DHODH (dihydroorotate dehydrogenase)
Brequinar (BQR) is a potent inhibitor of cellular dihydroorotate dehydrogenase (DHODH), the fourth enzyme and a rate-limiting step in the de novo pyrimidine biosynthetic pathway. [1]

Brequinar 的 EC50 为 17 nM，可将病毒后代的形成减少 90% 以上。此外，Brequinar (5 μM) 还可抑制其他正痘病毒并阻断病毒 DNA 复制。 Brequinar 对病毒周期的后期有很强的影响，尽管它对早期病毒基因的表达没有影响[1]。 Brequinar 在 CFI 测试中的 EC50 为 78 nM，以剂量依赖性方式降低包膜蛋白合成量和病毒滴度。 Brequinar (5 μM) 可防止病毒 RNA 的合成。 Brequinar 具有抗病毒作用，但嘧啶可以中和它。在细胞培养中，可以选择对布喹那具有抗性的病毒。 WT 和 NS5 突变体复制子的荧光素酶活性均被 Bequinar (5 μM) 抑制[2]。布喹那钠成功抑制了 PyNTP 的升高。 Brequinarodium 的 IC50 为 0.26 μM，可显着抑制细胞增殖。 Brequinarodium 抑制 p56lck 自磷酸化，IC50 为 70 μM； 25、50和100μM布喹那钠的相应抑制值为39%、41%和60%。此外，在 IC50 为 70 μM 时，贝奎那钠可防止 p56lck 对外源底物组蛋白 2B 的磷酸化；在 25、50、100 和 200 μM 时，抑制分别为 10%、43%、59% 和 86%。 Brequinar Brequinar钠的IC50为105 μM，在25、50、100和200 μM时分别抑制p59fyn的自磷酸化0、17、48和65%。此外，在 IC50 为 20 μM 时，Brequinarodium 抑制 p59fyn 对组蛋白 2B 的磷酸化；在 10、25、50、100 和 200 μM 时，相应的抑制率为 26、54、79、83 和 84%[3]。

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在BSC-40细胞中，布雷奎纳 (BQR) 对坎塔加洛病毒（CTGV，一种痘苗病毒毒株）表现出强效抗病毒活性。用0.5 µM BQR处理，在感染后24小时（hpi）可将感染性病毒子代产量降低>90%。抑制CTGV复制的半数有效浓度（EC50）计算为0.017 ± 0.05 µM。在BSC-40细胞中的半数细胞毒性浓度（CC50）>75 µM，选择性指数（CC50/EC50）>4410。 [1]
BQR（5 µM）的抗病毒活性延伸至其他正痘病毒，包括痘苗病毒毒株WR、IOC、Wyeth和牛痘病毒（CPXV），均能强烈抑制感染性颗粒的产生。 [1]
BQR 在感染前与纯化的CTGV颗粒孵育时，对病毒颗粒没有直接的杀灭作用。 [1]
在使用感染复数（MOI）为1和30 µM BQR的一步生长曲线分析中，感染性CTGV颗粒的产生从感染初期即被完全抑制。 [1] Western印迹分析显示，BQR（30 µM）不影响病毒早期蛋白F11的积累，但完全消除了CTGV结构（晚期）蛋白的积累。 [1]
使用在早期/晚期启动子控制下表达β-半乳糖苷酶的重组CTGV，BQR（30 µM）在6 hpi（早期）对报告基因活性影响最小，但在24 hpi（晚期）强烈抑制其活性，这与DNA合成抑制剂阿糖胞苷（Ara-C）的作用类似。 [1]
间接免疫荧光实验证实，在20 hpi时，经BQR处理的细胞中，晚期病毒蛋白（D8和结构蛋白）的表达受到严重抑制（约89.12%），并且细胞质中病毒工厂（virosomes）的形成也急剧减少（82.9%）。 [1] Slot-blot分析表明，BQR（30 µM）严重抑制了CTGV的DNA复制，而在未处理的细胞中，病毒DNA通常在6-8 hpi开始积累。 [1]
当感染细胞同时用30 µM BQR和100 µM或300 µM的外源性尿苷（URD，通过补救途径提供嘧啶）处理时，BQR对CTGV DNA复制、晚期蛋白表达和感染性子代产生的抗病毒作用可完全恢复到正常水平。 [1]

与未治疗的 BALB/c 小鼠相比，用 Brequinar 钠（10-20 mg/kg/天）治疗的小鼠的压积细胞体积百分比下降了 31%。在骨髓细胞中，布喹那钠可分别降低 UTP 和 CTP 水平 30% 和 25%。当尿苷（1000–2000 mg/kg/天）和贝奎那钠（10–20 mg/kg/天）一起服用时，可以避免贫血，并且血细胞比容水平保持在与之前相似的值（61-63%）。未经处理的对照[3]。

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在登革热 AG129 小鼠模型中，口服 Brequinar（3 mg/kg，每日两次）未显示任何疗效，可能与血浆中存在约 6 µM 的尿苷有关，后者可恢复病毒复制 [2]

将来自CTLL-4细胞或LSTRA细胞（5×106）的免疫沉淀的p59fyn或p56lck与PTK缓冲液（50mM HEPES（pH 7.4）、10mM MgCl2和10mM MnCl2）中的不同浓度的BQR在冰上预孵育10分钟。加入外源底物组蛋白2B（2μg），10分钟后，通过加入10μCi[γ-32P]ATP引发反应。在20°C下孵育10分钟后，将反应混合物在12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。激酶和外源底物的磷酸化通过放射自显影分析[3]。

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表达并纯化了 DENV-2 全长 NS5 蛋白（野生型和 E802Q 突变型），用于 RdRp 从头合成活性实验 [2]
将等量的野生型和突变型 NS5 蛋白与 DENV-2 亚基因组 RNA 模板在有无 Brequinar 的条件下孵育；RdRp 产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并定量 [2]
突变型 NS5（E802Q）的 RdRp 活性约为野生型的 2 倍 [2]

细胞内嘧啶核苷酸（PyN）可以由谷氨酰胺、CO2和ATP从头合成，也可以从预先形成的嘧啶核苷中回收。布雷奎纳钠（BQR）的抗增殖和免疫抑制活性被认为是由于抑制了二氢乳清酸脱氢酶的活性，从而抑制了从头嘧啶的合成。在这里，我们描述嘧啶核苷尿苷对BQR的抗增殖和免疫抑制活性的影响。尿苷逆转了Con A刺激的T细胞中PyN水平的体外降低和低浓度BQR（＜或＝65μM）对细胞增殖的抑制。然而，尿苷不能逆转高浓度BQR（>=65μM）的影响[2]。

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病毒产量减少实验： BSC-40细胞用1000个空斑形成单位（PFU）的CTGV感染2小时（吸附）。移除接种物后，细胞用不同浓度的布雷奎纳 (BQR)（0.005 µM 至 10 µM）或0.1% DMSO（对照）处理24小时。然后收集细胞，裂解，并通过在新鲜的BSC-40细胞单层上进行标准空斑试验测定裂解液中的病毒滴度。 [1]
杀病毒实验： 将纯化的CTGV颗粒（4 x 10^6 PFU/mL）与不同浓度的BQR（0.1, 1, 5 µM）或0.1% DMSO在室温下孵育1小时，不时摇晃。然后通过空斑试验测定混合物滴度，以确定药物是否直接灭活病毒颗粒。 [1]
细胞毒性实验（中性红摄取法）： BSC-40细胞接种于96孔板中，并与浓度范围为0.01 µM至75 µM的BQR孵育24小时。对照细胞接受0.1% DMSO。使用中性红摄取法评估细胞活力。活细胞摄取的染料用甲醇/乙酸溶液提取，并通过测量490 nm处的吸光度进行定量。 [1]
一步生长分析： BSC-40细胞用CTGV以MOI=1感染，并用30 µM BQR或0.1% DMSO处理。在感染后的不同时间点（3, 6, 8, 16, 18, 20, 24 h）收集细胞，并通过空斑试验进行病毒滴定以生成生长曲线。 [1]
Western印迹分析： BSC-40细胞用CTGV以MOI=1感染，并用30 µM BQR或0.1% DMSO处理。在一些实验中，同时加入尿苷（100 µM或300 µM）。在感染后的指定时间，将细胞收集在SDS样品缓冲液中。蛋白质通过SDS-PAGE（11.5%凝胶）分离，转印至硝酸纤维素膜上，并用特异性一抗（如兔抗VACV结构蛋白抗体、小鼠抗α-tubulin抗体、兔抗F11抗体）进行探测。使用适当的辣根过氧化物酶偶联二抗和增强化学发光法进行检测。 [1]
报告基因（β-半乳糖苷酶）活性测定： BSC-40细胞用重组CTGV-βGal（MOI=1）感染，并用0.1% DMSO、30 µM BQR或40 µg/mL Ara-C处理。在6和24 hpi时，将细胞在水中收集并裂解。通过添加底物O-硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷来测量β-半乳糖苷酶活性。显色后使用Na2CO3终止反应，并在420 nm处测量吸光度。 [1]
间接免疫荧光实验（IFA）： 生长在盖玻片上的BSC-40细胞用CTGV（MOI=1）感染，并用30 µM BQR或0.1% DMSO处理20小时。细胞用多聚甲醛固定，用Triton X-100透化，并进行封闭。然后用一抗（兔抗VACV结构蛋白抗体、小鼠抗D8抗体）孵育，随后用物种特异性荧光二抗孵育。细胞核和病毒DNA用DAPI染色。样品通过荧光显微镜分析。通过计数对感染细胞和病毒工厂进行定量。 [1]
病毒DNA复制分析（Slot-Blot）： BSC-40细胞用CTGV（MOI=1）感染，并用30 µM BQR处理，加或不加尿苷（100 µM或300 µM）。在感染后的不同时间点收集细胞。制备细胞提取物，使用slot-blot装置将DNA点样到尼龙膜上。膜与对应于痘苗病毒基因组HindIII D片段的32P标记DNA探针杂交。通过放射自显影检测病毒DNA积累，并通过光密度定量法进行定量。 [1]

方法 1：将 Brequinar 钠溶于 0.9% NaCl 溶液中进行腹腔注射，溶于蒸馏水中进行体外研究。[1]
方法 2：将 Brequinar 钠配制成 10 mg/mL 的生理盐水溶液。[2]
小鼠；15、25、50 mg/kg，腹腔注射
8 至 10 周龄的雌性 BALB/c 小鼠随机分组，未设盲。Molnupiravir 悬浮于玉米油和 10% DMSO 中，每日两次灌胃给药。Brequinar 悬浮于 10% DMSO 和无菌生理盐水中，每日一次腹腔注射给药。我们的药代动力学 (PK) 研究显示，Brequinar 的半衰期约为 10 小时，给药时间根据实验需要，分别在感染前 12 小时或感染后 24 小时开始。
小鼠通过腹腔注射 50 μl 盐酸赛拉嗪（每只小鼠 0.38 mg）和氯胺酮（每只小鼠 1.3 mg）的混合液进行麻醉，该混合液用 PBS 稀释。小鼠经鼻内接种 50 μl 含 1 × 10⁵ pfu SARS-CoV-2 β 变异株的病毒。感染当天以及感染后连续两天对小鼠进行称重；未观察到体重有显著变化。预防性给药在感染后2天进行，治疗性给药在感染后3天进行。每个治疗组和对照组各处死5只小鼠，收集肺组织，通过噬斑试验测定病毒滴度，并在4%多聚甲醛中固定24小时，然后切片，由UMSOM组织学核心实验室进行苏木精-伊红染色。对每只小鼠的苏木精-伊红染色切片进行盲法病理评分，并分析炎症情况。[5] 在登革热AG129小鼠模型中，每日两次口服给予Brequinar，剂量为3 mg/kg；未观察到疗效[2]。小鼠药代动力学研究表明，口服25 mg/kg剂量后，血浆最大浓度为231 µM，但由于血浆蛋白结合率高（99.06%），游离药物浓度仅为2.17 µM[2]。

药代动力学 (PK) 研究显示，布雷喹那的半衰期约为 10 小时。[5]

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小鼠口服 25 mg/kg 布雷喹那后，血浆峰浓度达到 231 µM。[2]
预测血浆蛋白结合率为 99.06%，导致游离药物浓度为 2.17 µM。[2]
接受布雷喹那治疗的小鼠血浆尿苷水平约为 6 µM，这可能抵消该药物在体内的抗病毒作用。[2]

通过24小时中性红摄取试验测定，Brequinar (BQR)在BSC-40细胞中的50%细胞毒性浓度(CC50) >75 µM。即使在测试的最高浓度(75 µM)下，细胞活力仍保持在80%左右。[1]

[1]. Potent antiviral activity of brequinar against the emerging Cantagalo virus in cell culture. Int J Antimicrob Agents. 2011 Nov;38(5):435-41.

[2]. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 2010 Sep;54(9):3686-95.

[3]. In vitro and in vivo mechanisms of action of the antiproliferative and immunosuppressive agent, brequinar sodium. J Immunol. 1998 Jan 15;160(2):846-53.

[4]. Bifunctional Naphtho[2,3-d][1,2,3]triazole-4,9-dione Compounds Exhibit Antitumor Effects In Vitro and In Vivo by Inhibiting Dihydroorotate Dehydrogenase and Inducing Reactive Oxygen Species Production. J Med Chem. 2020 Jun 4.

[5]. Pyrimidine inhibitors synergize with nucleoside analogues to block SARS-CoV-2. Nature. 2022 Apr;604(7904):134-140.

布雷喹那是一种喹啉单羧酸，其结构为喹啉，分别在2、3、4和6位被2'-氟[1,1'-联苯]-4-基、甲基、羧基和氟原子取代。它是二氢乳清酸脱氢酶的抑制剂，该酶是嘧啶从头合成所必需的。该化合物具有抗肿瘤和抗病毒活性。它是一种EC 1.3.5.2 [二氢乳清酸脱氢酶（醌）]抑制剂、免疫抑制剂、抗肿瘤药、抗病毒药、嘧啶合成抑制剂、抗冠状病毒药和抗代谢药。它属于联苯类、单氟苯类、喹啉单羧酸类和单羧酸类化合物。它是布雷喹那(1-)的共轭酸。
布雷喹那是一种具有抗肿瘤特性的合成喹啉羧酸类似物。布雷喹那抑制二氢乳清酸脱氢酶，从而阻断嘧啶从头合成。该药物还可能增强抗肿瘤药物（如5-氟尿嘧啶）的体内抗肿瘤作用。(NCI04)

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本研究评估了布雷喹那 (BQR) 对坎塔加洛病毒复制的抗病毒活性。BQR 是细胞二氢乳清酸脱氢酶（嘧啶从头合成途径中的一种酶）的强效抑制剂。在 0.5 μM BQR 存在下感染可使病毒子代产量降低 90% 以上，EC50（抑制 50% 病毒复制所需的药物浓度）为 0.017 μM。 BQR对其他正痘病毒的复制也具有类似的抑制作用。在药物存在的情况下，病毒早期蛋白的积累恢复至对照水平，而晚期基因表达则受到严重抑制。间接免疫荧光分析和病毒启动子控制下报告基因的时间调控表达分析证实了这一结果。两种分析均显示晚期基因表达受到近90%的抑制。BQR还阻断了病毒DNA复制，这解释了随后病毒晚期基因表达的抑制。当感染细胞同时用尿苷（URD）和BQR处理时，病毒DNA复制、晚期基因表达和感染性子代病毒的产生均恢复至对照水平。这些数据表明，BQR通过消耗细胞嘧啶池来靶向抑制病毒DNA合成，而当向细胞培养物中添加URD时，则可通过补救途径绕过这一抑制。 [1]

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布雷喹那是一种二氢乳清酸脱氢酶抑制剂，该酶是嘧啶从头合成所必需的。本文报道布雷喹那对多种病毒具有活性。该化合物不仅抑制黄病毒（登革病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒和波瓦桑病毒），还能抑制正链RNA甲病毒（西部马脑炎病毒）和负链RNA弹状病毒（水疱性口炎病毒）。以登革病毒2型（DENV-2）为模型，我们发现布雷喹那主要在RNA合成阶段抑制病毒感染周期。在培养基中添加嘧啶（胞苷或尿苷）而非嘌呤（腺嘌呤或鸟嘌呤）可以逆转该化合物的抑制作用。在含有布雷喹那的培养基中连续培养DENV-2，可产生对该抑制剂部分耐药的病毒。对这些耐药病毒进行测序，发现两个氨基酸突变：一个突变（M260V）位于病毒包膜蛋白II结构域的一个螺旋上，另一个突变（E802Q）位于非结构蛋白5（NS5）聚合酶结构域的引物环上。功能分析表明，NS5突变通过增强聚合酶活性发挥耐药性。包膜蛋白突变降低了病毒颗粒的组装/释放效率；然而，突变病毒在病毒颗粒组装/释放步骤中对布雷喹那的抑制作用敏感性降低。综上所述，结果表明：（i）布雷喹那通过耗竭细胞内嘧啶池阻断DENV RNA合成；（ii）该化合物也可能通过抑制病毒颗粒的组装/释放发挥其抗病毒活性。 [2]

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细胞内嘧啶核苷酸 (PyN) 可由谷氨酰胺、CO2 和 ATP 从头合成，也可由预先形成的嘧啶核苷回收利用。布雷喹那钠 (BQR) 的抗增殖和免疫抑制活性被认为是由其抑制二氢乳清酸脱氢酶活性所致，从而抑制嘧啶的从头合成。本文描述了嘧啶核苷尿苷对 BQR 抗增殖和免疫抑制活性的影响。体外实验表明，低浓度 BQR (≤65 μM) 可降低 Con A 刺激的 T 细胞中 PyN 的水平并抑制细胞增殖，而尿苷可以逆转这些作用。然而，尿苷无法逆转高浓度 BQR (≥65 μM) 的作用。 BQR诱导BALB/c小鼠贫血的能力可通过同时给予尿苷来抑制。相反，相同剂量的尿苷对BQR的免疫抑制活性没有影响。BQR处理的小鼠骨髓中PyN水平降低，而脾脏中PyN水平未受影响。这些观察结果表明，BQR诱导贫血是由于骨髓造血干细胞内PyN的耗竭所致。它们还提示，BQR的免疫抑制机制可能仅轻微依赖于外周淋巴细胞内PyN的耗竭。我们报道了BQR的一种新活性：抑制酪氨酸磷酸化，并推测其免疫抑制活性可能部分归因于BQR抑制淋巴细胞酪氨酸磷酸化的这种意想不到的能力。 [3]

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布雷喹那 (BQR) 是一种免疫抑制剂和抗增殖药物，已用于移植治疗。[1]
其抗 CTGV 病毒的机制归因于通过阻断二氢乳清酸脱氢酶 (DHODH) 抑制细胞从头合成嘧啶，从而导致病毒 DNA 合成所需的细胞内嘧啶池耗竭。当提供外源性尿苷（嘧啶补救途径的前体）时，其抗病毒作用完全逆转，这支持了上述机制。[1]
该研究表明，由于 CTGV 皮肤病变具有局部性，BQR 可考虑作为局部抗病毒疗法进行未来评估，从而可能避免全身免疫抑制作用。[1]

C23H15F2NO2

375.3675

375.107

C, 73.59; H, 4.03; F, 10.12; N, 3.73; O, 8.52

96187-53-0

Brequinar sodium;96201-88-6

57030

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

550.9±50.0 °C at 760 mmHg

317 °C

287.0±30.1 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.645

6.69

50.19

1

5

3

28

551

0

O=C(C1=C(C)C(C2=CC=C(C3=CC=CC=C3F)C=C2)=NC4=CC=C(F)C=C14)O

PHEZJEYUWHETKO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H15F2NO2/c1-13-21(23(27)28)18-12-16(24)10-11-20(18)26-22(13)15-8-6-14(7-9-15)17-4-2-3-5-19(17)25/h2-12H,1H3,(H,27,28)

6-fluoro-2-(2'-fluoro-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-3-methylquinoline-4-carboxylic acid

Brequinar; Bipenquinate; DUP 785; NSC368390; DUP785; DUP-785; NSC 368390; DUP785; 6-Fluoro-2-(2'-fluoro-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-3-methylquinoline-4-carboxylic acid; Brequinar [INN]; brequinarum; 6-fluoro-2-[4-(2-fluorophenyl)phenyl]-3-methylquinoline-4-carboxylic acid; Biphenquinate; 6-fluoro-2-(2'-fluorobiphenyl-4-yl)-3-methylquinoline-4-carboxylic acid; NSC-368390;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~25 mg/mL (~66.60 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (5.54 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.54 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。