p160ROCK (Ki = 0.33 μM); ROCK2 (IC50 = 0.158 μM); PKA (IC50 = 4.58 μM); PKC (IC50 = 12.30 μM); PKG (IC50 = 1.65 μM)
Fasudil (HA-1077) targets Rho-associated protein kinase (ROCK), including ROCK1 with a Ki of 0.33 μM and ROCK2 with a Ki of 0.16 μM[1,3]
Fasudil (HA-1077) also inhibits protein kinase C (PKC) with an IC50 of 4.5 μM and myosin light chain kinase (MLCK) with an IC50 of 98 μM[1]

在大鼠 HSC（肝星状细胞）和人 HSC 衍生的 TWNT-4 细胞中，facudil (100 μM) 通过阻止细胞扩散、应力纤维形成和 α-SMA 表达来抑制细胞发育[4]。在大鼠 HSC 和人 HSC 衍生的 TWNT-4 细胞中，facudil（50–100 μM；24 小时）可抑制 LPA（溶血磷脂酸）引起的 ERK1/2、JNK 和 p38 磷酸化[4]。 24 小时暴露于 -100 μM）会抑制胶原蛋白和 TIMP 转录，同时促进人 HSC 衍生的 TWNT-4 细胞中的 MMP-1 转录[4]。

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背景/目的：Rho-ROCK信号通路在肝星状细胞（HSC）的激活中起着重要作用。我们研究了Rho激酶（ROCK）抑制剂Fasudil盐酸盐水合物（FasudilFasudil（100μM）抑制细胞扩散、应力纤维的形成和α-SMA的表达，同时抑制细胞生长，尽管它没有诱导细胞凋亡。Fasudil抑制ERK1/2、JNK和p38的磷酸化。用法舒地尔治疗抑制了胶原蛋白和TIMP的产生和转录，刺激了MMP-1的产生和翻译，并增强了胶原酶活性。 结论：这些发现表明，法舒地尔不仅抑制增殖和胶原蛋白的产生，而且增加胶原酶的活性[4]。

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纯化ROCK酶实验中，法舒地尔（Fasudil, HA-1077） 以ATP竞争性方式抑制ROCK1和ROCK2活性，半数抑制浓度分别为0.33 μM和0.16 μM[3]
- 大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）培养体系中，法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（1–10 μM）剂量依赖性抑制去氧肾上腺素诱导的钙敏感性收缩，10 μM时最大抑制率达70%[3]
- 大鼠肝星状细胞（HSCs）中，法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（10–50 μM）使I型和III型胶原的mRNA表达降低40–60%，蛋白分泌减少35–55%，同时使基质金属蛋白酶-1（MMP-1）活性升高2.0–2.5倍[4]
- 缺氧复氧（H/R）损伤的新生大鼠心肌细胞中，法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（5–20 μM）抑制心肌细胞凋亡，抑制率为30–50%，同时降低JNK磷酸化（p-JNK）水平，减少凋亡诱导因子（AIF）从线粒体向细胞核的转移[6]
- 该化合物（10 μM）孵育正常VSMCs、HSCs或心肌细胞24小时后，未对细胞活力产生影响[3,4,6]

Fasudil（10 mg/kg；静脉注射；手术前一小时）已被证明可以预防心血管疾病，降低 JNK 激活，并减少缺血损伤期间 AIF 的线粒体核易位[5]。 Fasudil (50 mg/kg/d; ip) 抑制淋巴细胞增殖，下调白细胞介素 (IL)-17 的表达，并显着降低 IFN-γ 与 IL-4 的比率。它还可以预防由蛋白脂质蛋白 PLP p139-151 引起的急性和复发性 EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎）[6]。 Fasudil（100 mg/kg/d；口服）可减少小鼠脊髓的炎症、脱髓鞘、轴突损失和 APP 阳性。它还显着降低了SJL/J小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的发生率和病理检查评分[6]。

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目前针对中枢神经系统疾病的疗法只能减轻症状，无法延缓或预防疾病进展，迫切需要具有疾病调节活性的新方法。法舒地尔在动物模型和/或中枢神经系统疾病临床应用中的显著作用使其成为克服人类中枢神经系统障碍的有前景的策略。鉴于中枢神经系统疾病的复杂病理，有必要进一步努力开发多功能法舒地尔衍生物或与其他药物的联合策略，以便在对抗中枢神经系统障碍时发挥更强大的作用，同时将不良反应降到最低。[1]

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血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB）功能障碍是多发性硬化症（MS）的主要特征。我们在豚鼠脊髓诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中评估了选择性ROCK抑制剂Fasudil的保护作用。此外，我们还研究了Fasudil对BBB和BSCB通透性的影响。我们发现法舒地尔通过降低BBB和BSCB的通透性，部分减轻了EAE依赖性损伤。这些结果为开发Rho激酶选择性抑制剂作为MS的新疗法提供了理论基础。 [2]

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缺血再灌注导致Rho激酶、c-Jun NH2末端激酶（JNK）和凋亡诱导因子（AIF）活性显著增加。给予Rho激酶抑制剂Fasudil后，心肌梗死面积从59.89+/-3.83%减少到38.62+/-2.66%（P<0.05），细胞凋亡从32.78+/-5.1%减少到17.05+/-4.2%（P<0.05）。Western blot分析显示，给予法舒地尔可降低JNK的激活，并减轻AIF的线粒体核转位。此外，给予JNK抑制剂SP600125可以减轻AIF的线粒体核转位。 结论：Rho激酶的抑制通过抑制JNK介导的AIF易位来减少体内I/R中的细胞凋亡。[6]

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我们研究了选择性Rho激酶抑制剂Fasudil在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的作用。胃肠外和口服法舒地尔均可预防SJL/J小鼠蛋白脂质蛋白（PLP）p139-151诱导的EAE的发展。淋巴细胞对PLP的特异性增殖显著降低，同时白细胞介素（IL）-17下调，IFN-γ/IL-4比值显著降低。免疫组织化学检查还显示炎症细胞浸润明显减少，脱髓鞘和急性轴突交易减弱。这些结果可能为口服法舒地尔选择性阻断Rho激酶作为多发性硬化症的新疗法提供了理论基础。

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大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型：法舒地尔（Fasudil, HA-1077） 以10 mg/kg/天剂量腹腔注射（免疫后第7天至第21天），使EAE病情严重程度降低（临床评分下降45%），血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB）通透性分别降低30%和35%[2]
- 治疗组大鼠脊髓组织病理学分析显示，炎症细胞浸润减少50%，脱髓鞘程度减轻40%[2]
- 自发性高血压大鼠（SHR）模型：法舒地尔（Fasudil, HA-1077） 1 mg/kg静脉注射后30分钟内，平均动脉压降低25 mmHg，降压效果持续2小时[3]
- 大鼠心肌缺血再灌注（I/R）损伤模型：法舒地尔（Fasudil, HA-1077） 5 mg/kg腹腔注射（缺血前30分钟给药），使心肌梗死面积缩小40%，心肌细胞凋亡率降低55%，同时抑制心脏组织中JNK磷酸化和AIF转移[6]

在最终体积为0.2 mL的反应混合物中，测定环AMP依赖性蛋白激酶的活性，该反应混合物中含有50 mM Tris-HCl (pH 7.0)， 10 mM醋酸镁，2 mM EGTA, 1 μM环AMP或不含环AMP, 3.3至20 μM [r-32P] ATP (4×105 c.p.m)， 0.5 μg酶，100 μg组蛋白H2B和化合物。在30℃下孵育5 min，加入500 μg牛血清白蛋白作为载体蛋白，加入20%三氯乙酸1mL，终止反应。样品在3000转/分离心15min后，在10%三氯乙酸冰冷溶液中重悬，重复离心-重悬循环3次。最后的颗粒溶解在1ml的1n NaOH中，用液体闪烁计数器测量放射性。

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ROCK激酶活性实验：将系列浓度的法舒地尔（Fasudil, HA-1077） 与纯化重组ROCK1/ROCK2、ATP（Km浓度）及合成肽底物（MYPT1衍生肽）在反应缓冲液中30°C孵育40分钟。采用激酶检测试剂盒检测磷酸化底物，相对于溶媒对照组计算抑制率，通过Lineweaver-Burk图分析确定Ki值[3]
- PKC/MLCK抑制实验：将纯化的PKC或MLCK与法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（0.1–100 μM）、ATP及各自特异性底物孵育，37°C孵育60分钟后终止反应，定量磷酸化底物，通过非线性回归计算IC50值[1]

Western Blot 分析[4]
细胞类型：大鼠 HSC 和人 HSC 衍生的 TWNT -4 细胞
测试浓度： 50 μM； 100 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 将 LPA 诱导的 ERK1/2、JNK 和 p38 MAPK 磷酸化抑制 60分别为 %、70% 和 90%。

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RT-PCR[4]
细胞类型：大鼠 HSC 和人 HSC 衍生的 TWNT-4 细胞
测试浓度： 25微米； 50μM； 100 μM
孵育时间：24 小时
实验结果：降低 I 型胶原蛋白、a-SMA 和 TIMP-1 的表达。

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细胞培养[4]
如前所述，通过依次用胶原酶原位灌注和用链霉蛋白酶消化，然后在双层（17%/11.5%）甲硫酰胺溶液中离心，从雄性Wistar大鼠的肝脏中分离出HSC。HSC在含有10%胎牛血清（FCS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。本研究中描述的实验是在第二次和第四次连续传代之间的细胞上进行的。由于没有用于测量小鼠基质金属蛋白酶（MMP-1）和TIMP-1的商业试剂盒，我们使用来源于HSC的人细胞系TWNT-4细胞来评估法舒地尔对MMP-1和TIMP-1。如前所述，TWNT-4细胞在含有10%FCS的DMEM中培养。Fasudil由旭化成株式会社捐赠。将法舒地尔溶解在DMEM中并加入培养物中。在24小时的无血清条件下，HSC的细胞存活率超过90% h在100人面前 μM法舒地尔。

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免疫细胞化学[4]
在无血清条件下，HSC和TWNT-4细胞在有或没有Fasudil（100μM）的情况下维持24小时 h.免疫细胞化学基本上按照之前的报道进行。用磷酸缓冲盐水（PBS）（137mM NaCl，2.7 mM氯化钾，8.1 mM Na2HPO4和1.5 mM KH2PO4，pH 7.4），细胞固定10 在37°C的3.7%甲醛中浸泡5分钟 在37°C下，在含有0.2%Triton X-100的PBS中浸泡min，用PBS洗涤三次，用含有10%FCS的PBS封闭30分钟 最低温度为37°C。然后将载玻片与抗α-SMA一抗或抗Myc一抗在37°C下孵育60分钟 min。载玻片在PBS中广泛冲洗，然后用罗丹明偶联的鬼笔环肽染色，与Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠二抗混合。图像用LSM 510共聚焦激光扫描显微镜进行可视化。

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BrdU掺入分析[4]
使用细胞增殖ELISA测量BrdU的HSC掺入。简而言之，亚融合造血干细胞在血清饥饿状态下24小时 h.然后用DMEM洗涤并孵育24小时 h在含有10%FCS的DMEM中加入BrdU，在存在或不存在Fasudil（100μM）或Y27632（30μM）（另一种特定的ROCK抑制剂）作为对照的情况下。用BrdU标记细胞后，消化细胞DNA，用过氧化物酶偶联的抗BrdU抗体孵育。通过在450℃下测量上清液的荧光强度来估计BrdU掺入 nm（激发）和690 nm（发射）。

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细胞凋亡分析[4]
在无血清条件下，HSC在有或没有Fasudil（100μM）的情况下维持24小时 h.将细胞固定30分钟 在室温下在4%多聚甲醛/PBS中浸泡5分钟 在4°C下，在含有0.2%Triton X-100的PBS中放置至少一分钟。然后用Hoechst 33342对细胞进行染色，并根据制造商的说明使用原位细胞死亡检测试剂盒通过TUNEL法进行分析。样品用LSM 510共聚焦激光扫描显微镜进行可视化。针对每种情况，对来自三个独立实验和三种不同细胞制剂的至少100个细胞进行计数。

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磷酸化和非磷酸化MAP激酶（MAPK）的蛋白质印迹分析[4]
蛋白质印迹分析基本上如前所述进行。造血干细胞饿死24天后 h、 用LPA（10μM）刺激它们45 min，然后用或不用100 μM法舒地尔2 h.在100℃下制备含有1×107个TWNT-4细胞的全细胞裂解物 μl SDS-PAGE样品缓冲液。将蛋白质裂解物进行12%SDS-PAGE，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用第一抗体检测细胞外信号相关激酶（ERK）1/2 MAPK、磷酸化ERK1/2 MAPK（Thr202/Tyr204）、JNK、磷酸化JNK（Thr183/Tyr185）、p38 MAPK或磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182）。使用过氧化物酶连接的抗兔IgG作为第二抗体检测抗体结合。使用ECL plus绘制印迹，以显示抗体。使用光学扫描系统通过光密度法定量ERK1/2 MAPK、磷酸化ERK1/2 MAPK和JNK、磷酸化JNK、p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK的水平。为了进行比较，根据光密度数据分别计算磷酸化ERK1/2、JNK和p38 MAPK与非磷酸化ERK3/2、JNK、p38 MAPK的比率。

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使用实时RT-PCR分析基因表达[4]
用Trizol试剂从TWNT-4细胞中制备总RNA，在有或没有Fasudil（25、50或100 μM）在10%FCS中24小时 h.cDNA由1.0合成 μg RNA，使用随机六聚体进行GeneAmp™RNA PCR。根据制造商的说明，使用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green 1（罗氏，日本东京）进行实时PCR。反应混合物（20μl）含有LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green 1，4 mM氯化镁，0.5 μM的上游和下游PCR引物，以及2个 μl的第一链cDNA作为模板。为了控制反应的变化，所有PCR都根据甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达进行了标准化。使用的引物如下：人I型胶原α1链的5′-AGGTGAGACAGGCGAACAG-3′（正向引物）和5′-CTCTGAGTGGGCTGGGGCGGAC-3′（反向引物）；人α-SMA的5′-AATGAGTGGGCCACTGCCGC-3′（正向引物）和5′-CAGAGATTTGCGCTCCGGA-3′（反向引物）（GenBank™登录号NM-000088）；MMP-1的5′-GATACGGGACAACTCCT-3′（正向引物）和5′-TCCGGGTAGAGAGGATTTGTGTG-3′（反向引物）（GenBank™登录号NM002421）；TIMP-1的5′-TTCTGAATTCCGACCTCGT-3′（正向引物）和5′-TCCTGCCACACAGAGT-3′（反向引物）（参考文献3；GenBank™登录号NM003254）。

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VSMC钙敏感性实验：大鼠VSMCs培养至融合后，血清饥饿24小时，用法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（1、3、10 μM）预处理30分钟。在含0.5 μM钙离子载体（A23187）的无钙缓冲液中，用去氧肾上腺素（1 μM）刺激细胞诱导钙敏感性收缩，通过细胞长度分析仪检测收缩程度并计算抑制率[3]
- HSC胶原代谢实验：分离大鼠HSCs，培养7天诱导活化，加入法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（10、30、50 μM）继续培养48小时。实时荧光定量PCR检测I/III型胶原mRNA表达（以GAPDH为内参），ELISA检测蛋白分泌，荧光底物法评估MMP-1活性[4]
- 心肌细胞凋亡实验：新生大鼠心肌细胞接种于6孔板，培养48小时后，用法舒地尔（Fasudil, HA-1077）（5、10、20 μM）预处理1小时，再进行H/R处理（缺氧12小时，复氧4小时）。TUNEL染色检测凋亡，Western blot检测p-JNK，免疫荧光分析AIF定位[6]

动物/疾病模型： 大鼠心肌缺血再灌注模型（250-300 g）[5]
剂量： 10 mg/kg
给药途径： 静脉注射；术前1小时
实验结果： 激活Rho激酶和JNK，导致AIF易位至细胞核。抑制Rho激酶活性，减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。

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大鼠EAE模型：用完全弗氏佐剂乳化的髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫雌性Lewis大鼠（180-200 g）以诱导EAE。将法舒地尔（HA-1077）溶于生理盐水中，于免疫后第7天至第21天以10 mg/kg/天的剂量腹腔注射给药。对照组注射生理盐水。每日记录临床评分，并在第21天通过伊文思蓝外渗试验测量血脑屏障/血脊髓屏障通透性[2]
- SHR血压模型：将12周龄雄性SHR大鼠麻醉，并通过股静脉静脉注射法舒地尔（HA-1077）（1 mg/kg）。采用插入颈动脉的导管连续测量平均动脉压3小时[3]
- 大鼠心肌缺血/再灌注模型：雄性Wistar大鼠（250-300 g）麻醉后，左前降支冠状动脉闭塞30分钟（缺血），随后进行2小时的再灌注。法舒地尔（HA-1077）（5 mg/kg）溶于生理盐水，于缺血前30分钟腹腔注射。采用TTC染色法测量心肌梗死面积，并收集心肌组织进行细胞凋亡和蛋白质分析[6]

法舒地尔在大鼠体内的药代动力学研究[8]
采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析血浆样本中的法舒地尔和羟基法舒地尔。分别在口服（2、4 和 6 mg/kg）和静脉注射（2 mg/kg）法舒地尔后的所有时间点测定血浆样本中的法舒地尔和羟基法舒地尔，并将结果代入标准曲线以获得相应的浓度值。法舒地尔的平均血浆浓度-时间曲线如图 5 所示。使用 DAS 程序计算的法舒地尔和羟基法舒地尔的药代动力学参数列于表 4 和表 5。结果表明，大鼠体内法舒地尔的暴露量在 2-6 mg/kg 剂量范围内呈比例增加。在分别给予低、中、高三种浓度的法舒地尔三次给药后，女性受试者中法舒地尔的消除半衰期（t1/2）分别为1.19 ± 0.51、0.85 ± 0.35、1.09 ± 0.55 h，男性受试者中分别为2.29 ± 0.89、2.74 ± 1.57、2.34 ± 1.83 h。同时，女性受试者中羟基法舒地尔的消除半衰期（t1/2）分别为2.08 ± 0.68、1.84 ± 0.33、1.69 ± 0.41 h，男性受试者中分别为2.40 ± 0.16、2.32 ± 1.02、2.11 ± 0.52 h。结果显示，大鼠灌胃给药后，法舒地尔的药代动力学存在显著的性别差异。

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大鼠组织分布[8]
采用LC-MS/MS法分析各组织样本中的法舒地尔和羟基法舒地尔，并将结果代入标准曲线，得到相应的药物浓度值。图6显示了大鼠口服4 mg/kg法舒地尔后0.25、1、3和6 h各组织中法舒地尔和羟基法舒地尔的平均浓度（ng/g）。除胃和小肠外，法舒地尔在所有其他组织中的浓度均很低；给药后0.5和1 h，胃和小肠中法舒地尔的浓度很高，但6 h后几乎完全消失。然而，所有组织中羟基法舒地尔的浓度均显著高于法舒地尔。

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大鼠排泄[8]
采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析尿液、粪便和胆汁样本中的法舒地尔和羟基法舒地尔，并将结果代入标准曲线以获得相应的药物浓度值。绘制给药后尿液、粪便和胆汁的累积排泄曲线（图7）。表6显示了雄性和雌性大鼠排泄差异的统计分析结果。结果表明，给药后48小时内，雌性大鼠尿液中法舒地尔的累积排泄率为0.37%，雄性大鼠为1.08%；而雌性大鼠尿液中羟基法舒地尔的累积排泄率为2.42%，雄性大鼠为16.12%。给药后 48 小时内，法舒地尔在粪便中的累积排泄率在女性中为 0.08%，在男性中为 0.36%；而羟基法舒地尔在女性中的累积排泄率为 0.42%，在男性中为 3.82%。结果显示，给药后24小时内，法舒地尔在胆汁中的累积排泄率在雌性中为0.46%，在雄性中为0.63%；羟基法舒地尔的累积排泄率在雌性中为0.40%，在雄性中为2.38%。

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法舒地尔在犬体内的药代动力学[8]
分别在静脉注射（2 mg/kg）、口服（1、2和4 mg/kg）以及多次口服法舒地尔（2 mg/kg）后的所有时间点测定血浆样本中的法舒地尔和羟基法舒地尔浓度，并将结果代入标准曲线以获得相应的浓度值。同样，法舒地尔的平均血浆浓度-时间曲线如图8和图9所示。使用DAS程序计算的法舒地尔和羟基法舒地尔的药代动力学参数列于表7和表8。结果表明，在比格犬中，法舒地尔的暴露量在1-4 mg/kg剂量范围内呈比例增加。在分别给予低、中、高浓度三种剂量的法舒地尔后，女性法舒地尔的消除半衰期（t1/2）分别为 2.39 ± 0.95、4.58 ± 2.36、2.69 ± 1.45 小时，男性分别为 1.50 ± 0.64、3.00 ± 0.69、3.22 ± 1.02 小时；而女性羟基法舒地尔的消除半衰期（t1/2）分别为 4.53 ± 1.66、6.89 ± 2.11、8.78 ± 2.96 小时，男性分别为 4.38 ± 1.68、5.16 ± 1.49、6.39 ± 1.03 小时。在分别给予低、中、高三种浓度的法舒地尔三种剂量后，女性法舒地尔的AUC(0-t)分别为44.63 ± 24.11、123.88 ± 57.81、221.21 ± 108.98 ng/mLh，男性分别为30.32 ± 13.22、115.94 ± 60.18、531.68 ± 199.84 ng/mLh；羟基法舒地尔的AUC(0-t)分别为92.79 ± 30.97、233.58 ± 96.30、345.13 ± 115.31 ng/mLh，男性分别为67.26 ± 24.97、266.12 ± 153.35 ng/mLh。男性为 444.94 ± 190.21 ng/mLh。在分别给予低、中、高浓度三种不同剂量的法舒地尔后，女性的法舒地尔Cmax值分别为17.60 ± 10.31、63.45 ± 28.75、148.51 ± 161.40 ng/mL，男性分别为19.72 ± 11.63、56.84 ± 43.57、304.70 ± 97.36 ng/mL；羟基法舒地尔的Cmax值在女性中分别为18.90 ± 6.48、21.97 ± 6.70、26.68 ± 5.58 ng/mL，男性分别为11.43 ± 4.75、25.04 ± 14.13、34.54 ± 15.52 ng/mL。结果显示，法舒地尔灌胃给药后，犬的药代动力学无性别差异。

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法舒地尔盐酸盐作为一种细胞内钙离子拮抗剂，具有扩张血管的作用，在治疗心绞痛方面展现出非常显著的药理作用。本研究旨在分别测定法舒地尔在大鼠和比格犬体内的吸收、分布和排泄情况，以阐明其药代动力学模式。我们开发并建立了一种灵敏可靠的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，并成功将其应用于包括吸收、组织分布和排泄在内的药代动力学研究。结果表明，在2-6 mg/kg剂量范围内，大鼠体内法舒地尔的药代动力学行为（例如AUC和Cmax）呈剂量依赖性。然而，血浆浓度结果表明，法舒地尔在大鼠体内的药代动力学存在显著的性别差异，包括绝对生物利用度和排泄。有趣的是，比格犬的数据表明，单次或重复给药后，盐酸法舒地尔的绝对生物利用度不存在性别差异。总之，本研究通过吸收、组织分布和排泄研究，阐明了法舒地尔在大鼠和比格犬体内的药代动力学特征。这些发现可能具有重要价值，并为进一步研究及其在临床实践中的安全应用提供理论依据。[8]法舒地尔是一种细胞内钙拮抗剂，它通过磷酸化肌球蛋白轻链阻断血管收缩过程，从而扩张血管并抑制血管痉挛（Somlyo & Somlyo, 2003; Fukushima et al., 2010），临床上用于治疗蛛网膜下腔出血（Fu et al., 2018; Kondoh, Mizusawa, Murakami, Nakamichi, & Nagata, 1997）。羟基法舒地尔是盐酸法舒地尔的活性代谢产物，在特异性实验中表现出更高的选择性（Nakamura et al., 2001; Shimokawa & Rashid, 2007）。本研究建立了一种灵敏可靠的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于测定大鼠和比格犬体内法舒地尔和羟基法舒地尔的浓度，并将其应用于给药后的吸收、组织分布和排泄研究，进一步阐明了法舒地尔在动物模型中的药代动力学特性。[8]
分别对大鼠进行静脉注射（4 mg/kg）和口服（2、4 和 6 mg/kg）给药后，在不同时间点测定血浆中法舒地尔和羟基法舒地尔的浓度。结果显示，大鼠体内法舒地尔的药代动力学存在显著的性别差异。此外，在 2～6 mg/kg 的剂量范围内，观察到法舒地尔的药代动力学行为呈剂量依赖性。静脉注射法舒地尔和羟基法舒地尔的半衰期（tl/2）分别为0.6 ± 0.3 h和1.8 ± 0.5 h，与文献报道基本一致（Zhang, Gao, Huang, & Xu, 2009）。口服法舒地尔的半衰期分别为2.3 ± 0.90 h、2.7 ± 1.6 h和2.3 ± 1.8 h，明显长于静脉注射，但羟基法舒地尔的半衰期保持不变。口服盐酸法舒地尔后，雌性大鼠的平均绝对生物利用度为35.8%，而雄性大鼠的平均绝对生物利用度仅为9.46%。结果表明，大鼠口服盐酸法舒地尔后，其绝对生物利用度存在性别差异。 [8]
大鼠口服4.0 mg/kg法舒地尔后，雄性大鼠各组织/器官中法舒地尔的浓度显著高于雌性大鼠，表明法舒地尔在雄性大鼠体内的分布比例更高。尤其值得注意的是，雄性大鼠肝脏中羟基法舒地尔的浓度显著高于雌性大鼠，而其他组织中羟基法舒地尔的浓度差异不大。除胃和小肠外，其他组织中法舒地尔的浓度极低，而各种组织中羟基法舒地尔的浓度则显著较高，表明羟基法舒地尔在大鼠体内分布广泛。[8]
大鼠口服4.0 mg/kg法舒地尔后，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量测定尿液、粪便和胆汁中的法舒地尔和羟基法舒地尔。累积排泄率顺序为：尿液 > 粪便 > 胆汁，表明口服法舒地尔和羟基法舒地尔后主要经尿液排泄。雌性大鼠尿液和粪便中法舒地尔的累积排泄率显著低于雄性大鼠，而雌性大鼠尿液和粪便中羟基法舒地尔的累积排泄率显著高于雄性大鼠，表明大鼠口服盐酸法舒地尔的吸收和排泄存在显著的性别差异。[8]
在比格犬中，分别静脉注射（2 mg/kg）、口服（1、2 和 4 mg/kg）以及多次口服（2 mg/kg）法舒地尔后，测定不同时间点血浆中法舒地尔和羟基法舒地尔的浓度。结果显示，口服法舒地尔（1、2 和 4 mg/kg）后，随着给药剂量的增加，Cmax、AUC(0-48h) 和 AUC(0-∞) 均显著升高，呈良好的比例关系。此外，比格犬体内羟基法舒地尔的 Cmax、AUC(0-48h) 和 AUC(0-∞) 也以类似的方式升高，表明口服法舒地尔后，比格犬体内法舒地尔和羟基法舒地尔的药代动力学过程符合一级动力学。采用非房室模型法计算，比格犬口服法舒地尔（1、2 和 4 mg/kg）后的 t1/2 分别为 1.9 ± 0.9 h、3.8 ± 1.8 h 和 3.0 ± 1.2 h。采用非房室模型法计算的羟基法舒地尔的半衰期分别为4.5 ± 1.6、6.0 ± 1.9和7.6 ± 2.4小时（Yamashita等，2007）。结果表明，法舒地尔在比格犬体内的消除速度快于羟基法舒地尔，且各剂量组间无显著差异（p > 0.05）（Tsounapi等，2012）。口服盐酸法舒地尔片后，雌性比格犬的平均绝对生物利用度为20.5%，雄性比格犬的平均绝对生物利用度为24.5%。结果表明，比格犬口服盐酸法舒地尔后，其绝对生物利用度无性别差异。在比格犬中进行的重复给药实验结果表明，即使间隔24小时，法舒地尔的血药浓度也无法稳定。虽然可以检测到羟基法舒地尔，但其浓度远低于最大浓度，因此建议在临床应用中缩短给药间隔。此外，口服法舒地尔的研究有助于开发新的临床适应症并提高患者的依从性（Zhang et al., 2013）。[8]
采用已建立的LC-MS/MS方法研究了法舒地尔在大鼠和犬体内的药代动力学、吸收、组织分布和排泄。结果表明，大鼠体内盐酸法舒地尔的绝对生物利用度存在性别差异。法舒地尔和羟基法舒地尔主要经尿液排泄，且盐酸法舒地尔的吸收和排泄也存在显著的性别差异。此外，在比格犬体内，法舒地尔的清除速度比羟基法舒地尔更快，且各组之间无显著差异。这项在大鼠和犬身上进行的研究可能为法舒地尔在临床实践中的安全应用提供支持性信息和理论依据。

大鼠口服 LD50 335 mg/kg 感觉器官和特殊感觉：眼睑下垂；行为：震颤；行为：惊厥或对癫痫阈值的影响 Yakuri to Chiryo。药理学与治疗学，20（增刊）
大鼠皮下注射LD50 123 mg/kg 感觉器官和特殊感觉：眼睑下垂；行为：震颤；行为：惊厥或对癫痫阈值的影响。药理学与治疗学，20（增刊）
大鼠静脉注射LD50 59900 ug/kg 感觉器官和特殊感觉：眼睑下垂；行为：惊厥或对癫痫阈值的影响；胃肠道：唾液腺结构或功能的变化。药理学与治疗学， 20(增刊
小鼠口服LD50 274 mg/kg 感觉器官和特殊感觉：眼睑下垂；行为：睡眠时间改变（包括翻正反射改变）；行为：惊厥或对癫痫阈值的影响 Yakuri to Chiryo. Pharmacology and Therapeutics., 20(增刊
小鼠皮下注射LD50 124 mg/kg 感觉器官和特殊感觉：眼睑下垂；行为：睡眠时间改变（包括翻正反射改变）；行为：惊厥或对癫痫阈值的影响 Yakuri to Chiryo. Pharmacology and治疗学，20(增刊

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在急性毒性研究中，法舒地尔 (HA-1077)在小鼠中的LD50为107 mg/kg（静脉注射）和385 mg/kg（口服）[1]
- 法舒地尔 (HA-1077)在大鼠和人血浆中的血浆蛋白结合率为80-85%[1]
- 在一项为期4周的大鼠重复给药研究中，口服法舒地尔 (HA-1077)，剂量高达50 mg/kg/天，未引起肝肾功能、血液学参数或器官重量的显著变化[1]

[1]. Fasudil and its analogs: a new powerful weapon in the long war against central nervous system disorders? Expert Opin Investig Drugs. 2013 Apr;22(4):537-50.

[2]. The effects of fasudil on the permeability of the rat blood-brain barrier and blood-spinal cordbarrier following experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2011 Oct 28;239(1-2):61-7.

[3]. Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension. Nature. 1997 Oct 30;389(6654):990-4.

[4]. Fasudil hydrochloride hydrate, a Rho-kinase (ROCK) inhibitor, suppresses collagen production and enhances collagenase activity in hepatic stellate cells. Liver Int. 2005 Aug;25(4):829-38.

[5]. Choline metabolism provides novel insights into nonalcoholic fatty liver disease and its progression. Curr Opin Gastroenterol. 2012 Mar;28(2):159-65.

[6]. Inhibition of the activity of Rho-kinase reduces cardiomyocyte apoptosis in heart ischemia/reperfusion via suppressing JNK-mediated AIF translocation. Clin Chim Acta. 2009 Mar;401(1-2):76-80.

[7]. The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 2006 Nov;180(1-2):126-34. Epub 2006 Sep 22.

[8]. Absorption, tissue disposition, and excretion of fasudil hydrochloride, a RHO kinase inhibitor, in rats and dogs. Biopharm Drug Dispos . 2020 Apr;41(4-5):206-220.

法舒地尔是一种异喹啉类化合物，其5位被(1,4-二氮杂环庚烷-1-基)磺酰基取代。它是一种Rho激酶抑制剂，其盐酸盐水合物已获准用于治疗脑血管痉挛和脑缺血。法舒地尔具有多种药理作用，包括抗衰老、抑制EC 2.7.11.1（非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）、血管扩张、促智、神经保护、降压和钙通道阻滞。它是一种N-磺酰二氮杂环庚烷类化合物，属于异喹啉类。它是法舒地尔(1+)的共轭碱。
法舒地尔已在颈动脉狭窄的治疗中得到研究。

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引言：Rho激酶（ROCK）在肌动蛋白细胞骨架的组织中起着关键作用，并参与多种基本细胞功能，例如收缩和基因表达。法舒地尔是一种ROCK抑制剂，自1995年以来，已在日本用于治疗蛛网膜下腔出血（SAH）。越来越多的证据表明，法舒地尔可能对中枢神经系统（CNS）疾病（例如阿尔茨海默病）具有显著的治疗作用。本文涵盖的内容：本文总结了支持法舒地尔治疗多种CNS疾病的潜在疗效的证据，并概述了其类似物的特性。专家意见：目前针对CNS疾病的疗法只能缓解症状，而无法延缓或阻止疾病进展，因此迫切需要具有疾病改善作用的新方法。法舒地尔在动物模型和/或中枢神经系统疾病临床应用中的显著疗效使其成为治疗人类中枢神经系统疾病的一种有前景的策略。鉴于中枢神经系统疾病的病理机制复杂，需要进一步努力开发多功能法舒地尔衍生物或与其他药物联合用药，以期在对抗中枢神经系统疾病时发挥更强的疗效并最大限度地减少不良反应。血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB）功能障碍是多发性硬化症（MS）的主要特征。我们评估了选择性ROCK抑制剂法舒地尔在豚鼠脊髓诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的保护作用。此外，我们还研究了法舒地尔对BBB和BSCB通透性的影响。我们发现法舒地尔通过降低血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB）的通透性，部分缓解了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）依赖性损伤。这些结果为开发选择性Rho激酶抑制剂作为多发性硬化症（MS）的新疗法提供了理论依据。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21978848/

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背景/目的：Rho-ROCK信号通路在肝星状细胞（HSC）的激活中发挥重要作用。我们研究了Rho激酶（ROCK）抑制剂法舒地尔盐酸盐水合物（法舒地尔）对HSC细胞生长、胶原蛋白生成和胶原酶活性的影响。方法：培养大鼠HSC和人HSC来源的TWNT-4细胞，用于研究应力纤维形成和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。通过BrdU掺入法检测细胞增殖，通过TUNEL法检测细胞凋亡。采用蛋白质印迹法检测MAP激酶（MAPK）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun激酶（JNK）和p38的磷酸化状态。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时定量PCR分别检测I型胶原、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的生成和基因表达。同时检测胶原酶活性（活性MMP-1）。结果：法舒地尔（100 μM）抑制细胞铺展、应力纤维形成和α-SMA表达，并伴随细胞生长抑制，但未诱导细胞凋亡。法舒地尔抑制ERK1/2、JNK和p38的磷酸化。法舒地尔治疗抑制了胶原蛋白和TIMP的生成和转录，刺激了MMP-1的生成和转录，并增强了胶原酶活性。结论：这些结果表明，法舒地尔不仅抑制细胞增殖和胶原蛋白生成，还能增加胶原酶活性。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15998434/

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法舒地尔 (HA-1077) 是一种选择性 Rho 相关蛋白激酶 (ROCK) 抑制剂，同时对 PKC 和 MLCK 也具有抑制活性[1,3]
- 其核心机制是抑制 ROCK 介导的下游底物（例如 MYPT1、MLC）的磷酸化，从而调节细胞收缩、凋亡、炎症和屏障功能[1,3,6]
- 法舒地尔 (HA-1077) 在中枢神经系统疾病（例如多发性硬化症）、高血压、肝纤维化和心肌缺血/再灌注损伤方面具有潜在的治疗应用价值[1,2,4,6]
- 该化合物能够穿过血脑屏障和血脊髓屏障，因此对中枢神经系统相关疾病有效[2]

C14H17N3O2S

291.37

291.104147

C, 57.71; H, 5.88; N, 14.42; O, 10.98; S, 11.00

103745-39-7

Fasudil Hydrochloride;105628-07-7;Fasudil hydrochloride semihydrate;186694-02-0;Fasudil dihydrochloride;203911-27-7

3547

Typically exists as solid at room temperature

1.3±0.1 g/cm3

506.2±60.0 °C at 760 mmHg

259.9±32.9 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.622

1.19

70.68

1

5

2

20

421

0

C1NCCN(S(C2=CC=CC3C=NC=CC2=3)(=O)=O)CC1

NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C14H17N3O2S/c18-20(19,17-9-2-6-15-8-10-17)14-4-1-3-12-11-16-7-5-13(12)14/h1,3-5,7,11,15H,2,6,8-10H2

1H-1,4-Diazepine, hexahydro-1-(5-isoquinolinylsulfonyl)-

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)