p110α (IC50 = 4 nM); p110α-H1047R (IC50 = 4.6 nM); p110α-E545K (IC50 = 5.7 nM); p110γ (IC50 = 5 nM); p110δ (IC50 = 7 nM); p110β (IC50 = 75 nM); mTOR (IC50 = 20.7 nM); mTORC1; mTORC2; Autophagy

激酶测定：PI3Kα、β 和 δ 蛋白由 p85 NH2 末端与全长蛋白 p110 蛋白融合的 iSH2 结构域组成，但 α 蛋白除外，它也不包含最后 20 个氨基酸。 PI3Kγ 是作为删除前 144 个氨基酸的全长蛋白质产生的。所有构建体均与 COOH 末端 His 标签融合，以便于纯化，然后克隆到 pBlue-Bac4.5（对于 α、β 和 δ 同工型）或 pVL1393（对于 γ 同工型）质粒中。然后使用供应商推荐的方法将不同的载体与 BaculoGold WT 基因组 DNA 共转染，以生产各自的重组杆状病毒和蛋白质。使用 Kinase-Glo 测定测试 BEZ235 的抗 PI3K 活性。激酶反应在 384 孔黑色板中进行。每孔加载 50 μL 测试项目（90% DMSO 中）和 5 μL 反应缓冲液，其中含有 10 μg/mL PI 底物（L-α-磷脂酰肌醇；Avanti 极性脂质；用 3% 辛基葡萄糖苷制备）和 PI3K然后向其中添加蛋白质（分别为 10、25、10 和 150 nM 的 p110α、p110β、p110δ 和 p110γ）。通过添加在反应缓冲液中制备的 5 μL 1 μM ATP 开始反应，并孵育 60 分钟（对于 p110α、p110β 和 p110δ）或 120 分钟（对于 p110γ）。通过添加 10 μL Kinase-Glo 缓冲液来终止。然后在 Synergy 2 读数器中读取板以进行发光检测。细胞测定：MOLT-4和CEM-R细胞；该化合物在 DMSO 中的溶解度<10 mM。获得较高浓度的一般提示：请将管在 37 °C 下加热 10 分钟和/或在超声波浴中摇动一段时间。储备液可在 -20°C 以下保存几个月； 500 nM，细胞周期抑制 200 nM，pRb 减少 16 小时。 BEZ235 显着降低 mTOR 激活激酶 p70S6K 的磷酸化水平。 BEZ235 导致 S235/S236P-RPS6 水平降低，IC50 为 6.5 nM。使用生化 mTOR K-LISA 测定法测定 BEZ235 针对 mTOR 的活性，IC50 为 20.7 nM。 BEZ235 对其 β 旁系同源物表现出略低的活性，IC50 为 75 nM。 PI3K/Akt/mTOR 通路在人类肿瘤细胞中通常被组成型激活。 BEZ235 通过与 PI3K 和 mTOR 激酶的 ATP 结合间隙结合来阻断这些酶的活性。当用浓度不断增加的 BEZ235 处理时，PTEN 缺失细胞系 PC3M 和 U87MG 均显示出剂量依赖性的细胞增殖减少，平均 GI50 为 10-12 nM。 BEZ235 是一种 mTORC1/2 催化抑制剂。

BEZ235 诱导肿瘤消退（69%），但对体重增加没有显着影响。总而言之，这些初步的体内功效结果表明，BEZ235 作为单一药物口服给药时会导致疾病停滞，并且在联合研究中使用时可以增强其他抗癌药物的功效。

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达考替尼（BEZ235，NVP-BEZ 235）是一种口服PI3K抑制剂，具有良好的耐受性抗肿瘤活性[1]
Dactolisib (BEZ235, NVP-BEZ 235）的药代动力学特性最初是在携带PC3M肿瘤的裸鼠体内进行评估的。在50 mg/kg的剂量下，Dactolisib (BEZ235, NVP-BEZ 235）在血浆中迅速出现，0.5小时的Cmax为1.68μmol/L，C24h为0.03μmol/L。在肿瘤组织中，1小时时达到的Cmax（Tmax）为2.05 nmol/g，24小时后降至0.23 nmol/g（图5A）Dactolisib（BEZ235，NVP-BEZ 235）从肝脏中相对较快地消除。对肿瘤组织中S473P-Akt水平的体内分析显示，给药后1小时达到最大抑制作用（对应于肿瘤Cmax），治疗后16小时仍观察到持续抑制作用，给药24小时后，四个肿瘤中的两个几乎完全恢复到基础水平（图5B）。基于这项研究的药代动力学模拟表明，当以50mg/kg的剂量每天给药或以25mg/kg的剂量每天两次给药时，3至5天内将达到稳态水平。剂量方案之间的差异在于预测的肿瘤峰值水平（分别为2.6和1.6 nmol/g），而贯穿水平几乎保持相当（分别为0.53和0.60μmol/L）。考虑到这种药代动力学模拟，以25mg/kg口服NVP-BEZ235的剂量对携带PC3M肿瘤的动物进行慢性治疗，每天两次。使用该时间表，观察到肿瘤生长受到统计学上的显著抑制，治疗10天后的最终T/C值为22%（图5C）。NVP-BEZ235对体重增加的非统计学显著影响（图5C）以及研究过程中没有动物死亡的事实表明，该治疗具有良好的耐受性。通过肿瘤提取物的蛋白质印迹或肿瘤切片的免疫染色检测到，抗肿瘤作用与最后一剂后1或18小时肿瘤组织中S473P-Akt的抑制密切相关（图5D）。这些时间点的化合物浓度在1小时时为1.32nmol/g，在18小时时为0.51nmol/g，接近稳态峰值水平的预测值（见上文）。

PI3Kα、β 和 δ 蛋白由 p85 NH2 末端与全长蛋白 p110 蛋白融合的 iSH2 结构域组成，但 α 除外，它也不包含最后 20 个氨基酸。 PI3Kγ 是作为删除前 144 个氨基酸的全长蛋白质产生的。所有构建体均与 COOH 末端 His 标签融合，以便于纯化，然后克隆到 pBlue-Bac4.5（对于 α、β 和 δ 同工型）或 pVL1393（对于 γ 同工型）质粒中。然后使用供应商推荐的方法将不同的载体与 BaculoGold WT 基因组 DNA 共转染，以生产各自的重组杆状病毒和蛋白质。使用 Kinase-Glo 测定测试 BEZ235 的抗 PI3K 活性。激酶反应在 384 孔黑色板中进行。每孔加载 50 μL 测试项目（90% DMSO 中）和 5 μL 反应缓冲液，其中含有 10 μg/mL PI 底物（L-α-磷脂酰肌醇；Avanti 极性脂质；用 3% 辛基葡萄糖苷制备）和 PI3K然后向其中添加蛋白质（分别为 10、25、10 和 150 nM 的 p110α、p110β、p110δ 和 p110γ）。通过添加在反应缓冲液中制备的 5 μL 1 μM ATP 开始反应，并孵育 60 分钟（对于 p110α、p110β 和 p110δ）或 120 分钟（对于 p110γ）。通过添加 10 μL Kinase-Glo 缓冲液来终止。然后在 Synergy 2 读数器中读取板以进行发光检测。

MOLT-4 和 CEM-R 细胞；该化合物在 DMSO 中的溶解度<10 mM。获得较高浓度的一般提示：请将管在 37 °C 下加热 10 分钟和/或在超声波浴中摇动一段时间。储备液可在 -20°C 以下保存几个月； 500 nM，细胞周期抑制 200 nM，pRb 减少 16 小时。 BEZ235 显着降低 mTOR 激活激酶 p70S6K 的磷酸化水平。 BEZ235 导致 S235/S236P-RPS6 水平降低，IC50 为 6.5 nM。使用生化 mTOR K-LISA 测定法测定 BEZ235 针对 mTOR 的活性，IC50 为 20.7 nM。 BEZ235 对其 β 旁系同源物表现出略低的活性，IC50 为 75 nM。 PI3K/Akt/mTOR 通路在人类肿瘤细胞中通常被组成型激活。 BEZ235 通过与 PI3K 和 mTOR 激酶的 ATP 结合间隙结合来阻断这些酶的活性。当用浓度不断增加的 BEZ235 处理时，PTEN 缺失细胞系 PC3M 和 U87MG 均显示出剂量依赖性的细胞增殖减少，平均 GI50 为 10-12 nM。 BEZ235 是一种 mTORC1/2 催化抑制剂。

Mice: The NVP-Dactolisib (BEZ235) powder is dissolved in NMP on sonication, and the remaining volume of polyethylene glycol 300 is added to a concentration of 5 mg/mL. The dosage is 10 mL/kg. For analysis, frozen tissues are minced, then homogenized in an equal volume of ice-cold PBS. After centrifugation, supernatants are then examined. The samples are then eluted over a 20-minute period at a flow rate of 1 mL/min with a linear gradient of 10% to 90% (v/v) acetonitrile in water containing 0.05% (v/v) trifluoroacetic acid. The compounds are identified by 340 nm UV absorbance, and peak heights from the external standard method are used to calculate concentrations[1].

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Establishment of Xenograft Tumors, Efficacy Studies, Compound Preparation, and Analytics [1]
Establishment of tumors, group randomization, tumor, and body weight recording during efficacy studies were described elsewhere. Antitumor activity is expressed as %T/C (mean increase of tumor volumes of treated animals divided by the mean increase of tumor volumes of control animals multiplied by 100) and/or as tumor regression (%Reg) calculated as [(mean tumor volume at the start of treatment - mean tumor volume) / (mean tumor volume at the start of treatment)] × 100. Data are presented as mean ± 1 SE. Comparisons between groups and vehicle control group were done using either one-way ANOVA or ANOVA on ranks followed by Dunnett's tests when data were respectively either normally distributed or not. For all tests, the level of significance was set at P < 0.05. Calculations were done using SigmaStat version 2.03. Dactolisib (BEZ235, NVP-BEZ 235) (free base) was formulated in NMP/polyethylene glycol 300 (10/90, v/v). Solutions (5 mg/mL) were prepared fresh each day of dosing as follows: the powder was dissolved in NMP on sonication, and the remaining volume of polyethylene glycol 300 was added. The application volume was 10 mL/kg. For analytics, frozen tissues were minced and then homogenized in an equal volume of ice-cold PBS using a Polytron homogenizer (IKA). After acetonitrile precipitation and centrifugation, supernatants were analyzed by reverse-phase high-performance liquid chromatography/UV on a Merck-Hitachi/LaChrom equipment including a Nucleosil 100-5 C18 column. Samples were then eluted with a linear gradient of 10% to 90% (v/v) acetonitrile in water containing 0.05% (v/v) trifluoroacetic acid over a period of 20 min at a flow rate of 1 mL/min. The compounds were detected by UV absorbance at 340 nm, and concentrations were determined by the external standard method using peak heights.

[1]. Identification and characterization of NVP-BEZ235, a new orally available dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor with potent in vivo antitumor activity. Mol Cancer Ther, 2008, 7(7), 1851-1863.

Dactolisib Tosylate is the tosylate salt form of dactolisib, an orally bioavailable imidazoquinoline targeting the phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) and the mammalian target of rapamycin (mTOR), with potential antineoplastic activity. Upon administration, dactolisib inhibits PI3K kinase and mTOR kinase in the PI3K/AKT/mTOR kinase signaling pathway, which may result in tumor cell apoptosis and growth inhibition in PI3K/mTOR-overexpressing tumor cells. Activation of the PI3K/mTOR pathway promotes cell growth, survival, and resistance to chemotherapy and radiotherapy. mTOR, a serine/threonine kinase downstream of PI3K, may also be activated independent of PI3K.

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The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt/mammalian target of rapamycin inhibitor (mTOR) pathway is often constitutively activated in human tumor cells, providing unique opportunities for anticancer therapeutic intervention. NVP-BEZ235 is an imidazo[4,5-c]quinoline derivative that inhibits PI3K and mTOR kinase activity by binding to the ATP-binding cleft of these enzymes. In cellular settings using human tumor cell lines, this molecule is able to effectively and specifically block the dysfunctional activation of the PI3K pathway, inducing G(1) arrest. The cellular activity of NVP-BEZ235 translates well in in vivo models of human cancer. Thus, the compound was well tolerated, displayed disease stasis when administered orally, and enhanced the efficacy of other anticancer agents when used in in vivo combination studies. Ex vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic analyses of tumor tissues showed a time-dependent correlation between compound concentration and PI3K/Akt pathway inhibition. Collectively, the preclinical data show that NVP-BEZ235 is a potent dual PI3K/mTOR modulator with favorable pharmaceutical properties. NVP-BEZ235 is currently in phase I clinical trials.[1]

C37H31N5O4S

641.75

641.21

C, 69.25; H, 4.87; N, 10.91; O, 9.97; S, 5.00

1028385-32-1

Dactolisib;915019-65-7; 1028385-32-1; 2319647-83-9 (HCl)

49803145

Off-white to light yellow solid powder

8.216

139.25

1

7

4

47

1080

0

CN(C1=C2C3=CC(C4=CC5=CC=CC=C5N=C4)=CC=C3N=C1)C(N2C6=CC=C(C=C6)C(C)(C#N)C)=O.CC7=CC=C(S(=O)(O)=O)C=C7

FWURTHAUPVXZHW-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H23N5O.C7H8O3S/c1-30(2,18-31)22-9-11-23(12-10-22)35-28-24-15-19(21-14-20-6-4-5-7-25(20)32-16-21)8-13-26(24)33-17-27(28)34(3)29(35)36;1-6-2-4-7(5-3-6)11(8,9)10/h4-17H,1-3H3;2-5H,1H3,(H,8,9,10)

4-methylbenzenesulfonic acid;2-methyl-2-[4-(3-methyl-2-oxo-8-quinolin-3-ylimidazo[4,5-c]quinolin-1-yl)phenyl]propanenitrile

Dactolisib tosylate; NVP-BEZ 235 Tosylate; NVP-BEZ235-ANA; BEZ235 Tosylate; BEZ235 Tosylate; BEZ235 (Tosylate); Dactolisib (Tosylate); NVP-BEZ235-ANA; Dactolisib tosilate; Dactolisib tosylate [USAN]; UNII-U54GT9151S

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 2 中的溶解度: NMP+polyethylene glycol 300 (10/90, v/v): 30mg/mL

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配方 3 中的溶解度: 16.67 mg/mL (25.98 mM) in 50% PEG300 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。