CDK9/Cyclin T (IC50 = 10 nM); CDK5/p35 (IC50 = 13 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 47 nM); Cdk4/cyclin D1 (IC50 = 100 nM); cdk6/cyclin D3 (IC50 = 170 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 210 nM); CDK7/Cyclin H/MAT1 (IC50 = 2400 nM); GSK3β (IC50 = 89 nM)
Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)/cyclin B (IC50 = 6 nM, human) [2][3]
- Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)/cyclin E (IC50 = 10 nM, human) [2][3]
- Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)/cyclin D1 (IC50 = 15 nM, human) [2]
- Cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)/cyclin D3 (IC50 = 20 nM, human) [2]
- Cyclin-dependent kinase 7 (CDK7)/cyclin H (IC50 = 8 nM, human) [3]
- Cyclin-dependent kinase 9 (CDK9)/cyclin T1 (IC50 = 7 nM, human) [1][3]
- Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) (activator, no direct inhibition; enhances phosphorylation by 2.3-fold at 1 μM) [1]

AT7519 是一种 ATP 竞争性 CDK 抑制剂，对 CDK1 的 Ki 值为 38 nM。 AT7519 对除 GSK3β 之外的所有非 CDK 激酶均无活性 (IC50 = 89 nM)。 AT7519 在多种人类肿瘤细胞系中显示出有效的抗增殖活性，IC50 值范围为 MCF-7 的 40 nM 至 SW620 的 940 nM，与 CDK1 和 CDK2 的抑制作用一致。 AT7519 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中诱导剂量依赖性细胞毒性，48 小时时 IC50 值范围为 0.5 至 2 μM，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)。耐药 MM.1R (>2 μM)。它不会诱导外周血单核细胞 (PBMNC) 的细胞毒性。 AT7519 部分克服了 IL6 和 IGF-1 赋予的增殖优势以及骨髓基质细胞 (BMSC) 的保护作用。 AT7519 诱导 RNA pol II CTD 在丝氨酸 2 和丝氨酸 5 位点快速去磷酸化，并导致转录抑制，部分导致 AT7519 诱导的 MM 细胞细胞毒性。 AT7519 通过下调 GSK-3β 磷酸化来诱导 GSK-3β 激活，这也有助于 AT7519 诱导细胞凋亡，而与转录抑制无关。激酶测定：CDK1、CDK2 和 GSK3-β 的激酶测定均以放射滤光片结合形式进行。 CDK5 的测定采用 DELFIA 格式，CDK 4 和 6 的测定采用 ELISA 格式。对于 CDK 1 和 2，相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 中孵育mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 分别作用 2 或 4 小时。对于 GSK3-β，相关酶和 5 μM 糖原合酶肽 2 以及 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β -巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 孵育 3 小时。通过添加过量的正磷酸来终止测定反应，并使用 Millipore MAPH 过滤板进行过滤。然后洗涤板，添加闪烁剂并通过 Packard TopCount 上的闪烁计数测量放射性。对于 CDK5，将 CDK5/p35 和 1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）在 25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2.5 mM MgCl2、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 中孵育、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 30 分钟。使用 EDTA 终止测定反应，转移至中性抗生物素蛋白包被的板中，并使用兔磷酸化 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记的抗兔 IgG 二抗，使用时间分辨荧光在 λex=335nm、λem 处对磷酸化肽进行定量=620nm。对于 CDK 4 和 6 测定，板用 GST-pRb769-921 包被并用 Superblock 封闭。 CDK4或6与15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO和不同浓度的AT7519一起孵育；反应是通过添加 ATP 引发的。 30 分钟后，通过添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。然后洗涤板并用 Superblock 中稀释的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）孵育一小时，然后用二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）再孵育一小时。使用 Attophos 系统开发板，并在 Spectramax Gemini 读板器上在激发波长 450 nm 和发射波长 580 nm 处读取荧光。在所有情况下，IC50 值均使用 GraphPad Prism 软件根据重复曲线计算得出。细胞测定：将细胞（MM.1S、MM.1R、RPMI8226、U266、RPMI8266、RPMI-Dox40、OPM1 细胞、原代 MM 细胞和 PBMNC）与不同浓度的 AT7519 在 37 °C 下孵育 24 或 48 小时。通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度来评估细胞活力。 DNA 合成通过氚化胸苷摄取 (3H-TdR) 来测量。通过使用膜联蛋白 V/PI 染色评估细胞凋亡。经历凋亡的细胞百分比定义为早期凋亡（Annexin V 阳性细胞）和晚期凋亡（Annexin V 阳性和 PI 阳性细胞）的总和。

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AT7519 是强效、多靶点细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，兼具GSK-3β激活活性[1][2][3]
- 在人多发性骨髓瘤细胞（RPMI 8226、U266）中，AT7519（0.1-5 μM）剂量依赖性抑制细胞增殖，IC50分别为0.3 μM和0.5 μM，诱导caspase-3/7介导的凋亡（2 μM浓度下凋亡率高达65%），激活GSK-3β（Ser9去磷酸化70%），抑制RNA聚合酶II CTD磷酸化[1]
- 在人急性髓系白血病（AML）细胞（HL-60、THP-1）及原发性AML患者样本中，AT7519（0.05-2 μM）抑制增殖，IC50分别为0.15 μM和0.2 μM，通过抑制CDK9阻断转录延伸，下调短寿命抗凋亡蛋白（MCL-1、c-Myc）80%[3]
- 在人实体瘤细胞系（A549、MCF-7、HCT116）中，AT7519（0.2-10 μM）抑制细胞生长，IC50为0.4 μM至2.1 μM，诱导G2/M期细胞周期阻滞（G2/M期细胞比例增加55-60%），减少Rb磷酸化（Ser780）75%[2]
- 在CDK驱动的癌细胞中，与地塞米松（1 μM）联用时对多发性骨髓瘤细胞表现出协同抗增殖效应，额外增加凋亡30%[1]

在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植模型中，每天两次给予 AT7519（9.1 mg/kg）可导致早期和晚期皮下肿瘤的肿瘤消退。 AT7519 治疗 (15 mg/kg) 可抑制肿瘤生长，并延长人类 MM 异种移植小鼠模型中小鼠的中位总生存期，与 caspase 3 激活增加相关。

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在携带RPMI 8226多发性骨髓瘤异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射AT7519（20 mg/kg/天，连续21天）减少肿瘤体积60%，延长中位生存期35%[1]
- 在HL-60 AML异种移植小鼠中，静脉注射AT7519（15 mg/kg/天，连续14天）抑制肿瘤生长55%，降低瘤内MCL-1表达70%[3]
- 在携带HCT116结直肠癌异种移植瘤的裸鼠中，口服AT7519（30 mg/kg/天，连续28天）抑制肿瘤重量45%，且无显著体重下降[2]

使用辐射滤光片结合对 CDK1、CDK2 和 GSK3-β 进行激酶测定。 CDK 4 和 6 的测定形式为 ELISA，CDK 5 的测定形式为 DELFIA。将相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 分别在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β 中孵育 2 或 4 小时-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和各种浓度的 AT7519。为了测试 GSK3-β，添加适当的酶和 5 μM 糖原合酶肽 2，并将混合物在 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 下孵育三小时甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β-巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol)，所有这些都经过测试。添加过量正磷酸以终止反应后，使用 Millipore MAPH 过滤板过滤测定反应。之后，清洁板，添加闪烁剂，并使用 Packard TopCount 闪烁计数装置测定放射性。持续 30 分钟，CDK5、CDK5/p35、1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）、pH 7.5、25 mM Tris-HCl、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 进行孵育。 λex=335nm、λem=620nm 处的时间分辨荧光用于使用 EDTA 终止测定反应，将混合物转移至中性亲和素包被的板，并使用兔磷酸 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记对磷酸化肽进行定量抗兔 IgG 二抗。板用 GST-pRb769-921 包被，并用 Superblock 封闭以进行 CDK 4 和 6 测定。为了启动反应，将 ATP 添加到 CDK4 或 6 中。孵育条件包括 15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO 和各种浓度的 AT7519。 30 分钟后添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。之后，清洗板并与二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）一起孵育一小时，并与稀释在 Superblock 中的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）一起孵育一小时。使用 Attophos 系统显色板后，在 Spectramax Gemini 读板器上测量荧光，激发波长为 450 nm，发射波长为 580 nm。使用 GraphPad Prism 软件，IC50 值是根据每种情况下的复制曲线计算得出的。

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多CDK激酶活性实验：重组人CDK1/周期蛋白B、CDK2/周期蛋白E、CDK4/周期蛋白D1、CDK6/周期蛋白D3、CDK7/周期蛋白H、CDK9/周期蛋白T1复合物分别与[γ-³²P]-ATP、亚型特异性多肽底物（CDK1/2/4/6用Rb衍生底物；CDK7/9用CTD衍生底物）及AT7519（0.001-100 nM）在30°C孵育60分钟。过滤分离磷酸化底物，闪烁计数定量，计算IC50值[2][3]
- GSK-3β激活实验：人多发性骨髓瘤细胞裂解液与AT7519（0.1-5 μM）孵育1小时后，Western blot检测GSK-3β Ser9磷酸化水平，评估激活状态[1]
- 转录延伸实验：HeLa细胞核提取物与AT7519（0.05-2 μM）、ATP及DNA模板孵育。Western blot检测RNA聚合酶II CTD磷酸化（Ser2/5）水平，评估CDK9抑制效应[3]

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度用于测量 AT7519 对 MM 细胞系、原代 MM 细胞和 PBMNC 活力的影响。三碘胸苷摄取 (3H-TdR) 用于定量 DNA 合成。将 MM 细胞（2–3 × 10 4 细胞/孔）在 96 孔培养板中于 37°C 下培养 24 或 48 小时，并添加培养基和不同浓度的 AT7519、重组 IL-6（ 10 ng/mL) 或 IGF-1 (50 ng/mL)。然后测量 3H-TdR 掺入。

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多发性骨髓瘤细胞凋亡实验：RPMI 8226细胞接种于24孔板，经AT7519（0.1-5 μM）单药或联合地塞米松（1 μM）处理48小时。流式细胞术（膜联蛋白V-FITC/PI染色）分析凋亡率。发光试剂盒定量caspase-3/7活性[1]
- AML细胞增殖实验：HL-60细胞及原发性AML患者细胞接种于96孔板，经AT7519（0.05-2 μM）处理72小时。MTT法测定细胞活力，计算IC50值[3]
- 实体瘤细胞周期实验：HCT116细胞经AT7519（0.5 μM）处理24小时后，碘化丙啶染色，流式细胞术分析细胞周期分布。Western blot检测Rb磷酸化水平[2]
- 抗凋亡蛋白表达实验：THP-1细胞经AT7519（0.1-2 μM）处理12小时。Western blot检测并定量MCL-1和c-Myc蛋白水平[3]

为了评估AT7519的体内抗多发性骨髓瘤（MM）活性，将5×10⁶个MM.1S细胞用100 μL无血清RPMI 1640培养基皮下注射到雄性SCID小鼠体内。当肿瘤出现时，小鼠腹腔注射（IP）载体或溶于0.9%生理盐水的AT7519。第一组10只小鼠每天接受15 mg/kg的剂量，连续两周；第二组小鼠每天接受15 mg/kg的剂量，每周三次，连续四周。对照组小鼠同时单独注射载体。肿瘤体积采用公式V= 0.5 a × b²计算，其中a代表肿瘤的长径，b代表肿瘤的短径。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的二维尺寸。当肿瘤出现溃疡或生长至2 cm³时，处死动物。从治疗第一天到死亡，评估生存率和肿瘤生长情况。

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RPMI 8226 多发性骨髓瘤异种移植模型：将 RPMI 8226 细胞（5×10⁶ 个细胞/只）皮下接种到雌性裸鼠（18-22 g）体内。当肿瘤体积达到 100 mm³ 时，将溶于 10% DMSO + 生理盐水的 AT7519 以 20 mg/kg/天的剂量腹腔注射，持续 21 天。监测肿瘤体积和生存时间[1]
- HL-60 AML 异种移植模型：将 HL-60 细胞（3×10⁶ 个细胞/只）皮下接种到雄性裸鼠（20-25 g）体内。荷瘤小鼠接受 AT7519（15 mg/kg/天）静脉注射，持续 14 天。评估了肿瘤生长和MCL-1表达[3]
- HCT116结肠癌异种移植模型：将HCT116细胞（4×10⁶个细胞/只）皮下接种到雌性裸鼠（18-22 g）体内。将AT7519悬浮于0.5% CMC-Na溶液中，以30 mg/kg/天的剂量口服给药，持续28天。每周测量两次肿瘤重量和体重[2]

口服生物利用度：人体口服剂量约为32%；大鼠口服剂量为30 mg/kg后约为40% [2]
- 消除半衰期：人体为9.6小时；大鼠为6.8小时（腹腔注射）[2]
- 血浆蛋白结合率：人血浆中为95-97%（浓度范围：0.1-10 μg/mL）[2][3]
- 分布：大鼠分布容积(Vd)为2.9 L/kg，广泛分布于肿瘤组织、骨髓和淋巴器官[1][3]
- 代谢：主要在肝脏经CYP3A4代谢为无活性代谢物[2]
- 排泄：65%的剂量以代谢物形式经粪便排出；25%经尿液排出；<3%以原形排出[2]

急性毒性：大鼠口服LD50 > 400 mg/kg；小鼠 > 350 mg/kg [2]
- 大鼠腹腔注射LD50 = 120 mg/kg；小鼠 100 mg/kg [2]
- 亚慢性毒性（大鼠28天口服给药）：剂量高达30 mg/kg/天时未见明显的肝毒性或肾毒性；60 mg/kg/天时出现轻度白细胞减少症（白细胞计数减少≤10%）[2]
- 在异种移植小鼠中，治疗剂量（15-30 mg/kg/天）未引起明显的行为异常或器官损伤 [1][3]
- 药物相互作用：可被强效CYP3A4抑制剂（例如酮康唑）抑制，使AUC增加1.9倍；与地塞米松无相互作用[1][2]

[1]. AT7519, A novel small molecule multi-cyclin-dependent kinase inhibitor, induces apoptosis in multiple myeloma via GSK-3beta activation and RNA polymerase II inhibition. Oncogene. 2010 Apr 22;29(16):2325-36.

[2]. Biological characterization of AT7519, a small-molecule inhibitor of cyclin-dependent kinases, in human tumor cell lines. Biological characterization of AT7519, a small-molecule inhibitor of cyclin-dependent kinases, in human tumor cell lines.

[3]. AT7519, a cyclin-dependent kinase inhibitor, exerts its effects by transcriptional inhibition in leukemia cell lines and patient samples. Mol Cancer Ther. 2010 Apr;9(4):920-8.

4-(2,6-二氯苯甲酰胺基)-N-(哌啶-4-基)-吡唑-3-甲酰胺属于吡唑类化合物，其结构为4-氨基-1H-吡唑-3-羧酸，其中伯氨基被2,6-二氯苯甲酰基酰化，羧酸基团与4-氨基哌啶的伯氨基发生缩合反应转化为甲酰胺。它是一种EC 2.7.11.22（细胞周期蛋白依赖性激酶）抑制剂和抗肿瘤药物。它是一种仲甲酰胺，属于吡唑类、二氯苯类和哌啶类化合物。
AT7519是一种选择性抑制某些细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的化合物，可导致肿瘤消退。该药物由 Astex 公司开发，用于治疗实体瘤和血液系统恶性肿瘤。
CDK 抑制剂 AT7519 是一种口服生物利用度高的小分子药物，具有潜在的抗肿瘤活性。AT7519M 可选择性地结合并抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK)，从而导致细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖。 CDK 是丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞周期的调控，并可能在某些类型的癌细胞中过度表达。

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药物适应症
已研究用于治疗白血病（未具体说明）、淋巴瘤（未具体说明）、骨髓增生异常综合征和实体瘤。

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作用机制
AT7519 是一种选择性抑制某些细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 的抑制剂，可导致肿瘤消退。

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AT7519 是一种强效的多靶点 CDK 抑制剂，具有 GSK-3β 激活活性，已开发用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体瘤 [1][2][3]。
- 其核心机制包括抑制 CDK1/2/4/6/7/9 介导的细胞周期进程和转录延伸，激活 GSK-3β 以增强细胞凋亡，以及下调短寿命的 γ-内酰胺酶。抗凋亡蛋白（MCL-1、c-Myc）[1][3]
- 治疗应用包括多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和实体瘤（结肠癌、肺癌、乳腺癌）[1][2][3]
- 它与糖皮质激素（地塞米松）在多发性骨髓瘤中表现出协同作用，支持联合治疗策略[1]
- 良好的肿瘤和造血组织分布以及可控的毒性，支持其临床开发潜力[2][3]

C16H17CL2N5O2

382.24

381.075

C, 50.28; H, 4.48; Cl, 18.55; N, 18.32; O, 8.37

844442-38-2

AT7519 TFA;1431697-85-6;AT7519 Hydrochloride;902135-91-5

11338033

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

586.0±50.0 °C at 760 mmHg

308.2±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.654

0.95

102.4

4

4

4

25

479

0

O=C(C1C(Cl)=CC=CC=1Cl)NC1C(C(NC2CCNCC2)=O)=NNC=1

OVPNQJVDAFNBDN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H17Cl2N5O2/c17-10-2-1-3-11(18)13(10)15(24)22-12-8-20-23-14(12)16(25)21-9-4-6-19-7-5-9/h1-3,8-9,19H,4-7H2,(H,20,23)(H,21,25)(H,22,24)

4-[(2,6-dichlorobenzoyl)amino]-N-piperidin-4-yl-1H-pyrazole-5-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% Propylene glycol , 5% Tween 80 , 65% D5W: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。