Chk1 (IC50 = 5 nM); Chk2 (IC50 = 5 nM)
AZD7762 targets checkpoint kinase 1 (Chk1) with an IC50 value of 1.3 nM and checkpoint kinase 2 (Chk2) with an IC50 value of 7.6 nM in recombinant kinase assays [1]
AZD7762 shows moderate selectivity, with IC50 values > 1 μM for 28 other tested kinases (including CDK1, Aurora A, ATM, ATR) [1]

AZD7762 是一种更具选择性的 Chk1 抑制剂，通过可逆地结合 Chk1 的 ATP 结合位点来抑制 cdc25C 肽的 Chk1 磷酸化，IC50 为 5 nM，Ki 为 3.6 nM。 AZD7762 通过阻断 Cdc25A 的 chk1 依赖性降解和细胞周期蛋白 A 的激活，诱导细胞停滞，EC50 为 0.620 μM，并显着消除喜树碱诱导的 G2 停滞，EC50 为 10 nM。AZD7762 (300 nM) 增强吉西他滨的抗肿瘤功效通过将 GI50 值从 24.1 nM 和 2.25 μM 分别降低至 1.08 nM 和 0.15 μM，针对 SW620 和拓扑替康针对 MDA-MB-231。 AZD7762 对多种带有 p53 野生型、p53 突变、Mdm2 扩增或 p14 缺失的神经母细胞瘤细胞系显示出细胞毒性，IC50 值范围为 82.6-505.9 nM。激酶测定：使用杆状病毒载体将重组人 Chk1 在昆虫细胞中表达为谷胱甘肽 S-转移酶融合体，并通过谷胱甘肽亲和层析进行纯化。合成了 Chk1 的合成肽底物（N-生物素氨基己酰基-KKVRSSGLYRSPMPENLNRPR）。肽和 ATP（冷 + 40 nCi [33P]ATP）的最终测定浓度分别为 0.8 和 1 μM。将不同浓度的 AZD7762、含有肽、chk1 激酶和 ATP 的缓冲液依次添加到 384 孔测定板中。将板孵育 2 小时，通过添加含有 EDTA 和闪烁邻近分析珠的缓冲液来终止反应，并使用 TopCount 读数器读取板。进行数据分析以确定剂量反应（IC50）。细胞测定：对于检查点废除测定，用喜树碱（拓扑异构酶 I 抑制剂；0.07 μg/mL）处理 HT29 细胞 2 小时以诱导 G2 检查点。然后用 AZD7762（12.5 μM 至 6 nM）加诺考达唑的 12 点滴定处理细胞 20 小时。将细胞用 3.7% 甲醛固定 1 小时，用含有 0.05% Triton X 的 PBS 透化，并与抗 phH3 抗体一起孵育 1 小时，然后用 Alexa Fluor 488 抗兔和 Hoechst 染色 1 小时。有丝分裂指数在ArrayScan上测定并表示为经历有丝分裂的细胞的百分比。对于增强测定，SW620 或 MDA-MB-231 细胞给药 24 小时，吉西他滨的 9 点滴定范围为 0.01 至 100 nM，AZD7762 (300 nM) 的恒定剂量。 24小时后，除去培养基，并将AZD7762单独添加回孔中，再继续培养24小时。然后将细胞在不含 AZD7762 的培养基中再孵育 72 小时。通过MTT测定对细胞增殖的影响。

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在多种人类癌细胞系（HCT116、A2780、MCF-7、PC3、HeLa）中，AZD7762 表现出抗增殖活性，IC50 值范围为 25 nM 至 150 nM [1]
- 50 nM AZD7762 可废除 DNA 损伤剂（顺铂、多柔比星）在 HCT116 细胞中诱导的 G2/M 检查点，使 G2/M 期细胞积累比例从 62% 降至 28% [1]
- 100 nM AZD7762 单独处理 A2780 细胞仅诱导轻度凋亡（12% 凋亡细胞），但与顺铂（1 μM）联合处理 72 小时后，凋亡率升高至 58% [1]
- Western blot 检测显示，AZD7762 可抑制 HCT116 细胞中 Chk1 介导的 CDC25C（Ser216）磷酸化及 Chk2 介导的 p53（Ser20）磷酸化 [1]
- AZD7762 与 DNA 靶向治疗药物联合使用时表现出协同抗增殖效应：在 HCT116 细胞中，与顺铂联合的协同指数（CI）= 0.4，与多柔比星联合 CI = 0.35，与紫杉醇联合 CI = 0.5，与吉西他滨联合 CI = 0.45 [1]
- 75 nM AZD7762 可增强顺铂处理细胞中的 DNA 双链断裂，表现为 γ-H2AX 灶点形成增加（较顺铂单独处理高 3.2 倍）[1]

单独使用 25 mg/kg 的 AZD7762 在 H460-DNp53 异种移植小鼠和 SW620 异种移植小鼠中显示出很少的抗肿瘤活性，但当与吉西他滨 (60 mg/kg) 联合给药时，AZD7762 在两种异种移植小鼠中显示出显着的抗肿瘤功效，其即使在 12.5 mg 的低剂量下，细胞杀灭率仍为 0.9 或治疗/对照百分比 (%T/C) 为 26。在 H460-DNp53 异种移植大鼠中，AZD7762 与吉西他滨 (10 mg/kg) 组合给药以剂量依赖性方式抑制肿瘤体积，10 和 20 mg/kg AZD7762 的％T/C 值为 48 和 32，分别。 AZD7762 (25 mg/kg) 与伊立替康 (25 或 50 mg/kg) 组合可导致 SW620 异种移植小鼠的肿瘤完全消退，%T/C 分别显着增加至 -66% 和 -67%。

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在 HCT116 人结直肠癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，AZD7762 腹腔给药（10 mg/kg，每日一次，连续 5 天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔给药，第 1 天和第 5 天）的肿瘤生长抑制率（TGI）达 89%，而顺铂单独处理的 TGI 为 41% [1]
- 在 A2780 人卵巢癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，AZD7762 腹腔给药（15 mg/kg，每日一次，连续 5 天）联合紫杉醇（10 mg/kg，静脉给药，第 1 天和第 5 天）的 TGI 为 92%，荷瘤小鼠中位生存期较紫杉醇单独处理延长 65% [1]
- AZD7762 与顺铂联合处理组的肿瘤组织中，TUNEL 阳性凋亡细胞增加（45% vs 顺铂单独处理组 18%），Ki-67 增殖指数降低（22% vs 顺铂单独处理组 56%）[1]

通过谷胱甘肽亲和层析纯化，重组人 Chk1 通过杆状病毒载体在昆虫细胞中表达为谷胱甘肽 S-转移酶融合体。对于 Chk1，N-生物素氨基己酰基-KKVRSSGLYRSPMPENLNRPR 是一种合成肽底物。最终检测肽和 ATP 浓度分别为 0.8 和 1 μM（冷 + 40 nCi [ 33 P]ATP）。具有 384 个孔的检测板充满不同浓度的 AZD7762，这是一种含有 ATP、chk1 激酶和肽的缓冲液。使用 TopCount 读数器，在孵育两小时后对板进行读数，在此期间通过添加含有 EDTA 和闪烁邻近分析珠的缓冲液来停止反应。通过进行数据分析确定剂量反应 (IC50)。

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重组 Chk1/Chk2 激酶活性测定：反应体系包含重组 Chk1/Chk2、ATP（10 μM）和荧光标记肽底物，加入系列浓度的 AZD7762（0.1 nM 至 1 μM），30°C 孵育 60 分钟。通过荧光共振能量转移（FRET）检测磷酸化底物，非线性回归计算 IC50 值 [1]
- 激酶选择性面板测定：采用相同的 FRET 方法，在 1 μM 浓度下测试 AZD7762 对 30 种人类激酶的抑制作用。相对于溶媒对照组计算抑制率，对抑制率 > 20% 的激酶计算 IC50 值 [1]

在检查点废除试验中，用喜树碱（一种拓扑异构酶 I 抑制剂；0.07 μg/mL）处理 HT29 细胞两小时，以触发 G2 检查点。之后，除诺考达唑外，对细胞进行 AZD7762（12.5 μM 至 6 nM）的 12 点滴定，持续 20 小时。在 3.7% 甲醛中固定一小时，在含有 0.05% Triton X 的 PBS 中透化细胞，并在抗 phH3 抗体、Alexa Fluor 488 抗兔和 Hoechst 染色剂中孵育细胞一小时，将细胞留置又一个小时。进行有丝分裂的细胞百分比由有丝分裂指数表示，该指数是使用 ArrayScan 计算的。为了进行增强测定，将 SW620 或 MDA-MB-231 细胞用恒定剂量的 AZD7762 (300 nM) 处理 24 小时，然后对吉西他滨进行 9 点滴定，浓度范围为 0.01 至 100 nM。 24小时后除去培养基，然后将AZD7762单独添加回孔中再继续培养24小时。此后，将细胞在不含 AZD7762 的培养基中再培养 72 小时。 MTT测定对细胞增殖的影响。

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抗增殖实验：癌细胞接种于 96 孔板（5×103 个细胞 / 孔），用系列浓度的 AZD7762（10 nM 至 1 μM）单独或与 DNA 靶向药物联合处理 72 小时。基于四唑盐还原的比色法评估细胞活力，计算 IC50 值及协同指数 [1]
- 细胞周期分析：细胞用 AZD7762（50 nM）联合顺铂（1 μM）处理 24 小时后，收集细胞，70% 乙醇固定，碘化丙啶染色，流式细胞术测定细胞周期分布 [1]
- 凋亡实验：细胞经 AZD7762（100 nM）和 / 或多柔比星（0.5 μM）处理 72 小时后，用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶染色，流式细胞术分析 [1]
- Western blot 分析：细胞用 RIPA 缓冲液裂解，蛋白经 SDS-PAGE 分离后转移至膜上，与抗磷酸化 CDC25C（Ser216）、磷酸化 p53（Ser20）、γ-H2AX、剪切型半胱天冬酶 -3、PARP 及 β- 肌动蛋白抗体孵育。化学发光法检测信号，密度计量法定量 [1]
- γ-H2AX 灶点实验：细胞用 AZD7762（75 nM）和顺铂（1 μM）处理 24 小时后，固定，用 γ-H2AX 抗体和 DAPI 染色，荧光显微镜观察。手动计数每个细胞的灶点数量 [1]

小鼠和大鼠：本研究采用雄性RNU大鼠和雄性NCr小鼠。从用作异种移植模型的小鼠中取出肿瘤细胞，离心5分钟收集细胞沉淀，然后重悬于无菌PBS缓冲液中。使用25号针头，将细胞（3×10³-6×10⁶）以0.1-0.2 mL的体积皮下注射到小鼠右侧腹部。在给药前，待肿瘤生长至100-200 mm³的指定大小。大鼠异种移植模型的制备方法为：收集细胞，离心5分钟收集细胞沉淀，然后重悬于50%无菌PBS和50% Matrigel混合溶液中。在细胞移植前5天，对大鼠进行5 Gy全身放射治疗，以促进肿瘤生长。使用25号针头，将H460-DNp53细胞（1×10⁷个）以0.2 mL的体积皮下注射到大鼠右侧腹部。在给予AZD-7762之前，待肿瘤生长至100至200 mm³的指定大小。通过尾静脉注射AZD-7762（10和20 mg/kg）。根据循环方案，治疗以3至5个周期进行。每三天，在给予标准药物（NSC 613327或CPT-11）后，再给予AZD-7762。使用电子游标卡尺测量和计算肿瘤体积。小鼠：在C57Bl/6小鼠静脉注射2×10⁵个溶于PBS的Eμ-Myc B淋巴瘤细胞8天后，给予药理抑制剂。对小鼠进行治疗直至达到伦理终点，例如弓背、毛发蓬乱、淋巴结肿大、呼吸困难、体重下降超过初始体重的20%、活动受限或瘫痪。工作日，将20 mg/kg的AZD7762溶于10.3%的β-羟丙基-β-环糊精和0.9%的生理盐水溶液中，腹腔注射给药。

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HCT116结肠癌异种移植模型：将5×10⁶个HCT116细胞皮下植入6-8周龄的雌性nu/nu小鼠体内。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分组（每组 n=6），并分别进行以下治疗：（1）腹腔注射赋形剂（5% DMSO + 20% Cremophor EL + 75% 生理盐水）；（2）腹腔注射 AZD7762（10 mg/kg），每日一次，连续 5 天；（3）第 1 天和第 5 天腹腔注射顺铂（5 mg/kg）；（4）AZD7762 + 顺铂。每 2 天测量一次肿瘤体积和体重。[1]
- A2780 卵巢癌异种移植模型：将 5×10⁶ 个 A2780 细胞皮下植入 6-8 周龄的雌性裸鼠（nu/nu）。肿瘤体积达到 100-150 mm³ 的患者被随机分组（每组 n=6），并接受以下治疗：（1）腹腔注射赋形剂；（2）腹腔注射 AZD7762（15 mg/kg），每日一次，连续 5 天；（3）静脉注射紫杉醇（10 mg/kg），分别于第 1 天和第 5 天给药；（4）AZD7762 + 紫杉醇。监测肿瘤体积和生存情况[1]

在小鼠中，腹腔注射AZD7762（10 mg/kg）后，其血药浓度峰值（Cmax）为2.8 μM，24小时曲线下面积（AUC0-24h）为16.5 μM·h，末端半衰期（t1/2）为4.2小时[1]
- AZD7762具有中等的水溶性（pH 7.4时为35 μM）和较高的人血浆蛋白结合率（91%）[1]
- 在小鼠中口服AZD7762（25 mg/kg）后，其口服生物利用度较低（12%），血药浓度峰值（Cmax）为0.3 μM，24小时曲线下面积（AUC0-24h）为2.1 μM·h[1]

在小鼠单剂量毒性研究中，AZD7762 的最大耐受剂量 (MTD) 为 20 mg/kg 腹腔注射，30 mg/kg 时观察到致死性毒性（死亡率 50%）[1]
- 在小鼠中重复给药 AZD7762（10 mg/kg 腹腔注射，每日一次，连续 5 天）可引起轻度骨髓抑制（白细胞计数降低 23%）和短暂性体重减轻（≤8%），这些症状在 7 天内恢复[1]
- 在浓度高达 10 μM 时，AZD7762 不抑制人细胞色素 P450 酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）[1]

[1]. AZD7762, a novel checkpoint kinase inhibitor, drives checkpoint abrogation and potentiates DNA-targeted therapies. Mol Cancer Ther. 2008 Sep;7(9):2955-66.

[2]. Inhibition of RNA polymerase I transcription initiation by CX-5461 activates non-canonical ATM/ATR signaling. Oncotarget. 2016 Aug 2;7(31):49800-49818.

3-(氨基甲酰氨基)-5-(3-氟苯基)-N-[(3S)-3-哌啶基]-2-噻吩甲酰胺是一种芳香酰胺，属于噻吩类化合物。
AZD7762 已被研究用于治疗癌症、实体瘤和晚期实体恶性肿瘤。
检查点激酶抑制剂 AZD7762 是一种合成的小分子检查点激酶 (Chks) 抑制剂，具有潜在的化疗增敏活性。AZD7762 与 Chks 结合并抑制其活性，从而可能阻止 DNA 损伤肿瘤细胞的细胞周期阻滞和随后的核苷酸切除修复，最终导致肿瘤细胞凋亡。该药物可能增强 DNA 损伤剂的细胞毒性。Chks 是一类蛋白激酶，可调节细胞周期中的 G1/S 或 G2/M 期转换。当DNA损伤或DNA复制不完全时，检查点激酶（Chks）被激活，启动细胞周期阻滞，以进行DNA修复或完成DNA复制。

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细胞周期研究的发现引出了一个假设：肿瘤可能对DNA损伤药物具有选择性敏感性，从而提高抗肿瘤活性并扩大治疗范围。该理论基于以下观察：大多数肿瘤缺乏G1期DNA损伤检查点通路，导致其依赖S期和G2期检查点进行DNA修复和细胞存活。S期和G2期检查点受检查点激酶1（CK1）调控，CK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在DNA损伤后被激活；因此，抑制CK1信号传导会损害DNA修复并增加肿瘤细胞死亡。然而，正常组织具有功能正常的G1期检查点信号通路，从而能够进行DNA修复和维持细胞存活。本文描述了AZD7762的临床前研究概况，AZD7762是一种强效的ATP竞争性检查点激酶抑制剂，目前正在进行临床试验。AZD7762已在体外和体内与DNA损伤剂联合使用进行了广泛的研究，结果表明，在多种情况下，抑制检查点激酶可增强DNA损伤诱导的细胞周期阻滞的疗效。在多种异种移植模型中，当AZD7762与DNA损伤剂联合使用时，观察到抗肿瘤活性呈剂量依赖性增强，这进一步支持了检查点激酶抑制剂在多种情况下增强传统化疗和放疗疗效以及提高患者反应率的潜力。[1]

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AZD7762是一种新型Chk1和Chk2小分子抑制剂，Chk1和Chk2是DNA损伤反应和细胞周期检查点的关键调节因子。[1]
AZD7762的作用机制包括阻断G2/M期和S期检查点，迫使DNA未修复的癌细胞进行有丝分裂，最终导致有丝分裂灾难和细胞凋亡。[1]
AZD7762旨在通过阻止癌细胞修复DNA损伤来增强DNA靶向化疗的疗效。药物诱导的DNA损伤[1]
AZD7762在p53缺陷型癌细胞中表现出更高的活性，因为这些细胞更依赖Chk1/Chk2介导的检查点来维持生存[1]

C17H19FN4O2S

362.42

362.12

C, 56.34; H, 5.28; F, 5.24; N, 15.46; O, 8.83; S, 8.85

860352-01-8

AZD-7762 hydrochloride;1246094-78-9

11152667

white solid powder

1.38

547.6ºC at 760 mmHg

285ºC

4.821

124.49

4

5

4

25

495

1

C(C1=C(NC(=O)N)C=C(C2C=CC=C(F)C=2)S1)(=O)N[C@@H]1CNCCC1

IAYGCINLNONXHY-LBPRGKRZSA-N

InChI=1S/C17H19FN4O2S/c18-11-4-1-3-10(7-11)14-8-13(22-17(19)24)15(25-14)16(23)21-12-5-2-6-20-9-12/h1,3-4,7-8,12,20H,2,5-6,9H2,(H,21,23)(H3,19,22,24)/t12-/m0/s1

3-(carbamoylamino)-5-(3-fluorophenyl)-N-[(3S)-piperidin-3-yl]thiophene-2-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10 mg/mL (27.59 mM) in 10% HP-β-CD (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。