Cathepsin B; neuroprotective, anti-cancer, and anti-inflamatory
CA074-me is a membrane-permeable methyl ester of CA074, a selective and widely-used inhibitor of cathepsin-B. It irreversibly inhibits cathepsin-B by forming a covalent complex, and its activity may not recover until new cathepsin-B is synthesized and processed, approximately 16 hours later [1].
The study suggests that CA074-me may have indirect neuroprotective effects beyond cathepsin-B inhibition, including maintaining lysosomal membrane integrity, protecting against lysosomal rupture, maintaining energy balance (NAD+ levels), enhancing heat shock protein 70 (Hsp70) expression, and inhibiting receptor-interacting protein 3 (RIP3) overexpression and nuclear translocation [1].

CA-074Me（5 μM 和 50 μM）可抑制 C57BL/6J 和 NOD/ShiLtJ 小鼠骨髓单核细胞 (BMM) 中 RANKL 诱导的破骨细胞生成。体外实验表明，CA-074Me 的抗破骨细胞活性在 RANKL 刺激后 24 小时即可观察到。值得注意的是，这种作用并非通过 MAPK-ERK 信号通路介导。CA-074Me 还可抑制钠诱导的 NFATc1 自身增强和 RANKL 刺激的 c-FOS 上调 [2]。 CVB1诱导的细胞植入可被CA-074Me抑制[3]。在原代培养的海马神经元中，经受2小时的氧糖剥夺（OGD）后，预先用CA074-me（1 µg）处理可抑制溶酶体pH值的升高以及溶酶体染料LysoSensor Green DND-153从溶酶体中的泄漏，该抑制作用在OGD后22小时观察到。这表明CA074-me有助于在OGD损伤后维持溶酶体的功能和完整性[1]。

治疗前后，CA074-me（1 μg、10 μg）均能保护海马CA1神经元免受全脑缺血/再灌注（I/R）损伤诱导的程序性甲苯损伤。CA074-me显著抑制了组织蛋白酶B的渗漏和溶酶体膜的破裂。除了抑制RIP3的过度表达和核转位外，CA074-me还能增加I/R损伤后Hsp70的表达并降低NAD+水平[1]。与CVB+None组相比，接受CA-074Me（4 mg/kg/天，肌注）的豚鼠组的中枢评分显著更高。30 mg/kg剂量可预防骨质疏松和破骨细胞生成[2]。在CVB+CA-074Me组中，CD8+ T细胞数量少于假手术组[3]。

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在全脑缺血/再灌注（I/R）损伤大鼠模型（20分钟四血管闭塞）中，缺血前1小时脑室内（icv）注射CA074-me（1 µg或10 µg）可显著保护海马CA1神经元免受延迟性程序性坏死。再灌注后7天，神经元存活率从I/R组的7.7 ± 2.7%增加到1 µg组的85.6 ± 4.1%和10 µg组的87.1 ± 4.6%。该保护作用具有长期性，1 µg 组 30 天存活率为 84.5 ± 3.2% [1]。
再灌注后 1 小时给予 CA074-me (1 µg) 进行后处理也有效，7 天时神经元存活率为 77.1 ± 8.3%，表明其治疗窗口期较长 [1]。
免疫荧光研究表明，CA074-me 预处理可抑制再灌注后 2-3 天海马 CA1 神经元中溶酶体破裂以及组织蛋白酶 B 和 LAMP-1（一种溶酶体膜蛋白）的弥散性胞质释放，这与 I/R 组观察到的现象一致 [1]。
CA074-me 预处理可防止 24 小时内海马中 NAD+ 水平的降低。再灌注后，表明其在维持能量平衡中发挥作用[1]。
蛋白质印迹分析显示，与缺血/再灌注组相比，CA074-me预处理进一步增强了再灌注后1、2和3天海马中热休克蛋白70 (Hsp70)的表达上调[1]。
免疫荧光结果也表明，CA074-me预处理抑制了再灌注后2-3天海马CA1神经元中受体相互作用蛋白3 (RIP3)的过表达和核转位[1]。

氧糖剥夺 (OGD) 和 DND-153 染色[1]
OGD 在无葡萄糖的脱氧缓冲液中进行，置于 OGD 室中，95% N₂ 和 5% CO₂ 的混合气体环境，37 °C 下处理 2 小时。假手术组置于含有 25 mM 葡萄糖的类似缓冲液中，并在培养箱中孵育 2 小时。CA074-me 组在 OGD 处理前 1 小时，先在含有 1 μg CA074-me 的培养基中孵育。OGD 损伤 22 小时后，通过 LysoSensor Green DND-153 染色评估海马神经元溶酶体 pH 值的变化。将细胞在含有 1 μM LysoSensor Green DND-153 的培养基中孵育 60 分钟，然后用培养基洗涤数次。然后，在倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察组织。

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抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 检测[2]
TRAP 检测使用酸性磷酸酶染色试剂盒，并按照制造商的说明进行。细胞培养和破骨细胞生成7天后，移除培养基，并用PBS洗涤3次。使用制造商提供的固定液固定骨髓巨噬细胞 (BMM)。将细胞在37°C下与含有去离子水、Fast Garnet GBC、萘酚磷酸盐、乙酸盐和酒石酸盐的溶液孵育1小时。移除染色液，用PBS洗涤3次，并风干。使用光学显微镜[2]计数整个培养区域内具有三个或更多细胞核的TRAP阳性细胞，作为多核破骨细胞。
颅骨组织切片的TRAP染色也以类似方式进行。将载玻片用PBS缓冲液洗涤3次，然后在含有去离子水、Fast Garnet GBC、萘酚磷酸盐、乙酸盐和酒石酸盐（来自TRAP检测试剂盒）的溶液中于37℃孵育1小时。之后，将载玻片再次用PBS缓冲液洗涤3次，风干，并用水性封片剂封片。在颅骨缝合区，使用光学显微镜计数具有三个或更多细胞核的TRAP阳性细胞，并将其判定为多核破骨细胞。

免疫印迹分析[2]
将细胞以 0.2 × 10⁶ 个细胞/孔的密度接种于 6 孔板中，培养条件与“小鼠骨髓巨噬细胞的分离、培养和破骨细胞形成”部分相同。用 RANKL 和/或 CA074-me 刺激细胞，并用冰冷的 PBS 洗涤两次。用 RIPA 裂解缓冲液收集细胞并进行超声处理。取 20 μg 蛋白裂解液进行 8% SDS-PAGE 电泳分离，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。将膜用含 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲盐溶液（TBST）（25 mM Tris/HCl，pH 7.6，150 mM NaCl，0.1% Tween-20）在室温下封闭 1 小时，然后与一抗（包括 NFATc1、pERK1/2、ERK1/2、c-FOS 和 GAPDH（Cell Signaling））在 44°C 下孵育过夜。42 随后用 TBST 洗涤膜（3 次，每次 10 分钟），并与辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的二抗孵育 30 分钟。使用商业化的 HRP 检测试剂显色。

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免疫细胞化学[2]
将 BMM 细胞培养于 8 孔载玻片上，培养基为添加了 30 ng/ml M-CSF 的 MEMα 培养基，培养三天。随后，用 30 ng/ml M-CSF、50 ng/ml RANKL 刺激 BMMs，并分别加入或不加入 50 μM CA074-me，处理 15 分钟。细胞用 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，用 0.1% Triton-100 透化，然后用 NF-κB p65 一抗（Abcam）染色。二抗为 Alexa Fluor 488 标记的兔抗鼠 IgG。

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从胚胎第 18 天的大鼠中分离海马神经元，并在 Neurobasal 培养基中培养。对于氧糖剥夺 (OGD) 处理，将细胞置于 OGD 室中，在 37°C 下用 95% N₂ 和 5% CO₂ 的无葡萄糖脱氧缓冲液处理 2 小时。在 OGD 处理前 1 小时，将 CA074-me 组细胞置于含有 1 µg CA074-me 的培养基中孵育。为了评估溶酶体 pH 值的变化，在 OGD 处理 22 小时后，将细胞与 1 µM LysoSensor Green DND-153 孵育 60 分钟，然后洗涤并在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。测量荧光积分光密度 (IOD) 以量化变化 [1]。

体内RANKL诱导破骨细胞生成[2]
所有动物实验均按照IACUC批准的方案进行。根据制造商的说明，将RANKL（0.08 mg/kg）与CA074-me（10 mg/kg或30 mg/kg）混合于无菌、无免疫原性的1% Extracel-HP凝胶中。该凝胶由硫醇修饰的透明质酸钠、硫醇修饰的肝素、硫醇修饰的明胶和脱气去离子无菌水组成。在无菌操作台中，使用无菌注射器制备水凝胶混合物。对照组水凝胶为无菌磷酸盐缓冲液（PBS），不含任何细胞因子。骨溶解组小鼠被注射0.08 mg/kg RANKL水凝胶以诱导病理性骨丢失，具体方法见先前发表的文献^{6, 16}。将水凝胶混合物、水凝胶-RANKL混合物和水凝胶-RANKL-CA-074Me混合物在无菌操作台上注射到8周龄雄性小鼠颅骨内（n = 5），小鼠在全身麻醉（80 mg/kg氯胺酮和7 mg/kg赛拉嗪）后进行注射。4天后，取出颅骨，用4%甲醛固定24小时，用20% EDTA脱钙1周，然后从石蜡包埋块中切片。切片经抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色（参见“抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 检测”部分）以鉴定破骨细胞。

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脑叶缺血/再灌注损伤模型和药物给药[1]
采用我们之前研究中描述的四血管闭塞 (4-VO) 方法建立全脑缺血模型（Wang 等，2011），并稍作修改。在 4% (w/v) 水合氯醛 (400 mg/kg) 麻醉下，对双侧椎动脉进行永久性电凝，并将双侧颈总动脉 (CCA) 从周围组织中分离出来。缝合手术切口后，大鼠恢复 24 小时。次日，使用4%异氟烷进行麻醉诱导，并用动脉瘤夹闭颈总动脉（CCA）20分钟以诱导全脑缺血，然后移除动脉瘤夹进行再灌注。整个手术过程中，直肠温度维持在37 ± 0.5 °C。将大鼠转移至动物培养箱中以保持适宜温度，直至完全苏醒。选择瞳孔散大且无癫痫发作的大鼠进行实验。[2]
CA074-me溶解于含2% DMSO的0.9% NaCl溶液中，浓度为0.2 μg/μl或2 μg/μl。在缺血前 1 小时或再灌注后 1 小时，将 CA074-me（0.2 μg/μl 或 2 μg/μl）或载体（2% DMSO）以 0.5 μl/min 的速度注入右侧脑室（前后 -0.92；内外 1.5；背腹 3.5 mm），总体积为 5 μl。大鼠被分为 5 组：I/R 组接受 5 μl 载体；三个CA074-me组接受与I/R组相同的操作，分别在缺血20分钟前1小时接受1 μg CA074-me（CA074-me 1 μg）或10 μg CA074-me（CA074-me 10 μg），并在再灌注后1小时接受1 μg CA074-me（Post CA074-me 1 μg）；假手术组接受与I/R组相同的操作，但不进行颈总动脉闭塞。

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使用了32只雌性短毛豚鼠（体重：154±18 g，年龄：4周龄）。如前所述¹⁶，通过注射柯萨奇病毒B1 (CVB1) 建立肺结核动物模型。简而言之，本研究包括四个实验组（每组8只豚鼠）：（A）假手术组：注射生理盐水；（B）CVB1+无处理组：注射CVB1+弗氏完全佐剂（FCA）；（C）CVB1+生理盐水组（假干预组）：注射CVB1+FCA+生理盐水（NS）；（D）CVB1+CA074-me组：注射CVB1+FCA+CA074-me。在注射CVB1 24小时后，连续7天给予CA074-me（4 mg/kg/天，肌肉注射）。注射CVB1四周后，处死动物，收集肺组织用于后续实验^[3]。本研究使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（280-350 g）。采用四血管闭塞（4-VO）法诱导全脑缺血。在麻醉下，对双侧椎动脉进行永久性电凝闭塞。次日，用动脉瘤夹闭双侧颈总动脉20分钟以诱导缺血，随后移除动脉瘤夹进行再灌注。CA074-me溶解于含2% DMSO的0.9% NaCl溶液中，配制成浓度为0.2 µg/µl或2 µg/µl的溶液。在缺血前1小时或再灌注后1小时，将5 µl溶液（含1 µg或10 µg CA074-me）或溶剂（2% DMSO）以0.5 µl/min的速率注入右侧脑室（坐标：前后方向-0.92 mm；内外方向1.5 mm；背腹方向3.5 mm，以bregma为参考点）[1]。

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本研究使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（280-350 g）。采用四血管闭塞（4-VO）法诱导全脑缺血。在麻醉状态下，对双侧椎动脉进行永久性电凝结扎。次日，双侧颈总动脉均用动脉瘤夹闭20分钟以诱导缺血，随后移除动脉瘤夹进行再灌注。CA074-me溶解于含2% DMSO的0.9% NaCl溶液中，浓度分别为0.2 µg/µl或2 µg/µl。缺血前1小时或再灌注后1小时，将5 µl溶液（含1 µg或10 µg CA074-me）或溶剂（2% DMSO）以0.5 µl/min的速率注入右侧脑室（坐标：前后方向-0.92 mm；内外方向1.5 mm；背腹方向3.5 mm，以bregma为参考点）[1]。

[1]. Protective mechanisms of CA074-me (other than cathepsin-B inhibition) against programmed necrosis induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Brain Res Bull. 2016 Jan;120:97-105.

[2]. CA-074Me compound inhibits osteoclastogenesis via suppression of the NFATc1 and c-FOS signaling pathways. J Orthop Res. 2015 Oct;33(10):1474-86.

[3]. Treatment with CA-074Me, a Cathepsin B inhibitor, reduces lung interstitial inflammation and fibrosis in a rat model of polymyositis. Lab Invest. 2015 Jan;95(1):65-77.

CA-074甲酯（CA-074Me）是一种细胞可渗透的组织蛋白酶B抑制剂。它由细胞酯酶转化为CA-074。大量研究表明，溶酶体在脑缺血性细胞死亡中发挥着关键作用，由此产生了“溶酶体中心”假说。该假说认为，溶酶体膜通透性（LMP）的改变或破裂是组织蛋白酶B释放的必要条件，而CA-074和CA-074Me等抑制剂可以阻止这一过程。然而，CA-074Me在神经元死亡中的作用及其对全脑缺血/再灌注（I/R）损伤后溶酶体膜完整性的影响尚不清楚，因此我们开展了这项研究。我们评估了大鼠在20分钟全脑I/R损伤后海马CA1区的神经元死亡情况。在缺血前1小时或再灌注后1小时，脑室内注射CA074-me（1 μg和10 μg）。检测热休克蛋白70 (Hsp70)、组织蛋白酶B、溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP-1)、受体相互作用蛋白3 (RIP3) 和溶酶体pH值的变化。CA074-me可预防全脑缺血/再灌注损伤引起的CA1区神经元程序性坏死，无论是在缺血/再灌注损伤之前还是之后。再灌注两天后，弥漫性胞质组织蛋白酶B和LAMP-1免疫染色与核固缩变化同时出现；氧糖剥夺(OGD)后，溶酶体pH值升高，并伴有溶酶体染料DND-153的渗漏。这两种变化均表明溶酶体膜破裂和组织蛋白酶B泄漏，而CA074-me预处理显著抑制了这些变化。CA074-me预处理还抑制了缺血/再灌注损伤后RIP3的过表达和核转位以及NAD(+)水平的下降，同时增强了Hsp70的上调。溶酶体破裂导致的组织蛋白酶B延迟爆发性泄漏是20分钟全脑缺血/再灌注损伤诱导的程序性神经元坏死的关键有害因素。除了作为组织蛋白酶B的抑制剂外，CA074-me还可能通过维持溶酶体膜的完整性和防止溶酶体破裂而发挥间接的神经保护作用。[1]破骨细胞是骨吸收过程中不可或缺的细胞。由于溶骨性疾病的发生与破骨细胞的功能和异常密切相关，因此了解破骨细胞生物学对于设计抑制溶骨性疾病的新疗法至关重要。溶酶体蛋白酶（如组织蛋白酶）的鉴定和研究揭示了骨吸收的机制。例如，组织蛋白酶K已被证实是由成熟破骨细胞产生的一种胶原降解蛋白酶，并在酸性破骨细胞吸收陷窝中具有高活性。深入研究组织蛋白酶和其他破骨细胞相关化合物的作用机制，为破骨细胞生物学研究提供了新的靶点。通过对抑制破骨细胞生成化合物的筛选实验，我们发现了一种组织蛋白酶B抑制剂CA-074的修饰版本：细胞膜可渗透的CA-074Me（L-3-反式-(丙基氨基甲酰基)环氧乙烷-2-羰基]-L-异亮氨酰-L-脯氨酸甲酯）。本研究证实，CA-074Me在体内和体外均以剂量依赖的方式抑制破骨细胞生成。然而，在组织蛋白酶B敲除小鼠中，破骨细胞生成未受影响，提示其作用机制可能比单纯抑制组织蛋白酶B更为复杂。我们发现，CA-074Me在破骨细胞生成刺激后24小时内即可发挥其破骨细胞生成抑制作用，其机制是通过抑制c-FOS和NFATc1通路。[2] 组织蛋白酶B (CB)参与蛋白质周转，并在维持正常细胞代谢中发挥多种作用。我们最近的研究发现，CB在多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)患者的肌肉中表达升高。然而，CB在间质性肺病(ILD)中的作用尚未见报道。间质性肺病(ILD)是多发性肌炎/糖尿病(PM/DM)的常见并发症，也是PM/DM患者的主要死因之一。间质性肺病（ILD）是一种高发病率和高死亡率的结缔组织疾病，其特征是炎症细胞因子过度产生和诱导纤维化，最终导致呼吸衰竭。ILD的病因和发病机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨使用CB特异性抑制剂CA-074Me治疗是否能缓解多发性肌炎（PM）患者的ILD症状。我们分析了PM/DM患者肺组织中CB的表达、炎症和纤维化情况。采用柯萨奇病毒B1（CVB1）诱导豚鼠PM动物模型。在CVB1注射后24小时，连续7天给予CA-074Me。实验结束时，处死动物并收集肺组织进行进一步分析。通过组织学检查、免疫组织化学分析、蛋白质印迹法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测炎症、纤维化、凋亡细胞和细胞因子。在多发性肺病/皮肌炎（PM/DM）患者中，肺组织中CB蛋白水平显著高于健康对照组，且与炎症和纤维化加重相关。同样，在柯萨奇病毒B1（CVB1）诱导的多发性肺病（PM）豚鼠模型中，肺组织中CB表达、炎症和纤维化、CD8+ T细胞、CD68+细胞、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1浸润以及细胞凋亡均显著增加。CA-074Me的给药可减轻这些变化。总之，本研究表明，PM/DM可增加肺组织中CB的表达，而抑制CB可缓解CVB1诱导的PM豚鼠模型中的间质性肺病（ILD）。这一发现提示CB可能是ILD的潜在治疗靶点。[3]

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CA074-me是选择性组织蛋白酶B抑制剂CA074的膜渗透形式。其能够穿过细胞膜的特性使其适用于活细胞和体内研究[1]。
本研究提供的证据表明，CA074-me除了直接抑制组织蛋白酶B外，还具有神经保护作用。它似乎通过维持能量平衡（防止NAD+耗竭）、增强保护性蛋白Hsp70以及抑制促坏死蛋白RIP3来稳定溶酶体膜。这些联合作用可防止溶酶体破裂和组织蛋白酶B的失控释放，从而保护大脑免受全脑缺血/再灌注损伤引起的迟发性神经元程序性坏死[1]。

C19H30N2O6

382.45

397.221

C, 59.67; H, 7.91; N, 7.32; O, 25.10

147859-80-1

134448-10-5

6610318

White to off-white solid powder

0.694

117.34

2

6

10

28

611

5

O1[C@@]([H])(C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H])=O)[C@@]1([H])C(N([H])[C@]([H])(C(N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(=O)OC([H])([H])[H])=O)[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])=O

XGWSRLSPWIEMLQ-YTFOTSKYSA-N

InChI=1S/C19H31N3O6/c1-5-9-20-16(23)14-15(28-14)17(24)21-13(11(3)6-2)18(25)22-10-7-8-12(22)19(26)27-4/h11-15H,5-10H2,1-4H3,(H,20,23)(H,21,24)/t11-,12-,13-,14-,15-/m0/s1

methyl (2S)-1-[(2S,3S)-3-methyl-2-[[(2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate

Ca-074Me; Ca-074Me; CA-074 methyl ester; CA-074Me; Cathepsin B Inhibitor IV; methyl ((2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-prolinate; (S)-methyl 1-((2S,3S)-3-methyl-2-((2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carboxamido)pentanoyl)pyrrolidine-2-carboxylate; methyl (2S)-1-[(2S,3S)-3-methyl-2-[[(2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate; CA-074-Me; Ca-074Me

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~251.59 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。