Motilin Receptor ( pEC50 = 7.9 )

GSK962040 盐酸盐，也称为盐酸camecicinal，对生长素释放肽和其他受体、离子通道和酶的影响可忽略不计。当给予Camicinal盐酸盐（GSK962040盐酸盐）300 nmol L 1-10 μmol L 1时，兔胃窦胆碱能介导的收缩幅度延长，并在3 μmol L 1时达到最大值248±47%。在样品中发现：胃动素、红霉素和盐酸Camicinal（GSK962040盐酸盐）的值为10.4±0.01（n=770）、7.3±0.29（n=4）和7.9±0.09（n=17）[1]。狗胃动素受体激活是由Camicinal盐酸盐（GSK962040盐酸盐）引起的（pEC50 5.79；相对于[Nle13]-胃动素的内在活性0.72）[2]。由于其对 CYP3A4 的初始 IC50 值远大于我们推荐的 10 μM 阈值 [3]，因此优选盐酸Camicinal 盐酸盐（GSK962040 盐酸盐）。

Camicinal (GSK962040) (5 mg 游离碱·kg 1) 给药两小时后粪便总重量也增加 (21.2 ± 4.5 g; P < 0.05)。 [1]。 Camicinal (GSK962040) 导致平均血浆浓度>1.14 μmol L 1 ，从而引起剂量相关的阶段性收缩，分别持续 48 和 173 分钟，剂量为 3 mg kg 1 和 6 mg kg 1 。当 Camicinal (GSK962040) 的作用减弱时，迁移运动复合体 (MMC) 活动会恢复。 3 mg kg 1 Camicinal (GSK962040)对运动复合体的迁移恢复没有影响；然而，在 6 mg kg 1 剂量下，MMC 在分娩后 253 分钟恢复，而生理盐水后 101 分钟恢复（各 n = 5）。[2]。 Camicinal (GSK962040) 的口服生物利用度 (Fpo) 为 48 (13%)。与短期效应相比，camicinal (GSK962040) 表现出长期效应 (T1/2) 46.9（3 μM 时 5.0 分钟）[Nle13]。胃动素 (T1/2) 11.4（0.3 μM 时）持续 1.5 分钟[ 3]。化合物camicinal (GSK962040) 在胃底和小肠中活性较低，但显着增加胃窦中的胆碱能活性[4]。

胃动素受体激动剂FLIPR测定[3]
使用荧光成像板阅读器（FLIPR）和稳定表达人胃动素受体的中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞研究了靶化合物对人胃动蛋白受体的效力和功效。简而言之，将人胃动素受体克隆（从人基因组DNA进行PCR）到载体中的pCDNA3.1中，亚克隆到pENTR/D-TOPO中（使用pENTR-D-TOPO定向克隆试剂盒），然后重组到pCIN1GW载体（LR克隆酶网关反应试剂盒）中，得到pCIN1胃动素接收器。然后用pCIN1胃动素受体质粒稳定转染CHO-K1细胞（ATCC编号CCl-61）。这些细胞在添加了10%v/v FBS、2 mM GlutaMAX和1 mg/mL Geneticin的DMEM/HamF-12中作为单层生长。用胃动素刺激该细胞系会引起细胞内信号传导，导致细胞内钙增加，这是使用钙敏感荧光染料测量的，并使用FLIPR定量。简而言之，将细胞接种到384孔黑壁、透明底部微量滴定板上（10000个细胞/孔）并孵育24小时。在测定当天，使用细胞洗涤器从细胞板中吸出培养基（留下10μL培养基）。立即用加载缓冲液（Tyrodes（Elga水+145 mM NaCl+5 mM KCl+20 mM HEPES+10 mM葡萄糖+1 mM MgCl2）+1.5 mM CaCl2+0.714 mg/mL Probenicid（预溶于1 M NaOH）+0.5 mM亮黑色+2.5μM Fluo 4染料）加载细胞，并在37.5°C下孵育1小时。在100%DMSO中制备主复合板。使用3mM的最高浓度（在测定中得到12μM的最终浓度），并将其连续稀释1比4。然后将1μL的母板转移到子板上，向其中加入50μL的化合物稀释缓冲液（Tyrodes+1 mg/mL BSA+1.5 mM CaCl2）。然后使用FLIPR 3钙成像仪将化合物板中的10μL立即加入细胞板中，并在1分钟内测量荧光变化。荧光相对于基线的最大变化用于确定激动剂反应，并使用四参数逻辑斯谛方程构建浓度反应曲线。目标化合物的内在活性是通过使用其浓度-反应曲线的最大渐近线相对于胃动素浓度-反应关系曲线的最大渐近线来计算的。

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CYP 3A4时间依赖性抑制（TDI）测定[3]
通过量化CYP3A4特异性荧光探针底物二乙氧基荧光素（DEF）与大肠杆菌中异源表达的CYP3A4（Cypex）和受试化合物或阳性对照（曲拉度霉素）孵育后荧光代谢物的产生来确定抑制作用。NADPH再生系统（辅因子）的制备如下：在2%w/v碳酸氢钠溶液中制备7.8mg/mL葡萄糖6-磷酸（27.65mM）、1.7mg/mL NADP（2.22mM）和6个酶单位/mL的葡萄糖6-磷酸脱氢酶。制备含有酶、探针底物和50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）的孵育混合物，并向96孔板的每个孔中加入220μL。加入5μL连续稀释的试验化合物，并在37°C下孵育10分钟。为了开始反应，加入25μL辅因子。然后在37°C下，在30分钟的时间范围内每分钟测量一次荧光的产生。表5给出了测定条件的总结。

迫切需要一种安全、有效的胃排空刺激剂；目前的治疗方法包括红霉素（一种具有额外特性的抗生素，可以防止长期使用）和胃复安（一种与运动障碍相关的5-羟色胺4型受体激动剂和脑D2受体拮抗剂）。为了摆脱红霉素复杂的胃动素结构，鉴定并表征了一种小分子胃动素受体激动剂GSK962040。使用重组人受体、已知对胃动素有反应的兔和人分离胃制剂以及体内，通过测量其增加清醒兔排便的能力，对该化合物进行了评估。在人胃动素受体上，Camicinal (GSK962040)和红霉素作为激动剂的pEC50（EC50值的负对数，以10为底，产生50%最大反应的激动剂浓度）值分别为7.9和7.3；GSK962040在一系列其他受体（包括胃饥饿素）、离子通道和酶上没有显著活性。在兔胃窦中，GSK962040 300 nmol L（-1）-10微摩尔L（-1”）导致胆碱能介导的收缩幅度延长，在3微摩尔L时最大可达248+/-47%。在人类离体胃中，GSK962040 10微摩尔L（-1）、红霉素10微摩尔L（-1）和[Nle13]-胃动素100 nmol L（-1”）均引起类似幅度的肌肉收缩。在清醒的兔子中，静脉注射5 mg kg（-1）GSK962040或10 mg kg（-1）红霉素在2小时内显著增加了粪便排出量。这些数据共同表明，GSK962040是一种非胃动素结构，选择性地激活胃动素受体。简化激活该受体的结构要求极大地促进了胃轻瘫潜在新药的设计[1]。

大鼠药代动力学研究[3]
\n本研究在雄性Sprague-Dawley大鼠（n = 3）中考察了化合物12/Camicinal（GSK962040）盐酸盐的药代动力学和口服生物利用度。研究分两天进行，间隔两天。第一天，将化合物12溶解于0.9% (w/v)生理盐水中，目标浓度为0.2 mg游离碱/mL。以5 mL/kg/h的速率向三只大鼠静脉输注化合物12，持续1小时，以达到1 mg游离碱/kg的目标剂量。在输注开始后12小时内，连续采集每只大鼠的血样。第二天，将化合物12悬浮于1% (w/v)甲基纤维素溶液中，目标浓度为1 mg游离碱/mL。三只大鼠经口灌胃给予化合物 12，剂量为 5 mL/kg，目标剂量为 5 mg 游离碱/kg。给药后 12 小时内，对每只大鼠进行系列血样采集。稀释后的血样采用 LC/MS/MS 分析化合物 12 的浓度（定量下限为 5 ng/mL，0.012 μM）。
\n\n本研究考察了雄性 Sprague-Dawley 大鼠口服混悬液后化合物 16 盐酸盐的全身暴露情况。三只大鼠经口灌胃给予化合物 16，目标剂量为 5 mg 游离碱/kg。化合物 16 在给药当天配制于 1% (w/v) 甲基纤维素水溶液中，浓度为 1 mg 游离碱/mL，并以 5 mL/kg 的剂量给药。给药后 8 小时内，对每只大鼠进行系列血样采集。采用液相色谱-串联质谱法 (LC/MS/MS) 分析稀释后的血液样本中的母体化合物。\n

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\n\n犬药代动力学研究[3]
\n本研究在雄性比格犬 (n = 3) 中考察了化合物 12/卡米西纳尔 (GSK962040) 盐酸盐的药代动力学和口服生物利用度。研究分两天进行，两次研究间隔 7 天。在第一天，将化合物 12 溶解于 0.9% (w/v) 生理盐水中，浓度为 0.4 mg 游离碱/mL。以 5 mL/kg/h 的速度向三只犬静脉输注化合物 12，持续 1 小时，以达到 2 mg 游离碱/kg 的目标剂量。在输注开始后 30 小时内，连续采集每只犬的血液样本。在研究第2天，将化合物12悬浮于1% (w/v)甲基纤维素溶液中，浓度为1 mg游离碱/mL。三只犬分别接受5 mL/kg的化合物12灌胃给药，以达到5 mg游离碱/kg的目标剂量。给药后30小时内，从每只犬身上采集系列血样。稀释后的血样采用LC/MS/MS法分析化合物12的浓度（定量下限为5 ng/mL，0.012 μM）。

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\n\n\n背景：GSK962040是一种小分子胃动素受体激动剂，旨在满足安全有效的胃动力剂的需求。然而，由于实验室啮齿动物缺乏功能性胃动素系统，体内研究仅限于单次给药，该给药可增加兔子的排便次数。胃动素激动剂通常不会增加人类结肠动力，因此需要证实其具有胃动力活性。\n
\n方法：在植入应变计的禁食犬中评估静脉注射 GSK962040 对胃十二指肠动力的影响。活性与血浆中 GSK962040 的浓度（通过 HPLC-MS/MS 测定）以及 GSK962040 在犬重组受体上的效价（在 HEK293 细胞表达后，使用荧光成像板读数仪（Molecular Devices，Wokingham，UK）测定）相关。\n
\n主要结果：GSK962040 激活了犬胃动素受体（pEC50 为 5.79；内在活性为 0.72，与 [Nle13]-胃动素相比）。在体内，GSK962040 可诱导节律性收缩，其持续时间与剂量相关（3 mg kg⁻¹ 和 6 mg kg⁻¹ 剂量组分别为 48 分钟和 173 分钟），由平均血浆浓度 >1.14 μmol L⁻¹ 驱动。GSK962040 的作用消退后，移行性运动复合体 (MMC) 活动恢复。3 mg kg⁻¹ 剂量的 GSK962040 对 MMC 的恢复无影响，但 6 mg kg⁻¹ 剂量组在给药后 253 分钟 MMC 恢复，而生理盐水组为 101 分钟（每组 n=5）。结论与推论：结果与犬胃动素受体激动剂的效力低于人类的结果一致。此外，结果还确定了刺激胃动力的 GSK962040 剂量。同一物种的体内和体外数据的相关性，以及血浆浓度，指导进一步的研究和向其他物种的转化。[2]

研究发现，极性更强的氰基的存在不利于化合物 16 的口服药代动力学。在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中，化合物 16 的口服暴露量低且不稳定，而氟代类似物 12 的暴露量更高且更稳定。测定其静脉药代动力学后，发现化合物 12 的口服生物利用度 (Fpo) 为 48 ± 13%。这一极具前景的结果促使我们测定化合物 12 在雄性比格犬体内的药代动力学特征，我们欣喜地发现其口服生物利用度为 51 ± 16%。[1] 化合物 12 还被评估了其对其他主要人类 CYP 同工酶的抑制作用，结果发现其具有良好的抑制特性（1A2、2C19、2C9 IC50 > 100 μM，2D6 IC50 = 34 μM）。此外，在以7BQ为底物的CYP3A4上，这些同工酶均未观察到TDI相互作用。对密切相关的人胃饥饿素受体的选择性很高（pEC50 < 6.0），且在hERG通道上未观察到相互作用（结合试验pIC50 = 4.8）。体外血浆蛋白结合率可接受（人83%，大鼠63%），在水和一系列模拟胃肠液中的溶解度很高（盐酸盐，>1 mg/mL）。[1]
此外，已测定化合物12在兔胃窦天然组织试验中的作用持续时间。完整结果将在其他地方报告，但简而言之，与[Nle13]胃动素（0.3 μM，T1/2 = 11.4 ± 1.5 分钟）的短效作用相比，化合物 12 显示出持久的作用（3 μM 时 T1/2 = 46.9 ± 5.0 分钟）。其作用持续时间也长于红霉素 1（3 μM 时 T1/2 = 24.0 ± 5.6 分钟），后者在临床上被成功用于低剂量重复给药以改善胃排空。因此，这些数据可能表明，在体内适当给药的情况下，化合物 12 发生快速耐受性的可能性较低。化合物 12 的总体选择性、在人天然胃组织中的疗效以及在兔全肠道转运模型中的促动力活性也已确定，这些数据也将在其他地方完整报告。[1]

[1]. GSK962040: a small molecule, selective motilin receptor agonist, effective as a stimulant of human and rabbit gastrointestinal motility. Neurogastroenterol Motil, 2009. 21(6): p. 657-64, e30-1.

[2]. GSK962040: a small molecule motilin receptor agonist which increases gastrointestinal motility in conscious dogs. Neurogastroenterol Motil, 2011. 23(10): p. 958-e410.

[3]. Discovery of N-(3-fluorophenyl)-1-[(4-([(3S)-3-methyl-1-piperazinyl]methyl)phenyl)acetyl]-4-pi peridinamine (GSK962040), the first small molecule motilin receptor agonist clinical candidate. J Med Chem, 2009. 52(4): p. 1180-9.

[4]. Regional- and agonist-dependent facilitation of human neurogastrointestinal functions by motilin receptor agonists. Br J Pharmacol, 2012. 167(4): p. 763-74.

卡米西那属于乙酰胺类化合物。卡米西那已用于胃轻瘫治疗的临床试验。

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N-(3-氟苯基)-1-[(4-([(3S)-3-甲基-1-哌嗪基]甲基)苯基)乙酰基]-4-哌啶胺 12 (GSK962040) 是一种新型小分子胃动素受体激动剂。它对重组人胃动素受体和天然兔胃动素受体均具有优异的活性，其激动剂活性可增强离体胃窦组织神经介导的收缩幅度。化合物 12 在大鼠和犬体内均表现出极具前景的药代动力学特征，这些结果，结合在人体天然组织和兔胃肠道转运体内模型中的进一步分析，使其成为进一步开发的候选药物。[1] 综上所述，化合物 12 展现出非常理想的整体特性，并已被选为进一步开发的候选药物。因此，化合物 12 是一种新型选择性小分子胃动素受体激动剂（分子量 424），它是通过基于重组人胃动素受体活性的广泛构效关系研究开发的，也是首个进入 I 期临床试验的此类化合物，有望用于治疗与胃排空延迟相关的疾病。因此，化合物 12 是一种新型选择性小分子胃动素受体激动剂（分子量 424），它是通过基于重组人胃动素受体活性的广泛 SAR 计划开发的，也是第一个进入 I 期临床试验的此类化合物，有望用作治疗与胃排空延迟相关的疾病的药物。[1]

C25H33N4OF.HCL

461.01506

460.24

C, 65.13; H, 7.43; Cl, 7.69; F, 4.12; N, 12.15; O, 3.47

923565-22-4

Camicinal;923565-21-3

25222897

Typically exists as solid at room temperature

3.542

47.61

3

5

6

32

560

1

O=C(N1CCC(NC2=CC=CC(F)=C2)CC1)CC3=CC=C(CN4C[C@H](C)NCC4)C=C3.Cl

MZEVMNJFEUATKJ-FYZYNONXSA-N

InChI=1S/C25H33FN4O.ClH/c1-19-17-29(14-11-27-19)18-21-7-5-20(6-8-21)15-25(31)30-12-9-23(10-13-30)28-24-4-2-3-22(26)16-24;/h2-8,16,19,23,27-28H,9-15,17-18H2,1H3;1H/t19-;/m0./s1

1-[4-(3-fluoroanilino)piperidin-1-yl]-2-[4-[[(3S)-3-methylpiperazin-1-yl]methyl]phenyl]ethanone;hydrochloride

Camicinal hydrochloride; 923565-22-4; GSK962040 (HCl salt); GSK962040 (hydrochloride); GSK962040 hydrochloride; 1-[4-(3-fluoroanilino)piperidin-1-yl]-2-[4-[[(3S)-3-methylpiperazin-1-yl]methyl]phenyl]ethanone;hydrochloride; CHEMBL489679;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~216.91 mM)
DMSO : ~100 mg/mL (~216.91 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 100 mg/mL (216.91 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。