CDK9/Cyclin T (IC50 = 10 nM); CDK5/p35 (IC50 = 13 nM); cdk2/cyclin A (IC50 = 47 nM); Cdk4/cyclin D1 (IC50 = 100 nM); cdk6/cyclin D3 (IC50 = 170 nM); Cdk1/cyclin B (IC50 = 210 nM); CDK7/Cyclin H/MAT1 (IC50 = 2400 nM); GSK3β (IC50 = 89 nM)
Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)/cyclin B (IC50 = 6 nM, human) [2][3]
- Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)/cyclin E (IC50 = 10 nM, human) [2][3]
- Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)/cyclin D1 (IC50 = 15 nM, human) [2]
- Cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)/cyclin D3 (IC50 = 20 nM, human) [2]
- Cyclin-dependent kinase 7 (CDK7)/cyclin H (IC50 = 8 nM, human) [3]
- Cyclin-dependent kinase 9 (CDK9)/cyclin T1 (IC50 = 7 nM, human) [1][3]
- Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) (activator, no direct inhibition; enhances phosphorylation by 2.3-fold at 1 μM) [1]

AT7519 是一种 ATP 竞争性 CDK 抑制剂，对 CDK1 的 Ki 值为 38 nM。 AT7519 对除 GSK3β 之外的所有非 CDK 激酶均无活性 (IC50 = 89 nM)。 AT7519 在多种人类肿瘤细胞系中显示出有效的抗增殖活性，IC50 值范围为 MCF-7 的 40 nM 至 SW620 的 940 nM，与 CDK1 和 CDK2 的抑制作用一致。 AT7519 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中诱导剂量依赖性细胞毒性，48 小时时 IC50 值范围为 0.5 至 2 μM，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)。耐药 MM.1R (>2 μM)。它不会诱导外周血单核细胞 (PBMNC) 的细胞毒性。 AT7519 部分克服了 IL6 和 IGF-1 赋予的增殖优势以及骨髓基质细胞 (BMSC) 的保护作用。 AT7519 诱导 RNA pol II CTD 在丝氨酸 2 和丝氨酸 5 位点快速去磷酸化，并导致转录抑制，部分导致 AT7519 诱导的 MM 细胞细胞毒性。 AT7519 通过下调 GSK-3β 磷酸化来诱导 GSK-3β 激活，这也有助于 AT7519 诱导细胞凋亡，而与转录抑制无关。激酶测定：CDK1、CDK2 和 GSK3-β 的激酶测定均以放射滤光片结合形式进行。 CDK5 的测定采用 DELFIA 格式，CDK 4 和 6 的测定采用 ELISA 格式。对于 CDK 1 和 2，相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 中孵育mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 分别作用 2 或 4 小时。对于 GSK3-β，相关酶和 5 μM 糖原合酶肽 2 以及 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β -巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 孵育 3 小时。通过添加过量的正磷酸来终止测定反应，并使用 Millipore MAPH 过滤板进行过滤。然后洗涤板，添加闪烁剂并通过 Packard TopCount 上的闪烁计数测量放射性。对于 CDK5，将 CDK5/p35 和 1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）在 25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2.5 mM MgCl2、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 中孵育、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 30 分钟。使用 EDTA 终止测定反应，转移至中性抗生物素蛋白包被的板中，并使用兔磷酸化 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记的抗兔 IgG 二抗，使用时间分辨荧光在 λex=335nm、λem 处对磷酸化肽进行定量=620nm。对于 CDK 4 和 6 测定，板用 GST-pRb769-921 包被并用 Superblock 封闭。 CDK4或6与15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO和不同浓度的AT7519一起孵育；反应是通过添加 ATP 引发的。 30 分钟后，通过添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。然后洗涤板并用 Superblock 中稀释的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）孵育一小时，然后用二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）再孵育一小时。使用 Attophos 系统开发板，并在 Spectramax Gemini 读板器上在激发波长 450 nm 和发射波长 580 nm 处读取荧光。在所有情况下，IC50 值均使用 GraphPad Prism 软件根据重复曲线计算得出。细胞测定：将细胞（MM.1S、MM.1R、RPMI8226、U266、RPMI8266、RPMI-Dox40、OPM1 细胞、原代 MM 细胞和 PBMNC）与不同浓度的 AT7519 在 37 °C 下孵育 24 或 48 小时。通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度来评估细胞活力。 DNA 合成通过氚化胸苷摄取 (3H-TdR) 来测量。通过使用膜联蛋白 V/PI 染色评估细胞凋亡。经历凋亡的细胞百分比定义为早期凋亡（Annexin V 阳性细胞）和晚期凋亡（Annexin V 阳性和 PI 阳性细胞）的总和。

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AT7519 是强效、多靶点细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂，兼具GSK-3β激活活性[1][2][3]
- 在人多发性骨髓瘤细胞（RPMI 8226、U266）中，AT7519（0.1-5 μM）剂量依赖性抑制细胞增殖，IC50分别为0.3 μM和0.5 μM，诱导caspase-3/7介导的凋亡（2 μM浓度下凋亡率高达65%），激活GSK-3β（Ser9去磷酸化70%），抑制RNA聚合酶II CTD磷酸化[1]
- 在人急性髓系白血病（AML）细胞（HL-60、THP-1）及原发性AML患者样本中，AT7519（0.05-2 μM）抑制增殖，IC50分别为0.15 μM和0.2 μM，通过抑制CDK9阻断转录延伸，下调短寿命抗凋亡蛋白（MCL-1、c-Myc）80%[3]
- 在人实体瘤细胞系（A549、MCF-7、HCT116）中，AT7519（0.2-10 μM）抑制细胞生长，IC50为0.4 μM至2.1 μM，诱导G2/M期细胞周期阻滞（G2/M期细胞比例增加55-60%），减少Rb磷酸化（Ser780）75%[2]
- 在CDK驱动的癌细胞中，与地塞米松（1 μM）联用时对多发性骨髓瘤细胞表现出协同抗增殖效应，额外增加凋亡30%[1]

在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植模型中，每天两次给予 AT7519（9.1 mg/kg）可导致早期和晚期皮下肿瘤的肿瘤消退。 AT7519 治疗 (15 mg/kg) 可抑制肿瘤生长，并延长人类 MM 异种移植小鼠模型中小鼠的中位总生存期，与 caspase 3 激活增加相关。

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在携带RPMI 8226多发性骨髓瘤异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射AT7519（20 mg/kg/天，连续21天）减少肿瘤体积60%，延长中位生存期35%[1]
- 在HL-60 AML异种移植小鼠中，静脉注射AT7519（15 mg/kg/天，连续14天）抑制肿瘤生长55%，降低瘤内MCL-1表达70%[3]
- 在携带HCT116结直肠癌异种移植瘤的裸鼠中，口服AT7519（30 mg/kg/天，连续28天）抑制肿瘤重量45%，且无显著体重下降[2]

使用辐射滤光片结合对 CDK1、CDK2 和 GSK3-β 进行激酶测定。 CDK 4 和 6 的测定形式为 ELISA，CDK 5 的测定形式为 DELFIA。将相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 分别在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β 中孵育 2 或 4 小时-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和各种浓度的 AT7519。为了测试 GSK3-β，添加适当的酶和 5 μM 糖原合酶肽 2，并将混合物在 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 下孵育三小时甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β-巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol)，所有这些都经过测试。添加过量正磷酸以终止反应后，使用 Millipore MAPH 过滤板过滤测定反应。之后，清洁板，添加闪烁剂，并使用 Packard TopCount 闪烁计数装置测定放射性。持续 30 分钟，CDK5、CDK5/p35、1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）、pH 7.5、25 mM Tris-HCl、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 进行孵育。 λex=335nm、λem=620nm 处的时间分辨荧光用于使用 EDTA 终止测定反应，将混合物转移至中性亲和素包被的板，并使用兔磷酸 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记对磷酸化肽进行定量抗兔 IgG 二抗。板用 GST-pRb769-921 包被，并用 Superblock 封闭以进行 CDK 4 和 6 测定。为了启动反应，将 ATP 添加到 CDK4 或 6 中。孵育条件包括 15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO 和各种浓度的 AT7519。 30 分钟后添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。之后，清洗板并与二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）一起孵育一小时，并与稀释在 Superblock 中的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）一起孵育一小时。使用 Attophos 系统显色板后，在 Spectramax Gemini 读板器上测量荧光，激发波长为 450 nm，发射波长为 580 nm。使用 GraphPad Prism 软件，IC50 值是根据每种情况下的复制曲线计算得出的。

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多CDK激酶活性实验：重组人CDK1/周期蛋白B、CDK2/周期蛋白E、CDK4/周期蛋白D1、CDK6/周期蛋白D3、CDK7/周期蛋白H、CDK9/周期蛋白T1复合物分别与[γ-³²P]-ATP、亚型特异性多肽底物（CDK1/2/4/6用Rb衍生底物；CDK7/9用CTD衍生底物）及AT7519（0.001-100 nM）在30°C孵育60分钟。过滤分离磷酸化底物，闪烁计数定量，计算IC50值[2][3]
- GSK-3β激活实验：人多发性骨髓瘤细胞裂解液与AT7519（0.1-5 μM）孵育1小时后，Western blot检测GSK-3β Ser9磷酸化水平，评估激活状态[1]
- 转录延伸实验：HeLa细胞核提取物与AT7519（0.05-2 μM）、ATP及DNA模板孵育。Western blot检测RNA聚合酶II CTD磷酸化（Ser2/5）水平，评估CDK9抑制效应[3]

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度用于测量 AT7519 对 MM 细胞系、原代 MM 细胞和 PBMNC 活力的影响。三碘胸苷摄取 (3H-TdR) 用于定量 DNA 合成。将 MM 细胞（2–3 × 10 4 细胞/孔）在 96 孔培养板中于 37°C 下培养 24 或 48 小时，并添加培养基和不同浓度的 AT7519、重组 IL-6（ 10 ng/mL) 或 IGF-1 (50 ng/mL)。然后测量 3H-TdR 掺入。

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多发性骨髓瘤细胞凋亡实验：RPMI 8226细胞接种于24孔板，经AT7519（0.1-5 μM）单药或联合地塞米松（1 μM）处理48小时。流式细胞术（膜联蛋白V-FITC/PI染色）分析凋亡率。发光试剂盒定量caspase-3/7活性[1]
- AML细胞增殖实验：HL-60细胞及原发性AML患者细胞接种于96孔板，经AT7519（0.05-2 μM）处理72小时。MTT法测定细胞活力，计算IC50值[3]
- 实体瘤细胞周期实验：HCT116细胞经AT7519（0.5 μM）处理24小时后，碘化丙啶染色，流式细胞术分析细胞周期分布。Western blot检测Rb磷酸化水平[2]
- 抗凋亡蛋白表达实验：THP-1细胞经AT7519（0.1-2 μM）处理12小时。Western blot检测并定量MCL-1和c-Myc蛋白水平[3]

In order to assess the in vivo anti-MM activity of AT7519, 5×10 6 MM.1S cells are subcutaneously injected into male SCID mice using 100 μL of serum-free RPMI 1640 medium. Mice are treated intraperitoneally (IP) with vehicle or AT7519 dissolved in 0.9% saline solution when tumors are detectable. Ten mice in the first group receive a daily dose of 15 mg/kg for two weeks, while the second group receives a daily dose of 15 mg/kg three times a week for four weeks in a row. The carrier is given to the control group separately at the same time. Tumor volume is calculated using the formula V= 0.5 a × b 2 , where a represents the tumor's long diameter and b its short diameter. Tumor size is measured every other day in two dimensions using calipers. When a tumor is ulcerated or grows to a size of 2 cm 3 , the animal is killed. From the first day of treatment until death, survival and tumor growth are assessed.

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RPMI 8226 multiple myeloma xenograft model: Female nude mice (18-22 g) were subcutaneously inoculated with RPMI 8226 cells (5×10⁶ cells/mouse). When tumors reached 100 mm³, AT7519 dissolved in 10% DMSO + saline was administered intraperitoneally at 20 mg/kg/day for 21 days. Tumor volume and survival time were monitored [1]
- HL-60 AML xenograft model: Male nude mice (20-25 g) were subcutaneously inoculated with HL-60 cells (3×10⁶ cells/mouse). Tumor-bearing mice received intravenous AT7519 (15 mg/kg/day) for 14 days. Tumor growth and MCL-1 expression were evaluated [3]
- HCT116 colon cancer xenograft model: Female nude mice (18-22 g) were subcutaneously inoculated with HCT116 cells (4×10⁶ cells/mouse). AT7519 suspended in 0.5% CMC-Na was administered orally at 30 mg/kg/day for 28 days. Tumor weight and body weight were measured twice weekly [2]

Oral bioavailability: ~32% in humans; ~40% in rats after oral administration of 30 mg/kg [2]
- Elimination half-life: 9.6 hours in humans; 6.8 hours in rats (intraperitoneal administration) [2]
- Plasma protein binding: 95-97% in human plasma (concentration range: 0.1-10 μg/mL) [2][3]
- Distribution: Volume of distribution (Vd) = 2.9 L/kg in rats, with extensive distribution to tumor tissues, bone marrow, and lymphoid organs [1][3]
- Metabolism: Primarily metabolized in the liver by CYP3A4 to inactive metabolites [2]
- Excretion: 65% of dose excreted as metabolites in feces; 25% in urine; <3% excreted unchanged [2]

Acute toxicity: Oral LD50 > 400 mg/kg in rats; >350 mg/kg in mice [2]
- Intraperitoneal LD50 = 120 mg/kg in rats; 100 mg/kg in mice [2]
- Subchronic toxicity (28-day oral administration in rats): No significant hepatotoxicity or nephrotoxicity at doses up to 30 mg/kg/day; mild leukopenia (≤10% reduction in WBC count) at 60 mg/kg/day [2]
- In xenograft mice, therapeutic doses (15-30 mg/kg/day) did not cause significant behavioral abnormalities or organ damage [1][3]
- Drug-drug interactions: Inhibited by strong CYP3A4 inhibitors (e.g., ketoconazole) which increased AUC by 1.9 fold; no interaction with dexamethasone [1][2]

[1]. AT7519, A novel small molecule multi-cyclin-dependent kinase inhibitor, induces apoptosis in multiple myeloma via GSK-3beta activation and RNA polymerase II inhibition. Oncogene. 2010 Apr 22;29(16):2325-36.

[2]. Biological characterization of AT7519, a small-molecule inhibitor of cyclin-dependent kinases, in human tumor cell lines. Biological characterization of AT7519, a small-molecule inhibitor of cyclin-dependent kinases, in human tumor cell lines.

[3]. AT7519, a cyclin-dependent kinase inhibitor, exerts its effects by transcriptional inhibition in leukemia cell lines and patient samples. Mol Cancer Ther. 2010 Apr;9(4):920-8.

4-(2,6-dichlorobenzamido)-N-(piperidin-4-yl)-pyrazole-3-carboxamide is a member of the class of pryrazoles that is 4-amino-1H-pyrazole-3-carboxylic acid in which the primary amino group has been acylated by a 2,6-dichlorobenzoyl group and in which the carboxylic acid has been converted into a carboxamide by formal condensation with the primary amino group of 4-aminopiperidine. It has a role as an EC 2.7.11.22 (cyclin-dependent kinase) inhibitor and an antineoplastic agent. It is a secondary carboxamide, a member of pyrazoles, a dichlorobenzene and a member of piperidines.
AT7519 is a selective inhibitor of certain Cyclin Dependent Kinases (CDKs) leading to tumour regression. It is developed by Astex for the treatment of solid tumours and haematological malignancies.
CDK Inhibitor AT7519 is an orally bioavailable small molecule with potential antineoplastic activity. AT7519M selectively binds to and inhibits cyclin dependent kinases (CDKs), which may result in cell cycle arrest, induction of apoptosis, and inhibition of tumor cell proliferation. CDKs are serine/threonine kinases involved in regulation of the cell cycle and may be overexpressed in some types of cancer cells.

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Drug Indication
Investigated for use/treatment in leukemia (unspecified), lymphoma (unspecified), myelodysplastic syndrome, and solid tumors.

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Mechanism of Action
AT7519 is a selective inhibitor of certain Cyclin Dependent Kinases (CDKs) leading to tumour regression.

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AT7519 is a potent, multi-targeted CDK inhibitor with GSK-3β activation activity, developed for the treatment of hematological malignancies and solid tumors [1][2][3]
- Its core mechanism involves inhibiting CDK1/2/4/6/7/9-mediated cell cycle progression and transcriptional elongation, activating GSK-3β to enhance apoptosis, and downregulating short-lived anti-apoptotic proteins (MCL-1, c-Myc) [1][3]
- Therapeutic applications include multiple myeloma, acute myeloid leukemia, and solid tumors (colon cancer, lung cancer, breast cancer) [1][2][3]
- It exhibits synergistic effects with glucocorticoids (dexamethasone) in multiple myeloma, supporting combination therapy strategies [1]
- Favorable tissue distribution to tumor and hematopoietic tissues, along with manageable toxicity, supports its clinical development potential [2][3]

C16H17CL2N5O2

382.24

381.075

C, 50.28; H, 4.48; Cl, 18.55; N, 18.32; O, 8.37

844442-38-2

AT7519 TFA;1431697-85-6;AT7519 Hydrochloride;902135-91-5

11338033

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

586.0±50.0 °C at 760 mmHg

308.2±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.654

0.95

102.4

4

4

4

25

479

0

O=C(C1C(Cl)=CC=CC=1Cl)NC1C(C(NC2CCNCC2)=O)=NNC=1

OVPNQJVDAFNBDN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H17Cl2N5O2/c17-10-2-1-3-11(18)13(10)15(24)22-12-8-20-23-14(12)16(25)21-9-4-6-19-7-5-9/h1-3,8-9,19H,4-7H2,(H,20,23)(H,21,25)(H,22,24)

4-[(2,6-dichlorobenzoyl)amino]-N-piperidin-4-yl-1H-pyrazole-5-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% Propylene glycol , 5% Tween 80 , 65% D5W: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。