spectramax Gemini 读板器上在激发波长 450 nm 和发射波长 580 nm 处读取荧光。在所有情况下，IC50 值均使用 GraphPad Prism 软件根据重复曲线计算得出。细胞测定：将细胞（MM.1S、MM.1R、RPMI8226、U266、RPMI8266、RPMI-Dox40、OPM1 细胞、原代 MM 细胞和 PBMNC）与不同浓度的 AT7519 在 37 °C 下孵育 24 或 48 小时。通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度来评估细胞活力。 DNA 合成通过氚化胸苷摄取 (3H-TdR) 来测量。通过使用膜联蛋白 V/PI 染色评估细胞凋亡。经历凋亡的细胞百分比定义为早期凋亡（Annexin V 阳性细胞）和晚期凋亡（Annexin V 阳性和 PI 阳性细胞）的总和。

在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植模型中，每天两次给予 AT7519（9.1 mg/kg）可导致早期和晚期皮下肿瘤的肿瘤消退。 AT7519 治疗 (15 mg/kg) 可抑制肿瘤生长，并延长人类 MM 异种移植小鼠模型中小鼠的中位总生存期，与 caspase 3 激活增加相关。

使用辐射滤光片结合对 CDK1、CDK2 和 GSK3-β 进行激酶测定。 CDK 4 和 6 的测定形式为 ELISA，CDK 5 的测定形式为 DELFIA。将相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 分别在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β 中孵育 2 或 4 小时-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和各种浓度的 AT7519。为了测试 GSK3-β，添加适当的酶和 5 μM 糖原合酶肽 2，并将混合物在 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 下孵育三小时甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β-巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol)，所有这些都经过测试。添加过量正磷酸以终止反应后，使用 Millipore MAPH 过滤板过滤测定反应。之后，清洁板，添加闪烁剂，并使用 Packard TopCount 闪烁计数装置测定放射性。持续 30 分钟，CDK5、CDK5/p35、1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）、pH 7.5、25 mM Tris-HCl、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 进行孵育。 λex=335nm、λem=620nm 处的时间分辨荧光用于使用 EDTA 终止测定反应，将混合物转移至中性亲和素包被的板，并使用兔磷酸 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记对磷酸化肽进行定量抗兔 IgG 二抗。板用 GST-pRb769-921 包被，并用 Superblock 封闭以进行 CDK 4 和 6 测定。为了启动反应，将 ATP 添加到 CDK4 或 6 中。孵育条件包括 15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO 和各种浓度的 AT7519。 30 分钟后添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。之后，清洗板并与二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）一起孵育一小时，并与稀释在 Superblock 中的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）一起孵育一小时。使用 Attophos 系统显色板后，在 Spectramax Gemini 读板器上测量荧光，激发波长为 450 nm，发射波长为 580 nm。使用 GraphPad Prism 软件，IC50 值是根据每种情况下的复制曲线计算得出的。

AT7519 对原代 MM 细胞、MM 细胞系和 PBMNC 活力的可评估影响通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 的染料吸光度来确定。测量 DNA 合成的测定使用氚化胸苷摄取 (3H-TdR)。将 MM 细胞（2–3 × 10⁴ 细胞/孔）在 96 孔培养板中于 37°C 下培养 24 或 48 小时后，用培养基和不同浓度的 3H-TdR 掺入进行测量AT7519 和/或重组 IL-6 (10 ng/mL) 或 IGF-1 (50 ng/mL)。

[1]. Mol Cancer Ther . 2009 Feb;8(2):324-32.

[2]. Oncogene . 2010 Apr 22;29(16):2325-36.

C16H18CL3N5O2

418.71

417.052608

C, 45.90; H, 4.33; Cl, 25.40; N, 16.73; O, 7.64

902135-91-5

AT7519;844442-38-2;AT7519 TFA;1431697-85-6

white solid powder

C1CNCCC1NC(=O)C2=C(C=NN2)NC(=O)C3=C(C=CC=C3Cl)Cl.Cl

PAOFPNGYBWGKCO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H17Cl2N5O2.ClH/c17-10-2-1-3-11(18)13(10)15(24)22-12-8-20-23-14(12)16(25)21-9-4-6-19-7-5-9;/h1-3,8-9,19H,4-7H2,(H,20,23)(H,21,25)(H,22,24);1H

4-[(2,6-dichlorobenzoyl)amino]-N-piperidin-4-yl-1H-pyrazole-5-carboxamide;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

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                  -20°C    1 month

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