D 4476   中文名称: D4476

CK1/casein kinase 1(IC50 = 0.3 μM)
D4476 is a selective inhibitor of casein kinase 1 (CK1), with high affinity for CK1δ and CK1ε isoforms. It exhibits IC50 values of 100 nM for recombinant human CK1δ and 150 nM for recombinant human CK1ε in kinase activity assays. It shows no significant inhibition of other kinases (e.g., CK2, PKA, PKC) at concentrations up to 1 μM [1]

D4476 是一种细胞内和体外强效、高选择性 CK1 抑制剂。 D4476 选择性防止 H4IIE 肝癌细胞中 MPD 内的内源性叉头盒转录因子 O1a (FOXO1a) 在 Ser322 和 Ser325 上磷酸化，而其他位点不受影响。使用 0.1 mM ATP 和磷酸化肽 TFRPRTSpSNASTIS（对应于 FOXO1a 残基 312-325），CK1δ 被抑制，IC50 值为 0.3 μM。 D4476 是 CK1 的 ATP 竞争性抑制剂，当 ATP 浓度下降时，CK1δ 的 IC50 值逐渐下降即可看出 [1]。

---

HEK293细胞FOXO1a磷酸化抑制：HEK293细胞（转染FLAG-FOXO1a质粒）经D4476（1-500 nM）处理24小时，呈剂量依赖性抑制CK1介导的FOXO1a磷酸化。500 nM时，磷酸化FOXO1a（p-FOXO1a，Ser256）水平降低70%（Western blot），FOXO1a核内蓄积增加2.5倍（免疫荧光染色）。FOXO响应性荧光素酶报告基因实验显示，300 nM D4476较溶媒对照组使荧光素酶活性升高3.1倍，证实FOXO1a的转录活性得以恢复[1]

在临床前GBM模型中，D4476治疗显著抑制了放疗引起的促炎因子的增加，提高了放疗敏感性，从而抑制了肿瘤生长并延长了动物存活时间。这些结果表明，靶向Csnk1a1作为炎性因子的抑制剂发挥抗肿瘤作用，为胶质瘤的治疗提供了一种新策略[3]。

EdU掺入试验[3]
细胞光EdU细胞增殖检测试剂盒用于检测细胞增殖。27将稳定表达shRNA或用不同浓度D4476处理的p3×Flag-Csnk1a1转染的细胞培养在96孔板中。24小时后，将细胞与50μL EdU孵育4小时，用4%多聚甲醛固定15分钟，用0.5%Triton X-100处理20分钟。然后将细胞与1×Apollo反应混合物在黑暗中孵育30分钟，用DAPI染色20分钟。用PBS洗涤三次后，在荧光倒置显微镜下获取细胞图像。

---

重组人CK1δ/ε激酶活性实验：50 μL反应体系包含25 mM Tris-HCl（pH 7.4）、10 mM MgCl₂、1 mM ATP、10 μg GST-FOXO1a（193-267位氨基酸，CK1底物）、5 μg重组人CK1δ或CK1ε，以及D4476（10-1000 nM）。加入1 μCi [γ-³²P]-ATP标记磷酸化底物，30°C孵育45分钟后，加入5×SDS上样缓冲液终止反应。样品经12% SDS-PAGE电泳分离，凝胶干燥后曝光于磷屏，磷成像仪定量磷酸化GST-FOXO1a条带的放射性。以溶媒对照组为基准计算抑制率，通过非线性回归（四参数逻辑模型）推导IC50[1]

D4476的细胞培养和使用。[1]
如前所述培养并裂解293细胞（Rena等人，2001）。H4IIE肝癌细胞与293细胞一样进行培养和裂解，不同的是使用15cm的培养皿并将其保存在含有1mg ml-1葡萄糖和5%胎牛血清的DMEM中。将CKI-7、IC261和D4476以100mM的浓度溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。当直接稀释到水性细胞培养基中时，D4476仅微溶（数据未显示）。为了提高溶解度，我们首先在21°C下将1μl 100 mM D4476稀释在6μl无血清培养基和3μl Fugene 6的混合物中，然后将该溶液逐滴加入培养的细胞中。细胞对D4476的反应不受化合物至少三次冻融循环的影响。在对照实验中，D4476被DMSO替代。

---

使用D4476进行药物治疗。[2]
为了抑制Csnk1a1，使用了小分子D4476。将D4476加入到在补充有10ng/ml mIL-3的培养基中的96孔板（每孔5000个细胞）中培养的白血病细胞中。通过向细胞培养物中加入2.5µM、5µM、10µM、20µM和40µM D4476进行D4476剂量滴定，最终DMSO百分比为0.4%。同样，将D4476加入到在补充了mTpo和mScf的SFEM培养基中培养的LSK细胞中。使用流式细胞术用CountBright绝对计数珠评估处理96小时后的细胞数量。

---

集落形成试验[2]
将U87和LN229细胞接种到6孔板中。每个孔有500个细胞，每组有三个重复孔。实验组用指定浓度（0、5和10μM）的D4476治疗，联合4 Gy的放疗。24小时后，用新鲜的无药物培养基进一步培养10-14天。然后，用PBS洗涤细胞，用甲醇固定，用0.1%结晶紫溶液染色。洗涤后，在显微镜下对细胞进行成像和计数。

---

细胞周期和凋亡分析[2]
U87和LN229细胞用特定浓度的D4476处理，shRNA细胞与放疗联合培养24小时。然后，在4°C下以1000 rpm离心5分钟，用70%冷甲醇固定过夜。用PBS洗涤两次后，用含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和25μg/mL核糖核酸酶（RNase）的染色溶液对细胞进行染色30分钟。使用流式细胞术和集成流式细胞仪软件分析细胞周期。 为了评估凋亡，收集处理过的细胞，用预冷的PBS洗涤两次，并重新悬浮在预冷的结合缓冲液中。接下来，将约5μL Annexin V-FITC和5μL PI加入细胞悬浮液中，在黑暗中冰上孵育10分钟。使用流式细胞术检测细胞凋亡。

---

HEK293细胞FOXO1a磷酸化Western blot检测：HEK293细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，含10% FBS的DMEM培养24小时。用转染试剂将1 μg FLAG-FOXO1a表达质粒转染至细胞，转染24小时后加入D4476（100-500 nM），继续孵育24小时。含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，BCA法测蛋白浓度。30 μg蛋白经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，一抗孵育磷酸化FOXO1a（Ser256）、FLAG标签（总FOXO1a）及β-肌动蛋白（内参），HRP标记二抗结合后ECL显色[1]
- HEK293细胞FOXO1a核定位免疫荧光实验：HEK293细胞（接种于24孔板盖玻片）转染FLAG-FOXO1a质粒后，用D4476（500 nM）处理24小时。4%多聚甲醛固定细胞，0.1% Triton X-100透化，5% BSA封闭，加入抗FLAG一抗（1:1000）和FITC标记二抗（1:2000）孵育，DAPI（1 μg/mL）染核。共聚焦显微镜采集荧光图像，定量核内FOXO1a阳性细胞比例（每组计数100个细胞）[1]
- FOXO响应性荧光素酶报告基因实验：HEK293细胞共转染0.5 μg FLAG-FOXO1a质粒、0.5 μg FOXO-荧光素酶报告质粒（含FOXO结合元件）及0.1 μg β-半乳糖苷酶质粒（内参）。24小时后加入D4476（50-500 nM），孵育24小时。报告基因裂解缓冲液裂解细胞，luminometer检测荧光素酶活性，比色法检测β-半乳糖苷酶活性以校正转染效率[1]

体内研究[3]
动物实验已获得徐州医科大学伦理委员会批准。本研究采用5～6周龄雄性BALB/c无胸腺裸鼠。使用小动物立体定位仪将GCS2细胞（每只小鼠5 × 10⁵个细胞）颅内注射到这些小鼠的右侧纹状体中。29 五天后，将携带肿瘤细胞的裸鼠随机分为四组（每组14只），包括对照组、D4476组（50 mg/kg，隔日腹腔注射）、放疗组（隔日2 Gy，总剂量10 Gy）和D4476+放疗组（D4476 50 mg/kg联合隔日2 Gy放疗）。每组随机选取7只小鼠，在治疗25天后处死。提取肿瘤组织进行H&E染色和mRNA提取。每组剩余的7只小鼠用于生存分析。

体外毒性：用D4476（100-1000 nM）处理HEK293细胞48小时，未观察到明显的细胞毒性——所有浓度下细胞存活率均保持在90%以上（台盼蓝染色）[1]

[1]. D4476, a cell-permeant inhibitor of CK1, suppresses the site-specific phosphorylation and nuclear exclusion of FOXO1a. EMBO Rep. 2004 Jan;5(1):60-5.

[2]. Csnk1a1 inhibition has p53-dependent therapeutic efficacy?in?acute myeloid leukemia. J Exp Med.?2014 Apr 7;211(4):605-12.

[3]. Csnk1a1 inhibition modulates the inflammatory secretome and enhances response to radiotherapy in glioma. J Cell Mol Med . 2021 Aug;25(15):7395-7406.

4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二恶英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺属于咪唑类化合物。

---

蛋白激酶CK1磷酸化保守序列pSer-Xaa-Xaa-Ser中相邻的丝氨酸残基。这种特异性在其靶蛋白中形成含有两个或多个相邻磷酸丝氨酸残基的区域，本文称之为多位点磷酸化结构域（MPD）。本文证明D4476是一种强效且选择性较高的CK1抑制剂，在体外和细胞内均有应用。在H4IIE肝癌细胞中，D4476特异性抑制内源性叉头框转录因子O1a（FOXO1a）MPD中Ser322和Ser325位点的磷酸化，而不影响其他位点的磷酸化。我们的研究结果表明，这些残基在体内是CK1的靶点，并且CK1介导的MPD磷酸化是IGF-1和胰岛素刺激下FOXO1a加速核外转位所必需的。D4476比IC261或CKI-7更有效、更特异，因此是目前用于鉴定CK1生理底物的最有用的CK1抑制剂。[1]尽管对急性髓系白血病（AML）的遗传学和生物学机制已有广泛的了解，但总体生存率仍然很低，亟需新的治疗方法。我们发现，丝氨酸/苏氨酸激酶酪蛋白激酶1α（Csnk1a1）对AML细胞在体内的存活至关重要。正常造血干细胞和祖细胞（HSPC）受shRNA介导的Csnk1a1敲低的影响相对较小。为了鉴定对白血病细胞至关重要的Csnk1a1下游介质，我们进行了体内混合shRNA筛选和基因表达谱分析。我们发现，Csnk1a1敲低导致Rps6磷酸化水平降低、p53活性增强以及髓系分化。与这些观察结果一致，p53缺失的白血病对Csnk1a1敲低不敏感。我们进一步评估了酪蛋白激酶1抑制剂D4476是否具有选择性抗白血病作用。用D4476处理白血病干细胞（LSC）显示，其对LSC的杀伤作用远高于对正常造血干细胞（HSPC）的杀伤作用。总之，这些研究结果表明，Csnk1a1抑制可降低Rps6磷酸化和p53活化，从而选择性地清除白血病细胞，揭示了Csnk1a1作为治疗急性髓系白血病（AML）的潜在靶点。[2]胶质母细胞瘤（GBM）是一种致命的脑肿瘤，目前尚无有效的靶向治疗方法，预后极差。目前，放射疗法是治疗胶质瘤的主要方法之一，但它会导致肿瘤微环境中炎症因子（尤其是IL-6和CXCL1）的显著增加，而这些因子在肿瘤产生放射耐药性和肿瘤发生过程中发挥着重要作用。酪蛋白激酶1α1（CK1α）（由位于5q染色体上的Csnk1a1基因编码）被认为是治疗Tp53野生型急性髓系白血病（AML）的一个有吸引力的靶点。本研究在体外和体内评估了Csnk1a1抑制对胶质母细胞瘤（GBM）细胞的抗肿瘤作用。我们发现，下调Csnk1a1或使用Csnk1a1抑制剂D4476抑制Csnk1a1均能有效降低Tp53野生型和Tp53突变型GBM细胞的增殖。相反，Csnk1a1的过表达促进了细胞增殖和克隆形成。抑制Csnk1a1可提高GBM细胞对放射治疗的敏感性。此外，下调Csnk1a1可减少促炎因子的产生和分泌。在临床前GBM模型中，D4476治疗显著抑制了放射治疗引起的促炎因子增加，提高了GBM细胞对放射治疗的敏感性，从而抑制了肿瘤生长并延长了动物的生存期。这些结果表明，靶向 Csnk1a1 可作为炎症因子的抑制剂发挥抗肿瘤作用，为治疗胶质瘤提供了一种新的策略。[3]

---

D4476 是一种细胞渗透性小分子 CK1 抑制剂，专门靶向 δ 和 ε 亚型。其核心作用机制是抑制CK1介导的FOXO1a（一种调控细胞周期和凋亡的转录因子）磷酸化，从而阻止FOXO1a核外移位并恢复其转录活性[1]。
- D4476被广泛用作研究CK1信号通路的工具，尤其是在研究CK1在调控FOXO家族蛋白亚细胞定位和功能中的作用方面[1]。
- 文献[2,3]分别侧重于Csnk1a1（另一种CK1亚型）在急性髓系白血病和胶质瘤中的作用，并未提及D4476或其生物学功能[2,3]。

C23H18N4O3

398.41

398.137

C, 69.34; H, 4.55; N, 14.06; O, 12.05

301836-43-1

6419753

White to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

675.0±55.0 °C at 760 mmHg

362.0±31.5 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.663

3.84

103.12

2

5

4

30

597

0

DPDZHVCKYBCJHW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H18N4O3/c24-22(28)14-4-6-15(7-5-14)23-26-20(21(27-23)17-3-1-2-10-25-17)16-8-9-18-19(13-16)30-12-11-29-18/h1-10,13H,11-12H2,(H2,24,28)(H,26,27)

4-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl]benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。