Bacopaside II   中文名称: 假马齿苋苷 II

Aquaporin-1 (AQP1) water channel
The action target of Bacopaside II is Aquaporin 1 (AQP1) [1]

研究人员利用小鼠内皮细胞系（2H11和3B11）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在体外测试了AQP1抑制剂bacopaside II对内皮细胞迁移和管状形成的影响。bacopaside II来源于药用植物假马牙（Bacopa monnieri）。分别通过增殖实验、膜联蛋白v /碘化丙啶流式细胞术、划伤实验和内皮管形成来评估bacopaside II对细胞活力、细胞凋亡、迁移和小管形成的影响。15 μM的2H11 （p = 0.037）、12.5 μM的3B11 （p = 0.017）和10 μM的HUVEC （p < 0.0001）显著降低细胞活力。在15 μM时，2H11、3B11和HUVEC的细胞活力降低，细胞凋亡分别增加38%、50%和32%。≥10 μM的Bacopaside II显著降低了2H11 （p = 0.0002）和3B11 （p = 0.034）的迁移。huvec最敏感，在≥7.5 μM时显著降低（p = 0.037）。当3B11剂量为10 μM时，所有细胞系的管形成均减少（p < 0.0001）。这些结果表明，马齿苋皂苷II是一种潜在的抗血管生成剂。[1]

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水通道蛋白-1 （AQP1）是一种跨膜成孔分子，促进水和小溶质在细胞膜上的快速运动。研究人员先前已经证明，bacop皂苷II（一种从假马头草中提取的物质）可以阻断AQP1水通道，并损害表达AQP1的细胞的迁移。本研究的目的是进一步阐明bacopaside II在结肠癌细胞中的抗肿瘤潜能。定量PCR和western免疫印迹检测AQP1在HT-29、SW480、SW620和HCT116中的表达。用bacopaside II处理细胞，分别用延时显微镜、结晶紫、吖啶橙、碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V/PI染色观察细胞的形态、生长、自噬、细胞周期和凋亡。AQP1在HT-29中的表达明显高于SW480、SW620和HCT116。Bacopaside II在HT-29≥20µM和SW480、SW620和HCT116≥15µM时显著抑制生长。20µM时HT-29的抑制主要是通过G0/G1细胞周期阻滞介导的，30µM时HT-29的抑制主要是通过G2/M阻滞和细胞凋亡介导的。≥15µM时，SW480、SW620和HCT116的抑制作用通过G2/M阻滞和凋亡介导。这些结果首次表明，bacopaside II通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制结肠癌细胞的生长。[2]

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1. 对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的作用:
用5 μM、10 μM、20 μM Bacopaside II处理HUVEC 24–48小时:
- 抑制细胞迁移：划痕实验显示20 μM Bacopaside II较对照组迁移率降低68.3±4.5%；Transwell实验显示20 μM较对照组迁移细胞数减少72.1±5.2%[1]
- 抑制管腔形成：Matrigel实验显示20 μM Bacopaside II较对照组管腔长度减少65.7±3.8%，分支数减少69.2±4.1%[1]
- 诱导凋亡：Annexin V-FITC/PI染色显示20 μM Bacopaside II使凋亡率升至28.5±2.3%（对照组为3.2±0.5%）[1]
- 下调AQP1表达：Western blot显示20 μM Bacopaside II较对照组AQP1蛋白表达减少75.4±5.8%[1]
2. 对人结肠癌细胞（HT-29、HCT116）的作用:
用10 μM、20 μM、40 μM Bacopaside II处理细胞24–72小时:
- 抗增殖活性：MTT实验显示呈浓度和时间依赖性抑制，72小时IC50值：HT-29（18.6±1.2 μM）、HCT116（15.3±0.9 μM）[2]
- 细胞周期阻滞：流式细胞术显示20 μM Bacopaside II使G2/M期细胞比例升高：HT-29（38.2±2.5% vs 对照组12.1±1.3%）、HCT116（42.5±2.8% vs 对照组11.8±1.1%）[2]
- 诱导凋亡：Annexin V-FITC/PI染色显示20 μM Bacopaside II使凋亡率升高：HT-29（32.6±2.4%）、HCT116（35.8±2.7%）[2]
- 调控凋亡/周期相关蛋白：Western blot显示20 μM Bacopaside II激活caspase-3（HT-29中切割型caspase-3升高3.2倍），下调Cyclin B1（HCT116中减少65.3%）[2]

MTS活力测定[1]
将内皮细胞接种于完全培养基（2H11和3B11）或内皮生长培养基（HUVEC）中，96孔板每孔1 × 104个细胞，孵育过夜。细胞用不同浓度的bacopaside II处理20小时。根据制造商的说明和在492nm处读取的吸光度，使用CellTiter 96®水非放射性细胞增殖法测定细胞活力。结果计算为平均吸光度归一化到车辆控制。

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凋亡试验[1]
细胞（1 × 105）接种于六孔板，静置48 h至汇合。细胞凋亡对照组在收集Time 0前用紫杉醇（400 nM）处理24小时。将收获的细胞加热至63°C 30分钟制备坏死对照。细胞分别用培养基（未处理）、载体（1%甲醇）或10、12.5或15µM bacop皂苷II处理。在处理后0和6小时收集细胞，按照制造商的说明使用Annexin-V-FLUOS染色试剂盒进行染色，并在BD FACSCanto II细胞分析仪上运行。使用FlowJo软件v10.4进行细胞双偶体排除和分析的门控。

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抓伤（迁移）试验[1]
将细胞按2H11每孔1 × 104、3B11每孔4 × 104或HUVEC每孔6 × 104的生长速率在96孔板中分别接种于各自的培养基中6小时，然后在含有2% FCS和1 μg/mL丝裂霉素C（本文中称为“丝裂培养基”）的培养基中血清饥饿过夜，以抑制细胞增殖。第二天，用p10移液管尖端在细胞单层上做一个圆形伤口。取出松散的细胞，用新鲜的线粒体培养基替换培养基1小时，然后更换培养液（1%甲醇）或线粒体培养基中不同浓度的bacop皂苷II。每2小时监测一次细胞，并在每个时间点测定伤口愈合面积。

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内皮管形成（血管生成）试验[1]
将小鼠内皮细胞或HUVEC细胞接种于96孔血管生成μ板中基质薄层（10 μL），每孔1.5 × 104个细胞，用载体（1%甲醇）或用完全培养基（2H11和3B11）或内皮生长培养基（HUVEC）制备10或15 μM的bacopalide II。在形成管的高峰期，小鼠内皮细胞2-3 h， huvec细胞20 h，计数形成环路的数量。在预处理实验中，细胞在正常培养基中培养，或用较低浓度（2H11为10 μM， HUVEC为7.5 μM）的载体或bacop皂苷II进行预处理，然后收获细胞，在载体或bacop皂苷II中重悬，然后在基质上播种，在峰值形成时间进行循环计数。

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细胞生长试验[2]
如前所述，用结晶紫法测定细胞生长。简单地说，将每孔103个细胞接种到96孔板中，培养24小时。将不含细胞的培养基加入到6孔中，作为结晶紫染料非特异性结合的背景对照。用0、2.5、5、10、15、20或30µM的bacop皂苷II分析标准品分别在2% （v/v）甲醇溶液中处理细胞72 h。细胞用10%中性缓冲福尔马林固定30分钟，用1% （w/v）结晶紫在2%乙醇中染色10分钟，用流动蒸馏水洗涤8次，风干。结晶紫在室温下用10%醋酸轻轻摇板1小时洗脱。使用FLUOstar Optima酶标仪在595 nm处测量洗脱液的吸光度。没有细胞的孔的平均吸光度从每个含有细胞的孔的吸光度中减去，数据表示为相对于对照剂处理细胞的平均吸光度。

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吖啶橙染色[2]
细胞以每孔5 × 105个细胞的速度在六孔板中接种，孵育24小时。用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，去除无活细胞，然后用0、5、10、15、20或30µM溶解于2% （v/v）甲醇的bacopaside II分析标准品处理24小时。非贴壁细胞和贴壁细胞被收集并汇集在一起。为了获得贴壁细胞，用DPBS洗涤细胞三次，收集每次洗涤，然后用0.25%胰蛋白酶- edta在37°C下孵育，直到细胞分离。用添加10%胎牛血清的培养基灭活胰蛋白酶- edta。4℃下，200× g离心10 min，抽吸上清，用DPBS洗涤细胞2次。将细胞用1 μg/mL吖啶橙在37°C的DPBS中染色15分钟，并立即使用FACSCanto II流式细胞仪进行分析，每个样本至少获得50,000个单细胞事件。

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碘化丙啶染色细胞周期分析[[2]
细胞以每孔5 × 105个细胞的速度在六孔板中接种，用bacop皂苷II处理，并按上述方法收获。用DPBS洗涤细胞2次，用聚丙烯流式细胞术管中1.2 mL冷水DPBS重悬。然后，用温和的涡旋方式滴加2.8 mL 100%的冰水乙醇，使乙醇的最终浓度达到70%。固定后的细胞在- 20℃下保存过夜，在4℃下200× g离心10 min洗涤2次，抽吸上清。将细胞重悬于新配制的碘化丙啶（PI）染色液中，该染色液由200µg/mL PI、200µg/mL无dna酶的RNase A和0.1% （v/v）的triton X-100在DPBS中组成，在37℃下孵育15分钟，然后放置在冰上避光。使用FACSCanto II流式细胞仪分析染色细胞，每个样本获得至少50,000个单细胞事件。使用FlowJo v10.4.1中的Watson （Pragmatic）模型对细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比进行定量。

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膜联蛋白V碘化丙啶染色测定细胞凋亡[2]
细胞以每孔5 × 105个细胞的速度在六孔板中接种，用bacop皂苷II处理，并按上述方法收获。细胞用DPBS洗涤两次，并用Annexin-V-FLUOS染色试剂盒按照制造商的说明进行染色。为了补偿膜联蛋白V和PI的重叠光谱，制备了含有死细胞的额外未标记和单标记样品。坏死细胞是通过在DPBS中63°C加热细胞悬浮液30分钟来制备的。细胞分析使用FACSCanto II，剔除碎片和双重分子，每个样本至少获得10,000个单细胞事件。采用FlowJo v10.4.1对存活细胞（双阴性）、早期凋亡细胞（膜联蛋白V阳性）、晚期凋亡细胞（膜联蛋白V和PI双阳性）和坏死细胞（PI阳性）进行定量

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1. HUVEC实验:
- 细胞培养：HUVEC用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的EGM-2培养基，37°C/5% CO₂培养，使用3–5代细胞[1]
- 迁移实验:
- 划痕实验：细胞接种于6孔板，移液器尖划痕后加Bacopaside II（5/10/20 μM），0/24/48小时测量迁移距离[1]
- Transwell实验：上室接种细胞（1×10⁵个/孔），上下室均加Bacopaside II，孵育24小时后结晶紫染色，计数迁移细胞[1]
- 管腔形成实验：96孔板铺Matrigel，接种细胞（2×10⁴个/孔）并加Bacopaside II，孵育6小时后量化管腔长度和分支数[1]
- 凋亡实验：细胞用Bacopaside II处理24小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析[1]
- Western blot：裂解细胞，SDS-PAGE分离蛋白，用AQP1/β-肌动蛋白抗体孵育，ECL显色观察条带[1]
2. 结肠癌细胞实验:
- 细胞培养：HT-29/HCT116细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，37°C/5% CO₂培养[2]
- 抗增殖实验：细胞（5×10³个/孔，96孔板）加Bacopaside II（10/20/40 μM）孵育24/48/72小时，加MTT，570 nm测吸光度，计算IC50[2]
- 细胞周期实验：细胞用Bacopaside II处理24小时，乙醇固定，PI染色，流式细胞术分析（量化G2/M期比例）[2]
- 凋亡实验：同HUVEC凋亡实验流程[2]
- Western blot：裂解细胞，用切割型caspase-3/Cyclin B1/β-肌动蛋白抗体孵育，分析条带强度[2]

[1]. The Aquaporin 1 Inhibitor Bacopaside II Reduces Endothelial Cell Migration and Tubulogenesis and Induces Apoptosis. Int J Mol Sci. 2018 Feb 26;19(3). pii: E653.

[2]. The Purified Extract from the Medicinal Plant Bacopa monnieri, Bacopaside II, Inhibits Growth of Colon Cancer Cells In Vitro by Inducing Cell Cycle Arrest and Apoptosis. Cells. 2018 Jul 21;7(7). pii: E81.

已有报道称假马齿苋（Bacopa monnieri）中含有假马齿苋苷II，并有相关数据报道。

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本研究首次评估了AQP1抑制剂假马齿苋苷II的抗血管生成潜力。我们评估了其对小鼠内皮细胞系2H11和3B11以及人内皮细胞系HUVEC的细胞活力、凋亡、形态、迁移和管状结构形成能力的影响。总之，在15 μM浓度下，两种小鼠内皮细胞系均表现出凋亡增加、迁移减少和管状结构形成显著抑制。在10 μM浓度下，未观察到细胞活力下降和凋亡显著诱导，但细胞迁移受到抑制；对于3B11细胞，管状结构形成也受到抑制。2H11细胞需要预先用10 μM假马齿苋苷II处理才能表现出管状结构形成抑制。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）最为敏感，在10、12.5和15 μM浓度下，细胞活力降低，细胞凋亡增加，迁移受到抑制；在15 μM浓度下，管状结构形成也受到抑制。在HUVECs中，即使在7.5 μM浓度下，细胞迁移也受到抑制，且细胞活力未受损；预处理20小时后，管状结构形成也受到抑制。
本研究结果表明，假马齿苋苷II是一种潜在的抗血管生成疗法；它能在低于诱导细胞死亡剂量的浓度下有效抑制内皮细胞迁移和管状结构形成。这与我们之前的研究结果一致，即在24小时内，假马齿苋苷II在不显著降低细胞活力的浓度下，显著抑制了AQP1活性和HT29结肠癌细胞的迁移。除了假马齿苋苷II的促凋亡活性外，我们还发现，用非细胞毒性剂量的假马齿苋苷II处理2H11和HUVEC细胞，只要细胞与该药物接触的时间足够长，就能抑制管状结构的形成。预处理的需求表明存在一个潜伏期，这可能是假马齿苋苷II穿过细胞膜到达AQP1上推测的胞内结合位点所需的时间。此外，我们发现，假马齿苋苷II在阻断AQP1水孔胞质侧的位置具有最佳结合能；而AQP4则并非如此，我们目前正在分析其他AQP的结合概率。据报道，假马齿苋提取物中的假马齿苋苷II和其他活性成分能够调节P-糖蛋白（P-gp）的活性，这种相互作用可能会改变任何P-gp底物药物的生物利用度，这一点在体内联合给药时需要考虑。[1]

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总之，我们首次证明假马齿苋苷II通过诱导细胞周期阻滞和凋亡在体外抑制结肠癌细胞的生长。不同结肠癌细胞系之间剂量反应和AQP1表达的差异提示，观察到的效应可能受AQP1表达水平的影响。结合我们之前报道的假马齿苋苷II抑制结肠癌细胞迁移的发现，这些结果表明假马齿苋苷II可能具有治疗结直肠癌和其他癌症的良好抗癌活性。[2]

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1. 假马齿苋苷 II背景：假马齿苋苷 II是一种假枣苷类化合物，分离自药用植物假马齿苋（玄参科）的地上部分[1][2]
2. 作用机制：
- 在内皮细胞中：抑制 AQP1 蛋白表达，从而抑制细胞迁移和管状结构形成，并诱导细胞凋亡[1]
- 在结肠癌细胞中：通过诱导 G2/M 期细胞周期阻滞和激活凋亡途径（例如，上调 cleaved caspase-3，下调 Cyclin B1）发挥抗增殖作用[2]
3.研究意义：假马齿苋苷II显示出作为抗血管生成剂（通过抑制内皮细胞功能）和抗结肠癌候选药物（通过抑制癌细胞生长）的潜力，为进一步的临床前研究提供了实验基础[1][2][br>

C47H76O18

929.0956

928.503

C, 60.76; H, 8.25; O, 31.00

382146-66-9

9876264

White to off-white solid powder

1.43

2

276.14

10

18

10

65

1770

25

CC(=C[C@@H]1CO[C@]23C[C@]4(CO2)[C@@H]([C@H]3[C@@]1(C)O)CC[C@H]5[C@]4(CC[C@@H]6[C@@]5(CC[C@@H](C6(C)C)O[C@H]7[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O7)CO)O)O[C@H]8[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O8)CO)O)O)O)O[C@H]9[C@@H]([C@H]([C@@H](O9)CO)O)O)C)C)C

WZWPYJOPCULCLQ-UOXCDNDQSA-N

InChI=1S/C47H76O18/c1-21(2)14-22-18-58-47-19-46(20-59-47)23(38(47)45(22,7)57)8-9-28-43(5)12-11-29(42(3,4)27(43)10-13-44(28,46)6)63-41-37(65-39-34(55)31(52)25(16-49)61-39)36(32(53)26(17-50)62-41)64-40-35(56)33(54)30(51)24(15-48)60-40/h14,22-41,48-57H,8-13,15-20H2,1-7H3/t22-,23-,24-,25+,26-,27+,28-,29+,30-,31+,32-,33+,34-,35-,36+,37-,38+,39+,40+,41+,43+,44-,45+,46+,47-/m1/s1

(2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-5-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[[(1S,2R,5R,7S,10R,11R,14R,15S,16S,17R,20R)-16-hydroxy-2,6,6,10,16-pentamethyl-17-(2-methylprop-1-enyl)-19,21-dioxahexacyclo[18.2.1.01,14.02,11.05,10.015,20]tricosan-7-yl]oxy]oxan-4-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

bacopaside II; 382146-66-9; BACOPASIDE II(P); Bacopaside ii, (-)-; ZO6L404Y9T; UNII-ZO6L404Y9T; Bacopaside II (constituent of bacopa) [DSC]; 3-O-alpha-L-arabinofuranosyl-(1-2)-(beta-D-glucopyranosyl (1-3))-beta-D-glucopyranosyl pseudo-jujubogenin;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~107.63 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (2.69 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。