Defactinib analogue-1

FAK

KinomeScan[1]
DiscoverX进行激酶结合测定，评估对468种激酶的结合能力。以1μM的浓度筛选PROTAC-3和defactinib。

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激酶活性测定 激酶活性测定由Reaction Biology Corp.进行。化合物以10剂量IC50重复模式进行测试，从1μM开始连续稀释3倍。对照化合物星孢菌素以10剂量IC50模式进行测试，从20μM开始连续稀释4倍。反应在10μM ATP下进行。使用Prism 7.0计算IC50值。

蛋白质印迹[1]
如果没有另行说明，将细胞接种并生长至80%融合，用化合物或对照处理24小时。随后，取出生长培养基，通过加入裂解缓冲液（25 mM Tris，pH 7.4；1%NP-40，0.25%脱氧胆酸盐，1 mM钒酸钠，10 mM氟化钠，10 mmol焦磷酸钠，20 mMβ-甘油磷酸和1×完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物）裂解细胞。20分钟后，将混合物在4°C下以16000g的速度旋转10分钟，使不溶性物质沉淀。在加入含有5%β-Me的NuPAGE样品缓冲液并在95°C下煮沸10分钟之前，通过BCA测定上清液的蛋白质浓度。等量的蛋白质进行SDS-PAGE，随后电泳转移到硝化纤维膜上。

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细胞增殖试验[1]
将细胞接种在96孔板中（2000个细胞/孔），并按指示用PROTAC或对照处理。在所需的时间点，向培养基中补充330 mg/mL MTS和25 mM吩嗪甲磺酸酯，并在37°C下孵育。通过使用Wallac Victor2平板读数器在490 nm处测量培养基的吸光度来监测MTS向甲赞衍生物的线粒体还原。使用Prism 7.0进行数据分析和统计。

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反相蛋白阵列[1]
RPPA分析由MD Anderson癌症中心RPPA核心设施进行。MDA-MB-231细胞在完全生长培养基中生长。用胰蛋白酶化的PROTAC-3（500 nM）、Defactinib（1μM）或DMSO（0.1%）处理细胞24小时，并在化合物或DMSO存在下重新附着8小时，然后对细胞进行裂解，并根据MD Anderson提供的方案制备样品。

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伤口愈合试验[1]
MDA-MB-231细胞在37°C、5%CO2的完全生长培养基中维持。将细胞（1×106）分成12孔板。24小时后，使用无菌的10μL移液管尖端在每个孔上形成均匀的伤口，用温热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次，以去除任何漂浮或死亡的细胞。该时间点被视为0小时，细胞在含有PROTAC或对照的新鲜培养基中孵育24小时。在0小时和24小时后，使用连接到光学显微镜的相机捕获受伤区域的图像。通过ImageJ软件对图像进行分析，并对受伤区域进行量化。从0小时的伤口面积中减去24小时的剩余伤口面积。计算伤口愈合（迁移）百分比，并使用Prism 7.0以条形图的形式呈现数据。采用Welch t检验分析组间差异，P<0.05时认为差异显著。

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Transwell侵入试验[1]
第一天，通过在1×Travigen股份有限公司包衣缓冲液中稀释5×BME储备溶液，制备0.2×基底膜提取物（BME）工作溶液。简而言之，将100μL的10倍包衣缓冲液稀释在900μL的无菌水中，制成1倍包衣缓冲溶液。然后将960μL 1×涂层缓冲液与40μL 5×BME混合，制成0.2×BME工作溶液。将康宁Transwell可渗透插入物放置在24孔板上，向每个Transwell插入物中加入100μL 0.2×BME溶液并孵育16小时。第二天，将MDA-MB-231细胞胰蛋白酶化，并将细胞悬浮在无血清培养基中。将约100μL的细胞悬浮液（约3×105个细胞）加入到每个Transwell插入物中，然后再加入100μL含有PROTAC或对照的无血清RPMI培养基。下腔室填充有含10%FBS的RPMI培养基，整个装置在37°C和5%CO2下孵育24小时。24小时后，从下腔室和上腔中取出细胞培养基，用PBS洗涤Transwell插入物三次。使用棉签去除非侵入性细胞，在室温下用4%甲醛将Transwell插入物的膜底侧固定10分钟，然后用PBST（pH-7.4，50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1%Triton-X100）再渗透10分钟。插入物用PBS洗涤一次，在室温用0.2%（w/v）结晶紫溶液染色20分钟。然后用PBS广泛洗涤插入物，并用水洗涤一次，以去除所有多余的染料和盐。使用连接在光学显微镜上的相机捕获通过膜迁移的细胞。

[1]. Addressing Kinase-Independent Functions of Fak via PROTAC-Mediated Degradation. J Am Chem Soc. 2018 Dec 12;140(49):17019-17026.

Enzymatic inhibition has proven to be a successful modality for the development of many small-molecule drugs. In recent years, small-molecule-induced protein degradation has emerged as an orthogonal therapeutic strategy that has the potential to expand the druggable target space. Focal adhesion kinase (Fak) is a key player in tumor invasion and metastasis, acting simultaneously as a kinase and a scaffold for several signaling proteins. While previous efforts to modulate Fak activity were limited to kinase inhibitors with low success in clinical studies, protein degradation offers a possibility to simultaneously block Fak's kinase signaling and scaffolding capabilities. Here, we report the development of a selective and potent Fak degrader, PROTAC-3, which outperforms a clinical candidate, defactinib, with respect to Fak activation as well as Fak-mediated cell migration and invasion. These results underline the potential that PROTACs offer in expanding the druggable space and controlling protein functions that are not easily addressed by traditional small-molecule therapeutics. [1]

C20H20F3N5O3S

467.47

2296719-34-9

Solid powder

S(C)(N(C)C1C=CC=C(C=1)CNC1C(C(F)(F)F)=CN=C(NC2C=CC(=CC=2)O)N=1)(=O)=O

N-(3-(((2-((4-Hydroxyphenyl)amino)-5-(trifluoromethyl)pyrimidin-4-yl)amino)methyl)phenyl)-N-methylmethanesulfonamide; 2296719-34-9; Defactinib analogue-1; starbld0011445; SCHEMBL21634223; RNSJIMRLQPNKST-UHFFFAOYSA-N;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Note: Note: 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气下），避免暴露在潮湿环境中。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

May dissolve in DMSO (in most cases), if not, try other solvents such as H2O, Ethanol, or DMF with a minute amount of products to avoid loss of samples

注意: 如下所列的是一些常用的体内动物实验溶解配方，主要用于溶解难溶或不溶于水的产品（水溶度<1 mg/mL）。 建议您先取少量样品进行尝试，如该配方可行，再根据实验需求增加样品量。

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注射用配方1: DMSO : Tween 80： Saline = 10 : 5 : 85 (如： 100 μL DMSO → 50 μL Tween 80 → 850 μL Saline)
*生理盐水/Saline的制备：将0.9g氯化钠/NaCl溶解在100 mL ddH ₂ O中，得到澄清溶液。
注射用配方 2: DMSO : PEG300 ：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL DMSO → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)
注射用配方 3: DMSO : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL DMSO → 900 μL Corn oil)
示例: 以注射用配方 3 (DMSO : Corn oil = 10 : 90) 为例说明, 如果要配制 1 mL 2.5 mg/mL的工作液, 您可以取 100 μL 25 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液，加到 900 μL Corn oil/玉米油中, 混合均匀。

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注射用配方 4: DMSO : 20% SBE-β-CD in Saline = 10 : 90 [如：100 μL DMSO → 900 μL (20% SBE-β-CD in Saline)]
*20% SBE-β-CD in Saline的制备（4°C，储存1周）：将2g SBE-β-CD (磺丁基-β-环糊精) 溶解于10mL生理盐水中，得到澄清溶液。
注射用配方 5: 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin : Saline = 50 : 50 (如： 500 μL 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (羟丙基环胡精)→ 500 μL Saline)
注射用配方 6: DMSO : PEG300 : Castor oil : Saline = 5 : 10 : 20 : 65 (如： 50 μL DMSO → 100 μL PEG300 → 200 μL Castor oil → 650 μL Saline)
注射用配方 7: Ethanol : Cremophor : Saline = 10： 10 : 80 (如： 100 μL Ethanol → 100 μL Cremophor → 800 μL Saline)
注射用配方 8: 溶解于Cremophor/Ethanol (50 : 50), 然后用生理盐水稀释。
注射用配方 9: EtOH : Corn oil = 10 : 90 (如： 100 μL EtOH → 900 μL Corn oil)
注射用配方 10: EtOH : PEG300：Tween 80 : Saline = 10 : 40 : 5 : 45 (如： 100 μL EtOH → 400 μL PEG300 → 50 μL Tween 80 → 450 μL Saline)

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口服配方 1: 悬浮于0.5% CMC Na (羧甲基纤维素钠)
口服配方 2: 悬浮于0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
示例: 以口服配方 1 (悬浮于 0.5% CMC Na)为例说明, 如果要配制 100 mL 2.5 mg/mL 的工作液, 您可以先取0.5g CMC Na并将其溶解于100mL ddH2O中，得到0.5%CMC-Na澄清溶液；然后将250 mg待测化合物加到100 mL前述 0.5%CMC Na溶液中，得到悬浮液。

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口服配方 3: 溶解于 PEG400 (聚乙二醇400)
口服配方 4: 悬浮于0.2% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 5: 溶解于0.25% Tween 80 and 0.5% Carboxymethyl cellulose (羧甲基纤维素)
口服配方 6: 做成粉末与食物混合

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注意: 以上为较为常见方法，仅供参考， InvivoChem并未独立验证这些配方的准确性。具体溶剂的选择首先应参照文献已报道溶解方法、配方或剂型，对于某些尚未有文献报道溶解方法的化合物，需通过前期实验来确定（建议先取少量样品进行尝试），包括产品的溶解情况、梯度设置、动物的耐受性等。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。