Fluorescent dye

原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效率，请将蛋白（抗体）浓度配制为 2 mg/mL。
(1) 蛋白溶液的 pH 值应为 8.5±0.5。如果 pH 低于 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
(2) 如果蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会显著降低。为了获得最佳标记效率，最终蛋白浓度范围应为 2-10 mg/mL。
(3) 蛋白必须置于不含伯胺（如 Tris 或甘氨酸）和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2. 染料准备
用无水 DMSO 稀释 CY 染料，制备 10 mM 储备溶液。使用玻璃管或旋涡混合器充分混合。
注意：建议将 CY 储备液分装后于 -20°C 或 -80°C 避光保存。
使用前需用缩合液（500 μg/mL）活化染料，然后进行后续标记实验。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于待标记蛋白的量，CY 染料与蛋白的最佳摩尔比约为 10。
示例：如果需要标记的蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG（MW=150,000），并用 100 μL DMSO 溶解 1 mg CY 染料，则以 CY3-NHS ester 为例，所需 CY 体积的详细计算如下：
(1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) × mL (IgG) / MW (IgG) = 2 mg/mL × 0.5 mL / 150,000 mg/mmol = 6.7×10^-6 mmol
(2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) × 10 = 6.7×10^-6 mmol × 10 = 6.7×10^-5 mmol
(3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) × MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10^-5 mmol × 917.05 mg/mmol / 0.01 mg/μL

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使用方法
1. 标记反应
(1) 取计算好的新鲜配制的 10 mM CY 染料并活化（约 10 μL 母液与 50 μL 500 μg/mL 缩合液混合）。将活化后的染料缓慢加入 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。避免剧烈混匀，以防止蛋白变性或失活。
(2) 将反应管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟。每隔 10-15 分钟，轻轻颠倒反应管几次，以确保反应物充分混合并提高标记效率。
2. 蛋白纯化与脱盐
以下方案以使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白偶联物为例。
(1) 按照生产说明书制备 Sephadex G-25 柱。
(2) 将反应混合物加至 Sephadex G-25 柱顶部。
(3) 当样品运行到树脂表面下方时，立即加入 PBS（pH 7.2-7.4）。
(4) 继续向柱中加入 PBS（pH 7.2-7.4）以完成纯化。收集含有目标染料-蛋白偶联物的组分。

Cy5.5 标记的因子 VIIa 专为肿瘤成像而设计。标记有这些抑制蛋白的 Cy5.5 定位于肿瘤异种移植物至少 14 天，而未结合的 Cy5.5 则不定位于任何异种移植物。这种可视化 VEC 中抗组织因子的方法可用于检测初始肿瘤和转移、监测和体内治疗反应 [1]。与 Cy5.5 标记的乳铁蛋白相关的 pH/温度敏感磁性纳米导体（Cy5.5-Lf-MPNA 纳米导体）被开发为一种有前景的成像剂，用于星状肿瘤的术前 MRI 和术中指纹成像 [2]。

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胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，在广泛的人群中导致不成比例的发病率和死亡率。从以往的临床实践来看，胶质瘤边缘的定义是手术切除的关键。为了勾勒出胶质瘤的确切边界，并在手术前计划阶段和手术切除阶段为医生提供指导作用，开发了与Cy5.5标记的乳铁蛋白结合的pH/温度敏感磁性纳米凝胶（Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶）作为一种有前景的造影剂。由于其pH/温度敏感性，Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶在不同pH和温度下的亲水性/疏水性和尺寸会发生变化。在生理条件下（pH 7.4，37°C），Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶具有亲水性和溶胀性，可以延长血液循环时间。在肿瘤组织的酸性环境（pH 6.8，37°C）中，Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶变得疏水并收缩，更容易在肿瘤组织中积累并被肿瘤细胞内化。此外，乳铁蛋白是胶质瘤的有效靶向配体，具有主动的肿瘤靶向能力。对患有原位胶质瘤的大鼠的体内研究表明，由于Lf的主动靶向功能和通过调整纳米凝胶的亲水性/疏水性来增强细胞摄取，使用Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶可以获得高灵敏度和特异性的MR/荧光成像。细胞毒性试验和组织病理学分析显示，Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶具有良好的生物相容性，有望开发成为胶质瘤术前MRI和术中荧光成像的特异性和高灵敏度造影剂[4]。

癌症细胞皮下接种[2]
将U87EGFRviii神经胶质瘤细胞、MiaPaCa和ASPC-1胰腺癌症细胞以106个细胞/0.1mL接种，并将KB-V1 SCC细胞以3×106个细胞+0.1mL接种于皮下悬浮于PBS中。当所有肿瘤直径达到0.5-1.0cm时，将含有约0.03mg Cy5.5/0.1mL/小鼠的Cy5.5-FFRck-fVIIa或未偶联的Cy5.5的等分试样静脉注射到无胸腺裸鼠的侧尾静脉中。

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Cy5.5与因子VIIa、抗TF抗体、FFRck fVIIa和紫杉醇FFRck fHIIa[2]的结合
将因子VIIa（5 mg/mL）、FFRck fVIIa（ASIS，批号NLDP013:7 mg/mL）和抗TF抗体（1 mg/mL）溶解在蒸馏水中，并在2升0.1 M碳酸钠缓冲液（pH8.8）中透析48小时。将Cy5.5（10mg）溶解在3mL 100%DMSO中。根据制造商的说明进行计算，将Cy5.5的等分试样以大约指示的Cy5.5：蛋白质比率添加到以下蛋白质中：fVIIa（1.5:1）、FFRck fVIIa（2:1）、紫杉醇FFRck fHIIa（2:1）和抗TF抗体（2:1）。在室温下将混合物轻轻搅拌1-1.5小时。通过预先用0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 8.8）平衡的Sephadex G25-150柱将所得的Cy5.5蛋白偶联物与未偶联的Cy5.5分离。在一个典型的实验中，将1.8 mg fVIIa在0.6 ml 0.1M碳酸氢钠缓冲液（pH8.8）中的溶液与1 mg Cy5.5单NHS酯在0.3 ml DMSO中的溶液在室温下孵育1小时。使用Sephadex G25-150柱（8 ml）分离Cy5.5-fVIIa和游离Cy5.5染料。对于含有Cy5.5-fVIIa的组分2-6，收集0.3 ml（0.324 ml=6滴）/组分（1滴=54μL）。然后以1ml/级分洗脱无色级分7-14。从组分15-21中洗脱游离的Cy5.5染料，然后洗脱。A280和A678的吸光度读数确定了含有Cy5.5-fVIIa（蛋白质）和游离Cy5.5染料（无蛋白质）的组分。使用Micro-BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质含量较高的组分并合并。合并组分（1 mL总体积）的蛋白质浓度通常为0.7 mg/mL。使用fVIIa和Cy5.5染料的消光系数分别为1.39×10 5 M-1cm-1和2.5×105 M-1cm-1，计算出Cy5.5与fVIIa的比值为1.24:1。Cy5.5与抗TF抗体的比例计算为1.86:1，使用抗体的消光系数1.7×105 M-1cm-1，按照制造商手册确定。

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体外细胞毒性[4]
根据先前的报告[14]，C6细胞和NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞系（NIH/3T）用于细胞存活率研究。以稀释系列（含0、25、50、75和100µg/mL Fe的细胞培养基）加入含有Cy5.5-Lf MPNA纳米凝胶或MPNA纳米胶囊的培养基。对照是不含纳米凝胶的培养基。孵育24、48和72小时后，向孔中加入20μL 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）（5mg/mL）。孵育4小时后，在培养箱中用100μL异丁醇溶解甲酰胺晶体过夜。在560nm下，在微孔板读数器（1420多标记计数器）上读取每个孔的吸光度。通过[A]试验/[A]对照×100%计算与含有不含纳米颗粒的细胞培养基的对照孔相关的相对细胞存活率（%），其中[A]试验是受试细胞的吸光度值，[A]对照是对照组的吸光度值。平均结果由6个样本计算得出。

体内生物相容性[4]
将正常大鼠随机分为四组（n = 9）。一组大鼠不进行任何处理作为对照组。其余三组大鼠分别经尾静脉注射生理盐水、Cy5.5-Lf-MPNA纳米凝胶和MPNA纳米凝胶（12 mg Fe/kg体重）。注射后第21天，处死大鼠。立即从股动脉采集4 mL血液，送至华中科技大学附属医院临床实验室进行重要生物学功能分析。同时，用250 mL氯化钠溶液灌注大鼠，并采集各种组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑组织）进行组织学检查。所有组织均按照标准临床实验室流程进行H&E染色，并由具有兽医病理学经验的病理学家进行阅片。

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Cy5.5 近红外体内成像[2]
根据 IVIS Lumina 100 系列成像系统（Xenogen）的说明，通过检测整个动物体内的 Cy5.5，对 Cy5.5 标记的 fVIIa、FFRck-fVIIa、紫杉醇-FFRck-fVIIa 和抗 TF 抗体进行实时成像监测。在滤光片锁定盒中选择 Cy5.5 的标准滤光片组，并确保激发（615-665 nm）和发射（695-770 nm）滤光片与 Cy5.5 正确配对。注射后每天进行成像，持续长达 26 天（图 2-5）。根据埃默里大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案，小鼠通过腹腔注射由氯胺酮（50 mg/mL）、赛拉嗪（20 mg/mL）和无菌蒸馏水按8:1、1:9体积比混合而成的麻醉液进行麻醉。如图5所示，肿瘤和正常器官被分别解剖并成像。在静脉注射Cy5.5后2天，使用位于动物房的IVIS 100系列成像系统，按照制造商的说明对Cy5.5进行成像。

[1]. Ptaszek M. Rational design of fluorophores for in vivo applications. Prog Mol Biol Transl Sci. 2013;113:59-108.

[2]. Visualizing cancer and response to therapy in vivo using Cy5.5-labeled factor VIIa and anti-tissue factor antibody. J Drug Target. 2015 Apr;23(3):257-65.

[3]. Fundamentals in the chemistry of cyanine dyes: A review. Dyes and Pigments, 145, 505–513. doi:10.1016/j.dyepig.2017.06.029.

[4]. pH/temperature sensitive magnetic nanogels conjugated with Cy5.5-labled lactoferrin for MR and fluorescence imaging of glioma in rats. Biomaterials. 2013 Oct;34(30):7418-28.

[5]. A Unique Recombinant Fluoroprobe Targeting Activated Platelets Allows In Vivo Detection of Arterial Thrombosis and Pulmonary Embolism Using a Novel Three-Dimensional Fluorescence Emission Computed Tomography (FLECT) Technology. Theranostics. 2017 Feb 26;7(5):1047-1061.

多种小分子有机化合物具有使其适用于体内荧光成像的特性。其中最有前景的候选化合物包括花菁、方酸菁、硼二吡咯亚甲基、卟啉衍生物、氢卟啉和酞菁。近期的设计和合成工作致力于改善这些化合物的光学性质（例如，将吸收和发射峰值向长波方向移动并提高亮度），以及提高其稳定性和水溶性。最显著的进展包括：开发出稳定性和水溶性均得到提升的包封型花菁染料、稳定性得到提升的方酸菁轮烷、长波吸收的硼二吡咯亚甲基、长波吸收的卟啉和氢卟啉衍生物以及水溶性酞菁。发光和生物发光领域的最新进展使得自发光荧光团能够应用于体内成像。新型氢卟啉能量转移二元体的开发有望进一步推动体内多色成像技术的发展。[1]我们开发了一种利用Cy5.5标记的凝血因子VIIa (fVIIa)、凝血功能缺陷型FFRck-fVIIa、紫杉醇-FFRck-fVIIa和抗组织因子(TF)抗体进行体内肿瘤成像的特异性技术。FVIIa是TF的天然配体。我们利用了这样一个事实：在肿瘤组织中，血管内皮细胞(VEC)（而非正常组织）由于血管内皮生长因子(VEGF)的诱导而异常表达TF。在生理条件下，TF由基质细胞和血管外层（平滑肌和外膜）表达，但不由VEC表达。我们假设标记的fVIIa或抗TF抗体可用于体内肿瘤血管成像。为了验证这一点，研究人员开发了Cy5.5标记的fVIIa、FFRck-fVIIa、紫杉醇-FFRck-fVIIa以及抗TF抗体，并将它们注射到携带异种移植瘤的无胸腺裸鼠体内，这些异种移植瘤包括神经胶质瘤U87EGFRviii、胰腺癌ASPC-1和Mia PaCa-2以及鳞状细胞癌KB-V1。与这些靶向蛋白标记的Cy5.5特异性地定位于肿瘤异种移植瘤，且至少持续14天，而未标记的Cy5.5则未定位到任何异种移植瘤或器官。这种对肿瘤血管内皮细胞（VEC）中TF进行成像的方法可能有助于检测原发肿瘤和转移灶，以及监测体内治疗反应。[2]

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在这篇综述文章中，阐述了花菁染料化学的一些重要基本原理。这包括花菁染料的结构和共振形式、天然存在的花菁染料、不同类别的花菁染料以及花菁染料的形成机制等主题。本文涵盖了甲炔菁染料、阿朴菁染料、苯乙烯基菁染料（半菁染料）、氮杂苯乙烯基菁染料、氮杂半菁染料、部菁染料（非环部菁染料和环部菁染料）、方酸菁染料（芳香方酸菁染料和杂环方酸菁染料）、菁染料的光谱敏化评价、菁染料的溶剂变色评价、菁染料的卤变色评价、用于CD-R和DVD-R的菁染料、作为核酸研究荧光标记的菁染料、二甲炔菁染料的作用机制以及阿朴菁染料的作用机制。此外，本文的引言部分重点介绍了菁染料的一些重要用途和应用。对花菁染料化学的基本原理、知识和/或理解进行系统性综述的研究一直鲜有关注，化学文献中也缺乏此类研究。[3]药物研发的进展高度依赖于临床前体内动物研究。小动物成像对于识别新的疾病标志物和评估药物疗效至关重要。本文首次报道了使用一种名为荧光发射计算机断层扫描（FLECT）的三维荧光生物成像技术来检测一种新型重组荧光探针。该探针安全、易于大规模制备，且在扫描前可稳定保存。这种新型荧光探针（Targ-Cy7）由一个单链抗体片段（scFvTarg）组成，该片段特异性地与活化血小板结合，并与近红外（NIR）染料Cy7偶联以进行检测。在小鼠颈动脉损伤后，注射的荧光探针会在富含血小板的血栓内循环并结合。与非靶向对照荧光探针相比，荧光荧光发射计算机断层扫描（FLECT）成像仪可检测荧光探针与血栓的体内结合情况。分析的FLECT图像可量化近红外（NIR）信号并将其定位到血管损伤部位。使用二维IVIS® Lumina扫描仪进一步验证检测到的荧光，结果显示，在体内血栓形成部位和体外受损的颈动脉中均检测到显著的近红外荧光。此外，还量化了不同器官中的荧光水平以评估其生物分布，结果表明受损动脉中荧光探针的摄取量最高。随后，该活体动物成像技术成功应用于监测诱导血栓对治疗的反应随时间的变化。这表明，纵向FLECT扫描具有在临床前研究中评估候选药物疗效的潜力。除了血管内血栓形成外，我们还证明这种非侵入性FLECT成像技术可以检测体内肺栓塞。总而言之，本报告描述了一种新型的基于荧光的临床前成像技术。该方法采用易于制备的非放射性重组荧光探针。这为研究血栓栓塞性疾病的机制提供了一种独特的工具，并将极大地促进抗血栓药物的体内试验。此外，其非辐射性、低成本、高灵敏度以及光学扫描技术的快速发展，使得这种荧光成像技术在未来的临床应用中极具吸引力。[5]

C41H44N2O14S4

917.053067207336

916.168

210892-23-2

Cy5.5 acetate;Cy5.5 TEA;Cy5.5-SE;442912-55-2

131704516

Purple to purplish red solid powder

10.819

297.38

4

15

13

61

2250

0

CCN\1C2=C(C3=C(C=C2)C(=CC(=C3)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)[O-])C(/C1=C/C=C/C=C/C4=[N+](C5=C(C4(C)C)C6=C(C=C5)C(=CC(=C6)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O)CCCCCC(=O)O)(C)C

LIZDKDDCWIEQIN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C41H44N2O14S4/c1-6-42-31-18-16-27-29(21-25(58(46,47)48)23-33(27)60(52,53)54)38(31)40(2,3)35(42)13-9-7-10-14-36-41(4,5)39-30-22-26(59(49,50)51)24-34(61(55,56)57)28(30)17-19-32(39)43(36)20-12-8-11-15-37(44)45/h7,9-10,13-14,16-19,21-24H,6,8,11-12,15,20H2,1-5H3,(H4-,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57)

(2Z)-2-[(2E,4E)-5-[3-(5-carboxypentyl)-1,1-dimethyl-6,8-disulfobenzo[e]indol-3-ium-2-yl]penta-2,4-dienylidene]-3-ethyl-1,1-dimethyl-8-sulfobenzo[e]indole-6-sulfonate

210892-23-2; Cy5.5; 1H-Benz[e]indolium, 2-[5-[3-(5-carboxypentyl)-1,3-dihydro-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-2H-benz[e]indol-2-ylidene]-1,3-pentadien-1-yl]-3-ethyl-1,1-dimethyl-6,8-disulfo-, inner salt;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~109.05 mM)
H2O : ~5 mg/mL (~5.45 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 4.17 mg/mL (4.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 41.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 4.17 mg/mL (4.55 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 41.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 5 mg/mL (5.45 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶 (<60°C).

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。