Cathepsin B; neuroprotective, anti-cancer, and anti-inflamatory

CA-074Me（5 μM 和 50 μM）可抑制来自 C57BL/6J 和 NOD/ShiLtJ 小鼠的 BMM 细胞中 RANKL 诱导的破骨细胞生成。在体外 RANKL 刺激后 24 小时观察 CA-074Me 的抗破骨细胞活性。值得注意的是，这种影响不是由 MAPK-ERK 信号级联介导的。钠诱导的 NFATc1 自身增强和 RANKL 刺激的 c-FOS 上调均被 CA-074Me 抑制 [2]。 CA-074Me 会抑制 CVB1 诱导的细胞植入 [3]。

治疗前后，CA074-me（1 μg、10 μg）可保护海马 CA1 神经元免受全脑 I/R 损伤诱导的程序化甲苯的影响。 CA074-me 显着抑制组织蛋白酶-B 渗漏和溶酶体膜破裂。除了抑制 RIP3 的过度表达和核转位外，CA074-me 还可以增加 I/R 损伤后 Hsp70 的上调并降低 NAD+ 水平 [1]。与CVB+无组相比，接受CA-074Me（4mg/kg/天，肌肉注射）的豚鼠组具有显着更高的中心评分。 30 mg/kg）可防止骨质恶化和破骨细胞生成[2]。 CVB+CA-074Me组的CD8+T细胞比假手术组少[3]。

氧-葡萄糖剥夺（OGD）和ddn -153染色[1]
OGD在无葡萄糖脱氧缓冲介质中进行，在OGD室中，95% N2和5% CO2气氛，37℃下，OGD 2 h。假手术组放置在含有25 mM葡萄糖的类似缓冲液中，在培养箱中保存2 h。CA074-me组于OGD暴露前1 h，在含有1 μg CA074-me的培养基中孵育。采用LysoSensor Green DND-153染色观察OGD损伤22 h后海马神经元溶酶体pH的变化。细胞在含1 μM LysoSensor Green DND-153的培养基中孵育60分钟，并用该培养基洗涤数次。然后在倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察组织。

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抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）测定[2]
根据制造商的说明，使用酸性磷酸酶染色试剂盒进行TRAP检测。细胞培养和破骨细胞生成7天后，取出培养基并用PBS洗涤三次。用制造商提供的固定溶液固定mm。细胞在37℃下与含有去离子水、Fast Garnet GBC、磷酸萘酚、醋酸酯和酒石酸盐的溶液孵育1小时。取下染色液，用PBS（3倍）洗涤，风干。光镜下，整个培养区有三个或更多核的TRAP阳性细胞计数为多核破骨细胞[2].
颅组织切片的TRAP染色方法与此类似。用PBS（3倍）洗涤载玻片，并在含有去离子水、Fast Garnet GBC、磷酸萘酚、醋酸盐和酒石酸盐（TRAP试剂盒）的溶液中于37℃孵育1小时。载玻片用PBS（3倍）洗涤，风干，用水性贴载介质贴载。光镜下观察颅骨缝合区有3个或更多核的TRAP阳性细胞为多核破骨细胞。

免疫印迹分析[2]
细胞接种于6孔板，密度为0.2 × 106个/孔，培养条件与“小鼠骨髓巨噬细胞分离、培养和破骨细胞形成”章节相同。用RANKL和/或CA074-me刺激细胞，并用冷PBS洗涤2次。用RIPA裂解缓冲液收集细胞并进行超声处理。用8% SDS-PAGE分离20 μg蛋白裂解液，转移到硝化纤维素膜上。将膜用5%脱脂乳在含Tween-20的Tris- buffered Saline （TBST）中（25mM Tris/HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20）在室温下阻断1小时，然后与包括NFATc1， pERK1/2, ERK1/2， c-FOS和GAPDH （Cell Signaling）在内的一抗孵育过夜42然后用TBST（3倍洗涤10分钟）洗涤膜，用辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗孵育30分钟。使用商用酶标检测试剂将蛋白质可视化。

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免疫细胞化学[2]
在8室载玻片中，加入30 ng/ml M-CSF的MEMα培养基培养BMMs 3天。之后，分别用30 ng/ml M-CSF、50ng/ml RANKL，含或不含50 μM CA074-me刺激bmm 15 min。细胞固定在4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中，0.1% triton -100渗透，然后用NF-κB p65一抗（Abcam）染色。二抗选用Alexa Fluor 488兔抗小鼠IgG。

体内RANKL诱导破骨细胞生成[2]
所有动物实验均按照IACUC批准的方案进行。根据制造商的说明，将RANKL（0.08 mg/kg）与CA074-me（10 mg/kg或30 mg/kg）混合于无菌、无免疫原性的1% Extracel-HP凝胶中。该凝胶由硫醇修饰的透明质酸钠、硫醇修饰的肝素、硫醇修饰的明胶和脱气去离子无菌水组成。在无菌操作台中，使用无菌注射器制备水凝胶混合物。对照组水凝胶为无菌磷酸盐缓冲液（PBS），不含任何细胞因子。骨溶解组小鼠被注射0.08 mg/kg RANKL水凝胶以诱导病理性骨丢失，具体方法见先前发表的文献^{6, 16}。将水凝胶混合物、水凝胶-RANKL混合物和水凝胶-RANKL-CA-074Me混合物在无菌操作台上注射到8周龄雄性小鼠颅骨内（n = 5），小鼠在全身麻醉（80 mg/kg氯胺酮和7 mg/kg赛拉嗪）后进行注射。4天后，取出颅骨，用4%甲醛固定24小时，用20% EDTA脱钙1周，然后从石蜡包埋块中切片。切片经抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色（参见“抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 检测”部分）以鉴定破骨细胞。

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全脑缺血/再灌注损伤模型及药物给药[1]
采用我们之前研究中描述的四血管闭塞 (4-VO) 方法建立全脑缺血模型（Wang 等，2011），并稍作修改。在 4% (w/v) 水合氯醛 (400 mg/kg) 麻醉下，对双侧椎动脉进行永久性电凝，并将双侧颈总动脉 (CCA) 从周围组织中分离。缝合手术切口后，大鼠恢复 24 小时。次日，使用4%异氟烷进行麻醉诱导，并用动脉瘤夹闭颈总动脉（CCA）20分钟以诱导全脑缺血，然后移除动脉瘤夹进行再灌注。整个手术过程中，直肠温度维持在37 ± 0.5 °C。将大鼠转移至动物培养箱中以保持适宜温度，直至完全苏醒。选择瞳孔散大且无癫痫发作的大鼠进行实验。[2]
CA074-me溶解于含2% DMSO的0.9% NaCl溶液中，浓度为0.2 μg/μl或2 μg/μl。在缺血前 1 小时或再灌注后 1 小时，将 CA074-me（0.2 μg/μl 或 2 μg/μl）或载体（2% DMSO）以 0.5 μl/min 的速度注入右侧脑室（前后 -0.92；内外 1.5；背腹 3.5 mm），总体积为 5 μl。大鼠被分为 5 组：I/R 组接受 5 μl 载体；三组CA074-me接受与I/R组相同的操作，分别在缺血20分钟前1小时接受1 μgCA074-me（CA074-me 1 μg）或10 μgCA074-me（CA074-me 10 μg），并在再灌注后1小时接受1 μg CA074-me（Post CA074-me 1 μg）；假手术组接受与I/R组相同的操作，但不进行颈总动脉（CCA）闭塞。

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本研究使用了32只雌性短毛豚鼠（体重：154±18 g，年龄：4周龄）。如前所述，通过注射柯萨奇病毒B1 (CVB1) 建立PM动物模型。¹⁶ 简而言之，本研究包括四个实验组（每组8只豚鼠）：（A）假手术组：注射生理盐水；（B）CVB1+无处理组：注射CVB1+弗氏完全佐剂（FCA）；（C）CVB1+生理盐水组（假干预组）：注射CVB1+FCA+生理盐水（NS）；（D）CVB1+CA074-me组：注射CVB1+FCA+CA-074Me。在注射CVB1 24小时后，连续7天给予CA074-me（4 mg/kg/天，肌肉注射）。注射CVB1四周后，处死动物，收集肺组织用于后续实验。^[3]

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本研究采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（280-350 g）。采用四血管闭塞（4-VO）法诱导全脑缺血。在麻醉状态下，对双侧椎动脉进行永久性电凝结扎。次日，用动脉瘤夹闭双侧颈总动脉20分钟以诱导缺血，随后移除动脉瘤夹进行再灌注。将CA074-me溶解于含2% DMSO的0.9% NaCl溶液中，配制成浓度为0.2 µg/µl或2 µg/µl的溶液。缺血前一小时或再灌注后一小时，将5 µl溶液（含1 µg或10 µg CA074-me）或载体（2% DMSO）以0.5 µl/min的速率注入右侧脑室（坐标：前后方向-0.92 mm；内外方向1.5 mm；背腹方向3.5 mm，以bregma为参考点）[1]。

[1]. Protective mechanisms of CA074-me (other than cathepsin-B inhibition) against programmed necrosis induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Brain Res Bull. 2016 Jan;120:97-105.

[2]. CA-074Me compound inhibits osteoclastogenesis via suppression of the NFATc1 and c-FOS signaling pathways. J Orthop Res. 2015 Oct;33(10):1474-86.

[3]. Treatment with CA-074Me, a Cathepsin B inhibitor, reduces lung interstitial inflammation and fibrosis in a rat model of polymyositis. Lab Invest. 2015 Jan;95(1):65-77.

CA-074 甲酯 (CA-074Me) 是一种细胞可渗透的组织蛋白酶 B 抑制剂。它由细胞酯酶转化为 CA-074。

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许多研究表明溶酶体在脑缺血性细胞死亡中起着关键作用，并由此提出了“溶酶体中心”假说。该假说认为，溶酶体膜通透性 (LMP) 改变或破裂导致的组织蛋白酶 B 释放至关重要，而 CA-074 和 CA-074-me 等抑制剂可以阻止这一过程。然而，CA-074-me 在神经元死亡中的作用及其对全脑缺血/再灌注 (I/R) 损伤后溶酶体膜完整性改变的影响尚不明确，因此我们在此进行了研究。我们评估了 20 分钟全脑 I/R 损伤后大鼠海马 CA1 区神经元的死亡情况。在缺血前1小时或再灌注后1小时，分别经脑室内注射CA074-me（1 μg、10 μg）。分别评估了热休克蛋白70 (Hsp70)、组织蛋白酶B、溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP-1)、受体相互作用蛋白3 (RIP3) 的变化以及溶酶体pH值的变化。CA074-me在缺血/再灌注损伤前后均能预防由全脑缺血/再灌注损伤引起的CA1区神经元程序性坏死。再灌注后2天，弥漫性胞质组织蛋白酶B和LAMP-1免疫染色与核固缩变化同步出现；氧糖剥夺(OGD)后，溶酶体pH值升高，并伴有溶酶体染料DND-153的渗漏。这两种变化均表明溶酶体膜破裂和组织蛋白酶B泄漏，而CA074-me预处理可显著抑制这些变化。CA074-me预处理还抑制了缺血/再灌注损伤后RIP3的过表达和核转位以及NAD(+)水平的降低，同时增强了Hsp70的上调。溶酶体破裂导致的组织蛋白酶B延迟性暴发性泄漏是20分钟全脑缺血/再灌注损伤诱导的神经元程序性坏死的关键有害因素。CA074-me除了作为组织蛋白酶B的抑制剂外，还可能通过维持溶酶体膜的完整性和防止溶酶体破裂而发挥间接的神经保护作用。[1]破骨细胞是骨吸收过程中不可或缺的细胞。由于溶骨性疾病的发生与破骨细胞的功能及其异常密切相关，因此了解破骨细胞生物学对于设计抑制溶骨性疾病的新疗法至关重要。溶酶体蛋白酶（例如组织蛋白酶）的鉴定和研究揭示了骨吸收的机制。例如，组织蛋白酶K已被证实是一种由成熟破骨细胞产生的胶原降解蛋白酶，在酸性破骨细胞吸收陷窝中具有高活性。深入研究组织蛋白酶和其他破骨细胞相关化合物的作用机制，为破骨细胞生物学的研究提供了新的靶点。通过我们的抗破骨细胞生成化合物筛选实验，我们发现了一种组织蛋白酶B抑制剂CA-074的修饰版本：细胞膜可渗透的CA-074Me（L-3-反式-(丙基氨基甲酰基)环氧乙烷-2-羰基]-L-异亮氨酰-L-脯氨酸甲酯）。本文证实，CA-074Me在体内外均以剂量依赖的方式抑制破骨细胞生成。然而，组织蛋白酶B敲除小鼠的破骨细胞生成未受影响，提示其作用机制可能比单纯抑制组织蛋白酶B更为复杂。我们发现，CA-074Me通过抑制c-FOS和NFATc1通路，在破骨细胞生成刺激后24小时内发挥其破骨细胞生成抑制作用。[2]组织蛋白酶B (CB)参与蛋白质的周转，并在维持细胞正常代谢中发挥多种作用。我们最近的研究发现，多发性肌炎/皮肌炎 (PM/DM) 患者的肌肉中CB表达升高。然而，CB在间质性肺病 (ILD) 中的作用尚未见报道。ILD是PM/DM的常见并发症，也是PM/DM患者的主要死因。间质性肺病（ILD）是一种结缔组织疾病，具有较高的发病率和死亡率，其特征是炎症细胞因子过度产生和诱导纤维化，最终导致呼吸衰竭。ILD的病因和发病机制仍未完全阐明。本研究旨在探讨使用CB特异性抑制剂CA-074Me治疗是否能减轻多发性肌炎（PM）患者的ILD症状。我们分析了PM/DM患者肺组织中CB的表达、炎症和纤维化情况。采用柯萨奇病毒B1（CVB1）诱导豚鼠PM动物模型。在CVB1注射24小时后，连续7天给予CA-074Me。实验结束时，处死动物并收集肺组织进行后续分析。通过组织学检查、免疫组织化学分析、蛋白质印迹分析和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测炎症、纤维化、凋亡细胞和细胞因子。在多发性肺病/皮肌炎（PM/DM）患者中，肺组织中CB蛋白水平显著高于健康对照组，且与炎症和纤维化的加重相关。同样，在柯萨奇病毒B1（CVB1）诱导的豚鼠多发性肺病（PM）模型中，肺组织中CB表达、炎症和纤维化、CD8⁺ T细胞、CD68⁺细胞、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1浸润以及细胞凋亡均显著增加。CA-074Me的给药可减轻这些变化。总之，本研究表明，PM/DM可增加肺组织中CB的表达，而抑制CB可减轻CVB1诱导的PM豚鼠模型中的间质性肺病（ILD）。这一发现提示CB可能是ILD的潜在治疗靶点。[3]

C19H30N2O6

382.45

397.221

C, 59.67; H, 7.91; N, 7.32; O, 25.10

147859-80-1

134448-10-5

6610318

White to off-white solid powder

0.694

117.34

2

6

10

28

611

5

O1[C@@]([H])(C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H])=O)[C@@]1([H])C(N([H])[C@]([H])(C(N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(=O)OC([H])([H])[H])=O)[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])=O

XGWSRLSPWIEMLQ-YTFOTSKYSA-N

InChI=1S/C19H31N3O6/c1-5-9-20-16(23)14-15(28-14)17(24)21-13(11(3)6-2)18(25)22-10-7-8-12(22)19(26)27-4/h11-15H,5-10H2,1-4H3,(H,20,23)(H,21,24)/t11-,12-,13-,14-,15-/m0/s1

methyl (2S)-1-[(2S,3S)-3-methyl-2-[[(2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate

Ca-074Me; Ca-074Me; CA-074 methyl ester; CA-074Me; Cathepsin B Inhibitor IV; methyl ((2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-prolinate; (S)-methyl 1-((2S,3S)-3-methyl-2-((2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carboxamido)pentanoyl)pyrrolidine-2-carboxylate; methyl (2S)-1-[(2S,3S)-3-methyl-2-[[(2S,3S)-3-(propylcarbamoyl)oxirane-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylate; CA-074-Me; Ca-074Me

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~251.59 mM)
H2O : < 0.1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。