Cuprizone   中文名称: 双环己酮草酰二腙

copper chelating agent; copper enzymes such as SOD1, cytochrome oxidase, and DβH
Copper chelating agent; targets copper enzymes including SOD1, cytochrome oxidase, and dopamine β-hydroxylase (DβH). By chelating copper ions, Cuprizone disrupts the function of these enzymes, causing oxidative stress. This leads to increased dopamine (DA) levels in certain brain areas such as the medial prefrontal cortex (PFC). The disruption of copper homeostasis also affects oligodendrocytes, leading to demyelination. The compound interferes with the normal process of myelin formation and maintenance, making it a valuable tool for studying demyelinating diseases like multiple sclerosis.

双(环己酮)草酰二腙（也称Cuprizone）与铜(II)配位形成深蓝色络合物，这一现象最早于70多年前被报道。Cuprizone反应已被用于比色法检测痕量铜的存在。在C57BL/6小鼠中，长期给予Cuprizone会导致脱髓鞘——这一结果似乎是由于铜稳态失衡所致——因此，自20世纪60年代首次应用以来，Cuprizone一直是构建毒物诱导脱髓鞘动物模型的主要方法。尽管人们对Cuprizone及其与铜的结合能力表现出广泛的兴趣，但对该配体铜配位性质的结构表征研究却相对较少。在无水介质（例如纯醇）的情况下，铜和Cuprizone仅形成无定形绿色沉淀。在水溶液中，当铜酮（相对于铜）过量时，主要形成与铜-铜酮配位同义的蓝色络合物。蓝色和绿色的铜-铜酮产物溶解度差，给传统的结构表征方法（例如X射线晶体衍射或核磁共振波谱）带来了挑战。通过结合质谱、X射线吸收光谱、计算化学和其他技术，我们获得了蓝色和绿色络合物铜配位结构的自洽图像——证实蓝色络合物为Cu(III)态，每个金属中心含有两个水解的铜酮配体；而绿色络合物则是一种扩展的低聚络合物，由间隔4.8 Å的重复Cu(II)中心组成，这些中心通过未水解的铜酮供体桥接。[3]
在体外，铜酮被用于研究铜螯合及其对细胞模型的影响。该化合物与铜(II)配位形成深蓝色络合物，这一反应已在比色测试中应用超过70年。在无水介质的情况下，铜和Cuprizone形成无定形绿色沉淀；而在含过量Cuprizone的水溶液中，则主要生成蓝色络合物。该蓝色铜-Cuprizone络合物已被鉴定为含有Cu(III)，每个金属中心连接两个水解的Cuprizone配体。

小鼠暴露于铜唑酮（0.5 mg/100 mg，混入饲料或淡水中；表皮给药）后，中枢神经系统会出现严重的神经海绵状病变，尤其是在脑干和小脑白质中[1]。近期的人体研究表明，少突胶质细胞的改变在精神分裂症的病理生理过程中发挥作用。我们最近的动物研究报道，暴露于铜唑酮（一种铜螯合剂，已被证实可选择性损伤白质）的小鼠出现了一些类似精神分裂症的行为（Xu et al., 2009）。本研究旨在探讨铜唑酮暴露小鼠行为改变的潜在机制，并检验抗精神病药物氟哌啶醇、氯氮平和喹硫平对这些改变的影响。小鼠连续14天服用铜唑酮后，其声惊反射的预脉冲抑制能力下降，前额叶皮层（PFC）多巴胺水平升高，而服用铜唑酮联合抗精神病药物的小鼠未观察到这些变化。小鼠连续21天服用铜唑酮后，其Y迷宫自发交替次数减少，而服用铜唑酮联合抗精神病药物的小鼠未观察到此现象。小鼠连续28天服用铜唑酮后，其社交互动减少，而服用铜唑酮联合氯氮平/喹硫平的小鼠未观察到此现象，但服用铜唑酮联合氟哌啶醇的小鼠则观察到此现象。小鼠连续42天服用铜唑酮后，其前额叶皮层、尾状核、壳核和海马的髓鞘脱失，髓鞘碱性蛋白水平降低。服用铜唑酮联合氯氮平/氟哌啶醇的小鼠的前额叶皮层白质损伤有所减轻。但尾状核壳核和海马的白质损伤仅能被氯氮平和喹硫平减轻，而不能被氟哌啶醇减轻。这些结果有助于我们理解行为改变，并为抗精神病药物对暴露于铜唑酮的小鼠白质损伤的保护作用提供实验证据。[4]
在体内，口服铜唑酮可诱导小鼠中枢神经系统出现严重的海绵状病变，尤其以脑干和小脑白质最为显著。长期暴露于铜唑酮（0.5 mg/100 mg 饲料）会导致脱髓鞘，这是铜稳态失衡的结果。自 20 世纪 60 年代以来，该模型一直被用作毒物诱导脱髓鞘动物模型的主要方法。铜唑酮还能诱导小鼠出现类似精神分裂症的行为，因此可用于研究精神分裂症的神经生物学基础。

铜嗪酮反应可用于比色法检测痕量铜的存在。铜嗪酮与铜(II)配位后会形成一种深蓝色络合物。在细胞实验中，该化合物通常溶解于DMSO中，浓度最高可达6.67 mg/mL (23.96 mM)。可以检测其对细胞氧化应激和多巴胺水平的影响。然而，现有文献中关于细胞实验方案的详细记载并不多，许多供应商仅提供用于研究的一般性指导。

本研究使用雄性C57BL/6小鼠（6周龄，体重20-22克）。经过10天的适应期后，将C57BL/6小鼠饲喂含0.2%（重量比）Cuprizone/CPZ的标准粉状啮齿动物饲料，持续14-42天。在此期间，饲喂不含CPZ的标准饲料的同龄小鼠作为对照组。分别对HAL、CLZ和QUE进行了三项独立的实验。每项实验均包含四个动物组，旨在研究CPZ对动物行为和白质的影响，以及抗精神病药物在未接触或接触CPZ的小鼠中的作用。例如，HAL实验包括CNT组、CPZ组、HAL组和CPZ+HAL组。CNT组小鼠饲喂不含CPZ的普通啮齿动物饲料，且不给予HAL；CPZ组小鼠饲喂含CPZ的啮齿动物饲料，且不给予HAL； HAL组小鼠饲喂不含氯丙嗪（CPZ）的普通啮齿动物饲料，但接受HAL治疗（1 mg/kg/天，腹腔注射）；CPZ+HAL组小鼠饲喂含氯丙嗪的啮齿动物饲料并接受HAL治疗。实验周期为42天，期间在指定时间点对小鼠进行行为学测试。为了进行高效液相色谱（HPLC）分析，另进行了两项实验，其中相同的处理（氯丙嗪摄入和抗精神病药物给药）分别持续12天和21天。每项实验均包含8个动物组（CNT、CPZ、HAL、氯丙嗪、喹啉、CPZ+HAL、CPZ+CLZ和CPZ+QUE；每组5-8只小鼠）。[4]

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前脉冲抑制试验[4]
PPI是指在惊吓刺激（脉冲）之前施加一个弱前脉冲刺激，从而抑制惊吓反射。本测试提供了一种评估受试者感觉门控功能的操作性方法。在我们最近的研究中，暴露于铜嗪（CPZ）的小鼠在暴露后第14天和第21天表现出前脉冲抑制（PPI）缺陷（Xu et al., 2009）。在本研究中，PPI测试在CPZ暴露后第14天进行。如我们最近的研究（Xu et al., 2009）所述，每只小鼠被放置在一个大型隔音室内的小型有机玻璃圆筒中。圆筒放置在压电换能器上，该换能器可以量化振动并在计算机上显示。背景噪声水平（74–75 dB）和声刺激的校准使用数字声级计进行确认。经过5分钟的适应期后，进行PPI测试。每次测试均以五次惊吓试验（40 ms；120 dB）开始和结束。在起始和结束惊吓试验之间，有八个相同的试验组，每个试验组包含以下五个试验：一个无刺激试验、一个惊吓试验和三个预脉冲-惊吓试验。每个预脉冲-惊吓试验在惊吓刺激之前（预脉冲后100毫秒）都有一个预脉冲刺激（比背景声级高3、6或12分贝）。试验间平均间隔为15秒。测量每个试验的惊吓幅度，定义为从惊吓刺激开始的65毫秒采样窗口内的峰值反应。每个预脉冲声级下的PPI水平计算公式为：100 × (1 - 有预脉冲刺激和惊吓刺激的试验的平均反应幅度 / 仅有惊吓刺激的试验的平均反应幅度)。

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Y迷宫测试[4]
Y迷宫是一个简单的两试验识别测试，用于测量空间识别记忆。在先前的一项研究（Oades等人，1985）中，苯丙胺呈剂量依赖性地降低了交替行为，而HAL预处理抑制了这种效应，表明该范式可用于研究精神分裂症动物模型的空间工作记忆。在我们最近的研究中，暴露于Cuprizone/CPZ的小鼠在CPZ暴露后第14、21、28、35和42天的Y迷宫中表现出较低的自发交替行为（Xu等人，2009）。在本研究中，我们在CPZ暴露后第21和42天进行了Y迷宫测试。如我们最近的研究（Xu等人，2009）所述，每只小鼠被放置在对称Y迷宫的一个臂的末端，并在8分钟的测试时间内自由穿过迷宫。记录小鼠进入迷宫臂的总次数和顺序。重叠进入序列（例如，ABC、BCA）的数量决定了自发交替的次数。

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社交互动测试[4]
在我们最近的研究中，CuprizoneCPZ暴露的小鼠在CuprizoneCPZ暴露后的第28、35和42天表现出较少的社交互动（Xu等人，2009）。在本研究中，社交互动测试在CPZ暴露后的第28天进行。如我们最近的研究（Xu等人，2009）所述，将同一实验组中互不熟悉的（单独饲养的）小鼠两两放置在开放式场地箱（56 cm × 56 cm × 31 cm）的中央，两鼠相距约10 cm。在开放式场地箱上方放置一台摄像机，以监测动物的活动。在10分钟的测试期间，当两只受试小鼠背部中心点之间的距离小于5厘米且持续时间至少为0.2秒时，即定义为动物间的社交互动。每只小鼠仅使用一次。结果由视频追踪程序SMART自动记录和分析，该程序可同时统计两只小鼠彼此靠近的时间。尽管此方法仅测量受试动物之间的亲近程度，但此前已有研究采用此方法，且亲近程度被认为能够反映社交互动（Shi et al., 2003; Egashira et al., 2007），而社交互动是精神分裂症患者社交退缩的动物学对应物（Weinberger, 1987; Abi-Dargham et al., 2000）。多种精神分裂症动物模型均报道存在社交行为缺陷（Shi et al., 2003; Boucher et al., 2007; Lazar et al., 2008）。
使用铜嗪的动物模型已相当成熟。通常将铜嗪混入C57BL/6小鼠的饲料（0.5 mg/100 mg饲料）或饮用水中。治疗周期通常持续数周，以诱导显著的脱髓鞘。随后评估动物的行为变化（类似精神分裂症的行为）和神经生物学变化，包括脑内的脱髓鞘和氧化应激。该方案广泛用于研究脱髓鞘疾病和测试潜在的治疗干预措施。

铜嗪在DMSO中可溶（6.67 mg/mL；23.96 mM），需超声处理并加热至60°C。它不溶于水和乙醇。用于体内给药时，可将其配制成浓度≥5 mg/mL的CMC-Na均质混悬液，用于口服给药。用于注射时，可将其配制成澄清溶液，配制方法为：使用5% DMSO、40% PEG300、5% Tween 80和50% ddH2O。该化合物以粉末形式在-20°C下可稳定保存3年，在4°C下可稳定保存2年。在溶剂中，它在-80°C下可稳定保存6个月，在-20°C下可稳定保存1个月。

铜嗪酮具有毒性，可导致肝脏和脑损伤。它是一种铜螯合剂，能抑制单胺氧化酶。该化合物可诱导小鼠中枢神经系统出现严重的海绵状病变。它被归类为刺激性物质，可能引起皮肤和眼睛刺激。处理该化合物时应采取适当的安全预防措施，包括使用个人防护装备。其毒性作用主要与其破坏铜依赖性酶以及诱导神经组织氧化应激有关。

[1]. Suzuki K, et al. Status spongiosus of CNS and hepatic changes induced by cuprizone (biscyclohexanone oxalyldihydrazone). Am J Pathol. 1969 Feb;54(2):307-25.
[2]. Sanadgol N, et al. Alpha-lipoic acid mitigates toxic-induced demyelination in the corpus callosum by lessening of oxidative stress and stimulation of polydendrocytes proliferation. Metab Brain Dis. 2018 Feb;33(1):27-37.
[3]. M Jake Pushie, et al. Synthesis and structural characterization of copper-cuprizone complexes. Dalton Trans. 2022 Jun 29.
[4]. Haiyun Xu, et al. Behavioral and neurobiological changes in C57BL/6 mouse exposed to cuprizone: effects of antipsychotics. Front Behav Neurosci. 2010 Mar 18;4:8.

铜螯合物（Cuprizon）是一类含氧和氮的有机化合物，其功能与α-氨基酸相关。铜螯合物可抑制单胺氧化酶，导致肝脏和脑损伤。多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统（CNS）髓鞘形成障碍性疾病。活性氧（ROS）是有毒的代谢产物，越来越多的数据表明，ROS介导的少突胶质细胞（OLG）凋亡在氧化应激下MS的发病机制中起着关键作用。本研究在实验性MS模型中，探讨了内源性抗氧化剂α-硫辛酸（ALA）作为ROS清除剂在铜螯合物（cup）诱导的脱髓鞘过程中OLG丢失和髓鞘形成中的作用。我们的研究结果表明，ALA治疗显著增加了胼胝体（CC）中成熟少突胶质细胞（MOG+细胞）的数量，并降低了氧化应激（ROS、COX-2和PGE2）和凋亡介质（caspase-3和Bax/Bcl2比值）。令人惊讶的是，从第4周开始，ALA显著刺激了NG2-硫酸软骨素蛋白聚糖阳性胶质细胞（NG2+细胞或多突胶质细胞）的数量。因此，ALA可以抑制细胞凋亡，延缓脱髓鞘，并激活胼胝体中少突胶质细胞的存活和再生机制。我们得出结论，ALA通过降低氧化还原信号传导和减轻多突胶质细胞对兴奋性毒性刺激的敏感性，对毒性脱髓鞘具有保护作用。[2]
Cuprizone也称为双环己酮草酰二腙。它是一种铜螯合化合物，能与铜(II)离子形成稳定的深蓝色络合物。该化合物可用于诱导小鼠脱髓鞘和精神分裂症样行为，是研究多发性硬化症和精神分裂症的重要模型。它以粉末形式供应，应储存于-20°C。Cuprizone仅供研究使用，不可用于人类治疗。该化合物因其在神经科学研究中的应用价值，已被众多顶级期刊引用。

C14H22N4O2

278.3501

278.174

C, 60.41; H, 7.97; N, 20.13; O, 11.50

370-81-0

9723

Typically exists as White to off-white solid at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

210-214 °C(lit.)

1.626

0.85

82.92

2

4

2

20

373

0

O=C(C(N([H])/N=C1\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C\1([H])[H])=O)N([H])/N=C1\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C\1([H])[H]

DSRJIHMZAQEUJV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H22N4O2/c19-13(17-15-11-7-3-1-4-8-11)14(20)18-16-12-9-5-2-6-10-12/h1-10H2,(H,17,19)(H,18,20)

N,N'-bis(cyclohexylideneamino)oxamide

Cuprizone; 370-81-0; Bis(cyclohexanone)oxaldihydrazone; Ethanedioic acid, bis(cyclohexylidenehydrazide); Cuprizane; Oxalic acid bis(cyclohexylidenehydrazide); Cuprizon; Biscyclohexanone oxaldihydrazone;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~6.67 mg/mL (~23.96 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (2.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 6.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (2.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。