Cyclin-dependent kinase 1 (CDK1)
Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2)
Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)
Cyclin-dependent kinase 5 (CDK5)
Cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)
Cyclin-dependent kinase 9 (CDK9)
Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3β) (Note: The paper states that in vitro kinase assays showed AT7519 inhibits GSK-3, but the cellular effect observed was activation via dephosphorylation at Ser9) [1]

体外活性：AT7519 是一种 ATP 竞争性 CDK 抑制剂，对 CDK1 的 Ki 值为 38 nM。 AT7519 对除 GSK3β 之外的所有非 CDK 激酶均无活性 (IC50 = 89 nM)。 AT7519 在多种人类肿瘤细胞系中显示出有效的抗增殖活性，IC50 值范围为 MCF-7 的 40 nM 至 SW620 的 940 nM，与 CDK1 和 CDK2 的抑制作用一致。 AT7519 在多发性骨髓瘤 (MM) 细胞系中诱导剂量依赖性细胞毒性，48 小时时 IC50 值范围为 0.5 至 2 μM，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)，最敏感的细胞系是 MM.1S (0.5 μM) 和 U266 (0.5 μM)。耐药 MM.1R (>2 μM)。它不会诱导外周血单核细胞 (PBMNC) 的细胞毒性。 AT7519 部分克服了 IL6 和 IGF-1 赋予的增殖优势以及骨髓基质细胞 (BMSC) 的保护作用。 AT7519 诱导 RNA pol II CTD 在丝氨酸 2 和丝氨酸 5 位点快速去磷酸化，并导致转录抑制，部分导致 AT7519 诱导的 MM 细胞细胞毒性。 AT7519 通过下调 GSK-3β 磷酸化来诱导 GSK-3β 激活，这也有助于 AT7519 诱导细胞凋亡，而与转录抑制无关。激酶测定：CDK1、CDK2 和 GSK3-β 的激酶测定均以放射滤光片结合形式进行。 CDK5 的测定采用 DELFIA 格式，CDK 4 和 6 的测定采用 ELISA 格式。对于 CDK 1 和 2，相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 中孵育mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 分别作用 2 或 4 小时。对于 GSK3-β，相关酶和 5 μM 糖原合酶肽 2 以及 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β -巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol) 和不同浓度的 AT7519 孵育 3 小时。通过添加过量的正磷酸来终止测定反应，并使用 Millipore MAPH 过滤板进行过滤。然后洗涤板，添加闪烁剂并通过 Packard TopCount 上的闪烁计数测量放射性。对于 CDK5，将 CDK5/p35 和 1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）在 25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2.5 mM MgCl2、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 中孵育、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 30 分钟。使用 EDTA 终止测定反应，转移至中性抗生物素蛋白包被的板中，并使用兔磷酸化 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记的抗兔 IgG 二抗，使用时间分辨荧光在 λex=335nm、λem 处对磷酸化肽进行定量=620nm。对于 CDK 4 和 6 测定，板用 GST-pRb769-921 包被并用 Superblock 封闭。 CDK4或6与15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO和不同浓度的AT7519一起孵育；反应是通过添加 ATP 引发的。 30 分钟后，通过添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。然后洗涤板并用 Superblock 中稀释的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）孵育一小时，然后用二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）再孵育一小时。使用 Attophos 系统开发板，并在 Spectramax Gemini 读板器上在激发波长 450 nm 和发射波长 580 nm 处读取荧光。在所有情况下，IC50 值均使用 GraphPad Prism 软件根据重复曲线计算得出。细胞测定：将细胞（MM.1S、MM.1R、RPMI8226、U266、RPMI8266、RPMI-Dox40、OPM1 细胞、原代 MM 细胞和 PBMNC）与不同浓度的 AT7519 在 37 °C 下孵育 24 或 48 小时。通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 染料吸光度来评估细胞活力。 DNA 合成通过氚化胸苷摄取 (3H-TdR) 来测量。通过使用膜联蛋白 V/PI 染色评估细胞凋亡。经历凋亡的细胞百分比定义为早期凋亡（Annexin V 阳性细胞）和晚期凋亡（Annexin V 阳性和 PI 阳性细胞）的总和。

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AT7519 对多发性骨髓瘤细胞系（包括对常规治疗敏感和耐药的）以及原代患者来源的MM细胞表现出剂量依赖性的细胞毒性，48小时IC50值在0.5至2 μM之间。对健康志愿者的外周血单个核细胞毒性极小。[1]
在共培养实验中，AT7519 部分抑制了骨髓基质细胞和细胞因子（IL-6, IGF-1）赋予MM细胞的增殖优势。[1]
AT7519 在MM.1S细胞中以时间和剂量依赖性方式诱导细胞周期阻滞（G0/G1期和G2/M期细胞增加）和细胞凋亡，这通过细胞周期分析（亚G1群）、Annexin V/PI染色以及caspase -9, -3, -8的切割得到证实。[1]
AT7519 处理导致RNA聚合酶II C末端结构域在丝氨酸2和丝氨酸5位点的快速去磷酸化（1小时内），而不影响总RNA pol II蛋白水平。这与48小时后[³H]尿苷掺入实验测得的约50%的总RNA合成抑制相关。[1]
AT7519 处理导致短寿命抗凋亡蛋白Mcl-1和XIAP的表达在4小时内下降。[1]
AT7519 在2小时内诱导GSK-3β在丝氨酸9位点的快速去磷酸化（激活），并伴随其下游底物糖原合成酶的磷酸化增加。这种激活与GSK-3β靶标c-Myc和cyclin D1的下调相关。GSK-3β的激活独立于其上游调节因子（Akt, p70S6K），后者反而被反常地磷酸化（激活）。[1]
用选择性GSK-3抑制剂AR-A014418预处理或使用特异性shRNA敲低GSK-3β，部分挽救了MM细胞免受 AT7519 诱导的细胞毒性，表明GSK-3β激活有助于其凋亡效应。[1]
用特异性RNA pol II抑制剂α-amanitin处理，重现了RNA pol II的去磷酸化，但不影响GSK-3β的磷酸化状态，证明 AT7519 对GSK-3β的激活独立于转录抑制。[1]

在 HCT116 和 HT29 结肠癌异种移植模型中，每天两次给予 AT7519（9.1 mg/kg）可导致早期和晚期皮下肿瘤的肿瘤消退。 AT7519 治疗 (15 mg/kg) 可抑制肿瘤生长，并延长人类 MM 异种移植小鼠模型中小鼠的中位总生存期，与 caspase 3 激活增加相关。

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在人MM.1S异种移植小鼠模型中，腹腔注射 AT7519 (15 mg/kg) 与溶剂对照组相比，显著抑制了肿瘤生长。[1] AT7519 治疗 (15 mg/kg，方案一：每日一次，连续五天，休息两天后重复一周，共两周；方案二：每周三次，连续四周) 显著延长了荷瘤小鼠的中位总生存期（分别为40天和39天），而对照组为27.5天。[1]
对 AT7519 治疗小鼠肿瘤的免疫组化分析显示caspase-3激活增加，证实了体内凋亡的诱导。[1]
AT7519 治疗未显著影响小鼠体重，表明在该模型中测试剂量下具有耐受性。[1]

使用辐射滤光片结合对 CDK1、CDK2 和 GSK3-β 进行激酶测定。 CDK 4 和 6 的测定形式为 ELISA，CDK 5 的测定形式为 DELFIA。将相关 CDK 和 0.12 μg/mL 组蛋白 H1 分别在 20 mM MOPS、pH 7.2、25 mM β 中孵育 2 或 4 小时-甘油磷酸、5 mM EDTA、15 mM MgCl2、1 mM 原钒酸钠、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、45 μM ATP (0.78 Ci/mmol) 和各种浓度的 AT7519。为了测试 GSK3-β，添加适当的酶和 5 μM 糖原合酶肽 2，并将混合物在 10 mM MOPS pH 7.0、0.1 mg/mL BSA、0.001% Brij-35、0.5% 下孵育三小时甘油、0.2 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.01% β-巯基乙醇、15 μM ATP (2.31 Ci/mmol)，所有这些都经过测试。添加过量正磷酸以终止反应后，使用 Millipore MAPH 过滤板过滤测定反应。之后，清洁板，添加闪烁剂，并使用 Packard TopCount 闪烁计数装置测定放射性。持续 30 分钟，CDK5、CDK5/p35、1μM 生物素化组蛋白 H1 肽（生物素-PKTPKKAKKL）、pH 7.5、25 mM Tris-HCl、0.025% Brij-35、0.1 mg/mL BSA、1 mM DTT 、15 μM ATP 和不同浓度的 AT7519 进行孵育。 λex=335nm、λem=620nm 处的时间分辨荧光用于使用 EDTA 终止测定反应，将混合物转移至中性亲和素包被的板，并使用兔磷酸 cdk1 底物多克隆抗体和 DELFIA 铕标记对磷酸化肽进行定量抗兔 IgG 二抗。板用 GST-pRb769-921 包被，并用 Superblock 封闭以进行 CDK 4 和 6 测定。为了启动反应，将 ATP 添加到 CDK4 或 6 中。孵育条件包括 15 mM MgCl2、50 mM HEPES、pH 7.4、1 mM DTT、1 mM EGTA、pH 8.0、0.02% Triton X-100、2.5% DMSO 和各种浓度的 AT7519。 30 分钟后添加 0.5 M EDTA pH 8.0 终止反应。之后，清洗板并与二抗（碱性磷酸酶连接的抗兔）一起孵育一小时，并与稀释在 Superblock 中的一抗（抗 p-Rb 丝氨酸 780）一起孵育一小时。使用 Attophos 系统显色板后，在 Spectramax Gemini 读板器上测量荧光，激发波长为 450 nm，发射波长为 580 nm。使用 GraphPad Prism 软件，IC50 值是根据每种情况下的复制曲线计算得出的。

AT7519 对原代 MM 细胞、MM 细胞系和 PBMNC 活力的可评估影响通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5 二苯基四溴化钠 (MTT) 的染料吸光度来确定。测量 DNA 合成的测定使用氚化胸苷摄取 (3H-TdR)。将 MM 细胞（2–3 × 10⁴ 细胞/孔）在 96 孔培养板中于 37°C 下培养 24 或 48 小时后，用培养基和不同浓度的 3H-TdR 掺入进行测量AT7519 和/或重组 IL-6 (10 ng/mL) 或 IGF-1 (50 ng/mL)。

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细胞活力实验 (MTT法): 将MM细胞系、原代患者MM细胞或外周血单个核细胞接种于96孔板，与不同浓度的 AT7519 (0-4 μM) 培养24、48或72小时。加入MTT染料，测量吸光度以确定细胞活力。[1]
DNA合成/增殖实验: 将MM细胞与 AT7519 和/或细胞因子（IL-6, IGF-1）培养24或48小时。在培养结束前8-16小时加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷。收集细胞，测量掺入的放射性以评估DNA合成。[1]
RNA合成实验: 将MM.1S细胞与 AT7519 (0.5 μM) 孵育不同时间（4-48小时）。在最后3.5小时加入[³H]尿苷。收集细胞，测量掺入的放射性以评估RNA合成。[1]
细胞周期分析: 收集经 AT7519 处理的MM细胞，用乙醇固定，RNase处理，并用碘化丙啶染色。通过流式细胞术分析DNA含量以确定细胞周期分布。[1]
细胞凋亡检测 (Annexin V/PI染色): 收集经 AT7519 处理的MM细胞，用Annexin V和PI染色，并通过流式细胞术分析。凋亡细胞百分比定义为Annexin V阳性/PI阴性（早期凋亡）和Annexin V阳性/PI阳性（晚期凋亡）细胞的总和。[1]
蛋白质免疫印迹: 裂解经 AT7519 处理的MM细胞。蛋白质裂解物通过SDS-PAGE分离，转膜，并用针对目的靶点（如磷酸化RNA pol II、总RNA pol II、磷酸化GSK-3β、总GSK-3β、caspases、Mcl-1、XIAP、cyclins、CDKs）的特异性一抗和相应的二抗进行孵育。通过增强化学发光法显示蛋白条带。[1]
慢病毒shRNA敲低: 在293T细胞中生产含有GSK-3β特异性shRNA或对照shRNA的慢病毒颗粒。在polybrene存在下，用病毒上清感染MM.1S细胞。用嘌呤霉素筛选后，通过蛋白质免疫印迹确认敲低效果。然后将这些细胞用于活力实验，以评估GSK-3β在 AT7519 诱导的细胞毒性中的作用。[1]

In order to assess the in vivo anti-MM activity of AT7519, 5×10⁶ MM.1S cells are subcutaneously injected into male SCID mice using 100 μL of serum-free RPMI 1640 medium. Mice are treated intraperitoneally (IP) with vehicle or AT7519 dissolved in 0.9% saline solution when tumors are detectable. Ten mice in the first group receive a daily dose of 15 mg/kg for two weeks, while the second group receives a daily dose of 15 mg/kg three times a week for four weeks in a row. At the same time, the carrier is given to the control group alone. Tumor volume is calculated using the formula V= 0.5 a × b², where a represents the tumor's long diameter and b its short diameter. Tumor size is measured every other day in two dimensions using calipers. When a tumor is ulcerated or grows to a size of 2 cm³, the animal is killed. From the first day of treatment until death, survival and tumor growth are assessed.

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MM xenograft model: Severe combined immunodeficient (SCID) mice were inoculated subcutaneously with 5×10⁶ MM.1S cells. When tumors became measurable, mice were randomized into treatment groups. [1]
AT7519 was dissolved in saline (0.9%) for administration. [1]
Two dosing regimens were tested via intraperitoneal (IP) injection: 1) 15 mg/kg once daily for five consecutive days, repeated after a two-day break for a second week (total of 10 doses over 2 weeks). 2) 15 mg/kg once daily, three times per week (e.g., Monday, Wednesday, Friday) for four consecutive weeks. [1]
The control group received vehicle (saline) alone on the same schedule. [1]
Tumor dimensions were measured regularly with calipers, and volume was calculated. Animals were monitored for survival and body weight. [1]

[1]. AT7519, A novel small molecule multi-cyclin-dependent kinase inhibitor, induces apoptosis in multiple myeloma via GSK-3beta activation and RNA polymerase II inhibition. Oncogene. 2010 Apr 22;29(16):2325-36.

[2]. Biological characterization of AT7519, a small-molecule inhibitor of cyclin-dependent kinases, in human tumor cell lines. Biological characterization of AT7519, a small-molecule inhibitor of cyclin-dependent kinases, in human tumor cell

[3]. AT7519, a cyclin-dependent kinase inhibitor, exerts its effects by transcriptional inhibition in leukemia cell lines and patient samples. Mol Cancer Ther. 2010 Apr;9(4):920-8.

AT7519 is a novel small-molecule, multi-cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor with the chemical name N-(4-piperidinyl)-4-(2,6-dichlorobenzoylamino)-1H-pyrazole-3-carboxamide. [1]
The study focuses on its preclinical evaluation in multiple myeloma (MM). Dysregulation of CDKs and cyclins is a hallmark of MM, making them attractive therapeutic targets. [1]
The proposed dual mechanism of action in MM involves: 1) Inhibition of transcriptional CDKs (e.g., CDK9, CDK7), leading to RNA pol II CTD dephosphorylation, transcriptional repression, and downregulation of short-lived pro-survival proteins like Mcl-1 and XIAP. 2) Direct or indirect activation of GSK-3β via dephosphorylation at Ser9, contributing to apoptosis independently of transcriptional shutoff. This effect on GSK-3β was surprising given in vitro kinase assay data suggesting inhibition. [1]
The study provides rationale for the clinical evaluation of AT7519 in MM patients. [1]

C18H18CL2F3N5O4

496.2678

495.068

C, 43.56; H, 3.66; Cl, 14.29; F, 11.48; N, 14.11; O, 12.90

1431697-85-6

AT7519;844442-38-2;AT7519 Hydrochloride;902135-91-5

71576690

Solid powder

136

5

9

4

32

563

0

ClC1C([H])=C([H])C([H])=C(C=1C(N([H])C1C([H])=NN([H])C=1C(N([H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C([H])([H])C1([H])[H])=O)=O)Cl.FC(C(=O)O[H])(F)F

XTOQTRBZWZONHQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H17Cl2N5O2.C2HF3O2/c17-10-2-1-3-11(18)13(10)15(24)22-12-8-20-23-14(12)16(25)21-9-4-6-19-7-5-9;3-2(4,5)1(6)7/h1-3,8-9,19H,4-7H2,(H,20,23)(H,21,25)(H,22,24);(H,6,7)

4-[(2,6-dichlorobenzoyl)amino]-N-piperidin-4-yl-1H-pyrazole-5-carboxamide;2,2,2-trifluoroacetic acid

AT7519 trifluoroacetate; AT-7519 trifluoroacetate; AT 7519 trifluoroacetate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~201.50 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.04 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。